專利名稱：一種提高免疫層析檢測(cè)靈敏性及特異性的方法
一種提高免疫層析檢測(cè)靈敏性及特異性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高疫層析法靈敏性及特異性的方法。
背景技術(shù)：
免疫層析(immunochromatography，ICA)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)檢測(cè)，包括多種病原微生物。免疫層析技術(shù)以其簡(jiǎn)便快速，特異性強(qiáng)、敏感性高，肉眼判斷，試驗(yàn)結(jié)果易保存，無(wú)需特殊儀器設(shè)備和試劑等優(yōu)點(diǎn)，這些特點(diǎn)都是其他免疫學(xué)方法所無(wú)法比擬的。但現(xiàn)有免疫層析技術(shù)在實(shí)際研究及應(yīng)用過(guò)程中存在靈敏性差的問(wèn)題，容易導(dǎo)致假陰性的發(fā)生。 另外，由于樣品中存在有各種各樣的物質(zhì)，容易干擾免疫層析檢測(cè)，導(dǎo)致假陽(yáng)性發(fā)生。

發(fā)明內(nèi)容為了解決現(xiàn)有免疫層析技術(shù)存在的靈敏性及特異性差的問(wèn)題，本發(fā)明提出了一種技術(shù)方案以提高該方法的檢測(cè)靈敏性及特異性在進(jìn)行檢測(cè)前，首先對(duì)樣品中的目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行富集，然后再對(duì)富集所得產(chǎn)物進(jìn)行免疫層析檢測(cè)。如上所述的技術(shù)方案，其特征是在進(jìn)行免疫層析檢測(cè)前，對(duì)樣品中的目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行選擇性富集或者濃縮以提高待檢樣品中目標(biāo)物質(zhì)的濃度，從而減小假陰性及假陽(yáng)性的產(chǎn)生。如上所述的技術(shù)方案，其特征是所提供的選擇性富集方法是采用納米免疫磁珠將目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行富集。如上所述的納米免疫磁珠，其特征是粒徑在20nm-60nm之間的顆粒；如上所述的納米免疫磁珠，其特征是具有超順磁性的顆粒。如上所述的納米免疫磁珠，其材料為納米純鐵或納米碳包純鐵微球；如上所述的納米免疫磁珠，其特征是磁珠表面包裹有一層或多層有機(jī)或無(wú)機(jī)材料，氧化硅、葡聚糖、聚苯乙烯、納米金等。如上所述的納米免疫磁珠，其特征是可以是具有超順磁性的顆粒，還可以是具有超順磁性和熒光的復(fù)合顆粒。如上所述的納米免疫磁珠，其特征是磁珠表面具有能將樣品中目標(biāo)物質(zhì)特異性結(jié)合的抗體、抗原、受體、半抗原、生物素、親和素等分子。如上所述的技術(shù)方案，其特征是納米免疫磁珠對(duì)樣品中的目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行富集后， 再將磁珠與目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行解離后進(jìn)行免疫層析檢測(cè)，也可不進(jìn)行解離直接進(jìn)行免疫層析檢測(cè)。如上所述的技術(shù)方案，其特征是免疫層析檢測(cè)可以以磁珠作為標(biāo)記物，還可以是納米金、納米硒、納米銀、彩色乳膠、熒光物質(zhì)等。如上所述的免疫層析檢測(cè)，其特征是其免疫層析檢測(cè)試紙條由背襯、樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸收墊等部件組成，還可以由背襯、樣品墊、硝酸纖維素膜、吸收墊等部件組成。如上所述的技術(shù)方案，其特征是納米免疫磁珠捕獲目標(biāo)物質(zhì)，在磁場(chǎng)作用力下將磁珠與樣品分離，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物質(zhì)的快速分離。如上所述的技術(shù)方案，其特征是可以對(duì)富集后的濃縮物進(jìn)行洗滌，再進(jìn)行免疫層析檢測(cè)；還可以不進(jìn)行洗滌，直接進(jìn)行免疫層析檢測(cè)。本發(fā)明的靈敏性比傳統(tǒng)的免疫層析的靈敏性高1-2個(gè)數(shù)量級(jí)，經(jīng)過(guò)選擇性富集的樣本，更適于用于免疫層析檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠，操作簡(jiǎn)便快捷。
具體實(shí)施方式本實(shí)例以檢測(cè)E. coli 0157:H7為例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明。盡管本發(fā)明的內(nèi)容是結(jié)合本實(shí)例進(jìn)行說(shuō)明，但是不能認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明專利的限制，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書限定。另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在所附權(quán)利要求書限定的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)或修飾，這些改動(dòng)或修飾形式同樣屬本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例IE. coli 0157:H7免疫磁珠制備E. coli 0157:H7免疫磁珠制備參照已經(jīng)建立的方法進(jìn)行(Kong et al. ,2010), 反相微乳法制備磁性微球，在連接抗Ε. coli 0157:H7多克隆抗體(Abcam，美國(guó))后，制備 E. coli 0157:H7納米免疫磁球，加入儲(chǔ)存液4°C保存。并用透射電子顯微鏡(TEM)和光鏡進(jìn)行形貌的定性檢測(cè)。實(shí)施例2膠體金的制備按照Frens方法(Frens et al.，1973)，檸檬酸三鈉還原法制備納米金溶膠。將 IOOmL 0.01% (W/V)的HAuCl4溶液加熱至沸騰，高速攪拌條件下快速加入1 % (W/V)檸檬酸三鈉5mL，繼續(xù)加熱攪拌30min，自然冷卻，0. 22 μ m濾膜過(guò)濾，4°C避光保存?zhèn)溆谩?shí)施例3免疫膠體金的制備調(diào)節(jié)膠體金至pH 8.0，逐滴加入E. coli 0157:H7單克隆抗體溶液，攪拌2_;3min， 10% BSA 封閉。40C 1500r/min 離心 20min，棄沉淀，上清于 4°C 10000r/min 離心 30min，沉淀以TBS(0. 005mol/L ρΗ7· 6，含0· BSA,0. 05%疊氮鈉)重新懸浮，4°C保存?zhèn)溆?。?shí)施例4E. coli 0157:H7膠體金免疫層析試紙條的制備1)結(jié)合墊的制備將標(biāo)記好的金標(biāo)抗體吸附在玻璃纖維膜上放置37°C烘干半小時(shí)，2)檢測(cè)線和質(zhì)控線制備E. coli 0157:H7多克隆抗體(Abcam，USA)和兔抗鼠 IgG(Tingguo，China)以0. 01mol/L ρΗ7· 6的PBS分別稀釋，分別包被于檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)， 作為檢測(cè)線和質(zhì)控線，室溫干燥，備用。3)E. coli 0157:H7膠體金免疫層析試紙條的組裝在塑料底板上分別將已固定有抗E. coli 0157:H7多克隆抗體和兔抗鼠IgG 二抗的硝酸纖維素膜、吸收墊、金標(biāo)墊及樣品墊依次裝配、切條，即為E. coli 0157:H7膠體金免疫層析試紙條。實(shí)施例5納米免疫磁珠富集E. coli 0157:H7取ImL菌懸液于EP管中，再加入一定量的Ε. coli 0157:H7納米免疫磁珠，輕搖混勻后，室溫孵育lOmin，磁性分離，棄上清，反復(fù)洗兩次，所得濃集物即為捕獲有E. coli 0157:H7。將捕獲有菌Ε. coli 0157:H7的納米免疫磁珠用0. ImLPBS重懸，用60°C水浴溫育15min解離連接，磁分離架分離免疫磁珠，上清即為富集的E. coli 0157:H7。實(shí)施例6納米免疫磁珠與膠體金試紙條檢測(cè)Ε. coli 0157:Η7將富集后的樣本120°C滅活15min，添加于E. coli 0157:H7免疫層析試紙條的樣品墊上，IOmin后觀察檢測(cè)結(jié)果。對(duì)150份模擬食品樣本(135例為陽(yáng)性樣本，15例為陰性樣本)進(jìn)行檢測(cè) (Tablel)，可得膠體金試紙條檢測(cè)的靈敏度為四.6%，特異性為93. 3%。膠體金試紙條結(jié)合納米免疫磁性分離測(cè)得的靈敏度為95. 5%，特異性為100%。Table 1. The comparison of sentitivity and specificty about two methods examine E. coli 0157:H權(quán)利要求
1.為了解決現(xiàn)有免疫層析技術(shù)存在的靈敏性及特異性差的問(wèn)題，本發(fā)明提出了一種技術(shù)方案以提高該技術(shù)的檢測(cè)靈敏性及特異性在進(jìn)行檢測(cè)前，首先對(duì)樣品中的目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行富集，然后再對(duì)富集所得產(chǎn)物進(jìn)行免疫層析檢測(cè)。
2.如權(quán)利1所述的技術(shù)方案，其特征是在進(jìn)行免疫層析檢測(cè)前，對(duì)樣品中的目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行選擇性富集或者濃縮以提高待檢樣品中目標(biāo)物質(zhì)的濃度，從而減小假陰性及假陽(yáng)性的產(chǎn)生。
3.如權(quán)利1所述的技術(shù)方案，其特征是所提供的選擇性富集方法是采用納米免疫磁珠將目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行富集。
4.如權(quán)利3所述的納米免疫磁珠，其特征是粒徑在20nm-100nm之間的微球。
5.如權(quán)利3所述的免納米疫磁珠，其特征是具有超順磁性的顆粒。
6.如權(quán)利3所述的免納米疫磁珠，其材料為納米純鐵或納米碳包純鐵微球。
7.如權(quán)利3所述的納米免疫磁珠，其特征是磁珠表面包裹有一層或多層有機(jī)或無(wú)機(jī)材料，如氧化硅、葡聚糖、聚苯乙烯、納米金等。
8.如權(quán)利3所述的納米免疫磁珠，其特征是可以是具有超順磁性的顆粒，還可以是具有超順磁性和熒光的復(fù)合顆粒。
9.如權(quán)利3所述的納米免疫磁珠，其特征是磁珠表面具有能將樣品中目標(biāo)物質(zhì)特異性結(jié)合的抗體、抗原、受體、半抗原、生物素、親和素等分子。
10.如權(quán)利1所述的技術(shù)方案，其特征是納米免疫磁珠對(duì)樣品中的目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行富集后，再將免疫磁珠與目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行解離后進(jìn)行免疫層析檢測(cè)，也可不進(jìn)行解離直接進(jìn)行免疫層析檢測(cè)。
11.如權(quán)利1所述的技術(shù)方案，其特征是免疫層析檢測(cè)可以以磁珠作為標(biāo)記物，還可以是納米金、納米硒、納米銀、彩色乳膠、熒光物質(zhì)、熒光顆粒等。
12.如權(quán)利1所述的免疫層析檢測(cè)，其特征是其免疫層析檢測(cè)試紙條由背襯、樣品墊、 結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸收墊等部件組成，還可以由背襯、樣品墊、硝酸纖維素膜、吸收墊等部件組成。
13.如權(quán)利1所述的技術(shù)方案，其特征是納米免疫磁珠捕獲目標(biāo)物質(zhì)，在磁場(chǎng)作用力下將磁珠與樣品分離，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物質(zhì)的快速分離。
14.如權(quán)利1所述的技術(shù)方案，其特征是可以對(duì)富集后的濃縮物進(jìn)行洗滌，再進(jìn)行免疫層析檢測(cè)；還可以不進(jìn)行洗滌，直接進(jìn)行免疫層析檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種提高免疫層析檢測(cè)靈敏性及特異性的方法在進(jìn)行免疫層析檢測(cè)之前，先對(duì)樣品中的目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行特異性富集，然后再將富集后的產(chǎn)物進(jìn)行免疫層析檢測(cè)。該方法簡(jiǎn)便易行，且可以有效提高免疫層析檢測(cè)的靈敏性及特異性。
文檔編號(hào)G01N33/558GK102520164SQ20111043364
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月21日
發(fā)明者周漢新, 李富榮, 齊暉 申請(qǐng)人:深圳市老年醫(yī)學(xué)研究所