專利名稱：移植腎排斥反應(yīng)早期診斷及預(yù)警試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種早期診斷試劑盒和一種預(yù)警試劑盒，具體講，涉及一種移植腎排斥反應(yīng)早期診斷及預(yù)警試劑盒及檢測(cè)方法，還涉及一些在移植腎急性排斥反應(yīng)或移植腎排斥反應(yīng)預(yù)警中的應(yīng)用的蛋白質(zhì)。
背景技術(shù)：
全球因慢性腎功能衰竭而行透析的人數(shù)已由1990年的42. 6萬(wàn)人增加至2000年的106. 5萬(wàn)人，預(yù)計(jì)到2010年將達(dá)到200余萬(wàn)人。這一人數(shù)的增長(zhǎng)，致使全球透析費(fèi)用迅速增長(zhǎng)，對(duì)發(fā)達(dá)國(guó)家、發(fā)展中國(guó)家均造成了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。我國(guó)約有100萬(wàn)尿毒癥患者，每年新增12萬(wàn)人，每年約有50萬(wàn)患者需要腎移植。目前我國(guó)已累計(jì)開(kāi)展各種器官移植近10 萬(wàn)例，成為世界第二器官移植大國(guó)，其中最多的是腎臟移植，累計(jì)達(dá)8萬(wàn)多例。移植受者和移植物有功能長(zhǎng)期存活是器官移植追求的最終目標(biāo)。隨著手術(shù)技術(shù)的進(jìn)步、組織配型技術(shù)的提高和免疫抑制劑的發(fā)展，腎移植術(shù)后I年存活率已大大提高，但長(zhǎng)期預(yù)后仍有待改善。 急性排斥反應(yīng)的反復(fù)發(fā)作和慢性排斥反應(yīng)是引起移植物失功的主要原因，長(zhǎng)期服用免疫抑制劑所帶來(lái)的毒副作用，如腎毒性、感染、誘發(fā)腫瘤等，亦影響移植物及受者的長(zhǎng)期存活。
反復(fù)發(fā)作的急性排斥反應(yīng)與慢性排斥反應(yīng)是引起移植物失功的重要原因，但臨床上缺乏有效的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)與無(wú)創(chuàng)診斷手段。移植腎穿刺活檢是目前最可靠的診斷方法，但具有創(chuàng)傷性，可引起感染、出血、甚至移植物丟失等，不易被患者接受且不利于動(dòng)態(tài)觀察。并且活檢取材也有一定的局限性，根據(jù)Banff標(biāo)準(zhǔn)，許多臨床懷疑移植腎排斥的患者在病理形態(tài)上可能并不能符合排斥的診斷標(biāo)準(zhǔn)。
因此，迫切需要探索適合我國(guó)人群的、可靠的、可滿足動(dòng)態(tài)觀察需要的移植腎排斥反應(yīng)無(wú)創(chuàng)性診斷方法。該課題的完成將在很大程度上輔助延長(zhǎng)患者移植后生存期，提高生存質(zhì)量，減少國(guó)家醫(yī)療投入，節(jié)省家庭開(kāi)支，具有極大的臨床應(yīng)用價(jià)值和社會(huì)、經(jīng)濟(jì)效益，并有助于我國(guó)移植界具有國(guó)際領(lǐng)先水平的自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)成果的產(chǎn)出。
移植腎排斥反應(yīng)的無(wú)創(chuàng)診斷技術(shù)的研究現(xiàn)狀自20世紀(jì)80年代起，移植學(xué)界已開(kāi)始動(dòng)態(tài)觀察移植受者各種血清中多種細(xì)胞因子水平及變化，探索移植排斥反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制及其診斷方法。例如IL-6、可溶型IL-6受體(IL-6R)可溶性CD30 (sCD30)、肝細(xì)胞再生因子(hepatocyte growth factor, HGF)、IL-18、轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子-3 (Transforming Growth Factor Beta, TGF- ^ )、IL-17、顆粒酶 B、穿孔素、FasL、粒溶素、CD154、I COS、CTLA4、PD-I 等分子與移植腎排斥反應(yīng)相關(guān)。中國(guó)人民解放軍第三〇九醫(yī)院器官移植中心在1994年對(duì)37例腎移植受者和55名正常人血清IL-6水平的動(dòng)態(tài)測(cè)定，結(jié)果表明，移植腎急性排異患者血清IL-6水平明顯升高，而慢性排異患者IL-6水平無(wú)顯著變化，提示血清IL-6水平監(jiān)測(cè)是移植腎排斥反應(yīng)的重要診斷指標(biāo)之一；隨后，又分別對(duì)血清免疫細(xì)胞抑制性受體 (leukocyte-associated Ig-Iike receptor-1, LAIR-1)，可溶型 LA IR-2 分子，HLA-G,血小板/T 細(xì)胞活化抗原 I (platelet and T cell activation antigen 1，PTA1,CD226)和同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中特異性表達(dá)的P140等與移植腎排斥反應(yīng)的相關(guān)性進(jìn)行了研究和報(bào)道。然而，盡管眾多科研工作者致力于篩選移植排斥特異性的生物標(biāo)記，但至今尚未篩選出特異性分子應(yīng)用于排斥反應(yīng)的無(wú)創(chuàng)性診斷和鑒別診斷。目前國(guó)際上仍缺乏移植腎排斥反應(yīng)的無(wú)創(chuàng)診斷和預(yù)警體系。
移植排斥反應(yīng)是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，細(xì)胞免疫和體液免疫機(jī)制均參與這個(gè)過(guò)程，而且，移植物的差異，手術(shù)的影響，移植受者個(gè)體的差異以及臨床上不同免疫抑制方案的應(yīng)用等眾多因素的參與使移植排斥反應(yīng)的診斷更加復(fù)雜和困難。另外，既往研究表明，通過(guò)檢測(cè)單個(gè)分子來(lái)明確診斷移植排斥反應(yīng)有很大的難度。早期卵巢上皮癌的血清診斷體系的成功建立，為移植排斥反應(yīng)的無(wú)創(chuàng)診斷提供了新的研究思路。2005年，耶魯大學(xué)的Gil 等通過(guò)對(duì)已知蛋白標(biāo)記的篩選，成功建立了由Leptin,泌乳刺激素(prolactin),骨橋蛋白 (osteopontin, 0PN)和胰島素樣生長(zhǎng)因子II (IGF-II)組成的早期卵巢上皮癌的血清診斷體系，將診斷敏感度、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(positive predictive value, PPV)和陰性預(yù)測(cè)值(negtive predictive value, NPV)分別提高至 95%、95*%、95*%和 94%。因此，在鑒定移植排斥特異性標(biāo)志物的同時(shí)，對(duì)已知的移植排斥相關(guān)的生物標(biāo)記進(jìn)行篩選和組合，通過(guò)多分子綜合分析，建立排斥反應(yīng)的聯(lián)合標(biāo)志物群診斷和預(yù)警體系，具有更強(qiáng)的可行性和更高的敏感度。
Luminex技術(shù)是一種多功能的液相芯片分析平臺(tái)。它整和了有色微球 (color-codedmicrosphere or bead)、激光技術(shù)、應(yīng)用流體學(xué)、高速數(shù)字信號(hào)處理器和計(jì)算機(jī)運(yùn)算法則，具有極高的檢測(cè)特異性和靈敏度。微球的顏色是通過(guò)兩種熒光染料染色得到的，調(diào)節(jié)兩種熒光染料的比例可以獲得100種不同顏色的微球，每種顏色的微球可以攜帶一種生物探針。探針通過(guò)羧基結(jié)合到微球表面，因此一個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)可以完成100種不同的生物學(xué)反應(yīng)。Luminex技術(shù)通過(guò)鑒定微球的顏色來(lái)確定反應(yīng)類型，而對(duì)反應(yīng)的定量分析是通過(guò)靶物質(zhì)上的報(bào)告分子完成的。它具備多參數(shù)高通量分析、節(jié)約試劑和標(biāo)本、操作簡(jiǎn)單等多種優(yōu)勢(shì)。采用Luminex液態(tài)芯片系統(tǒng)定量檢測(cè)候選分子，只需30ul樣本即可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)指標(biāo)，在4小時(shí)內(nèi)可以完成分析，靈敏度可以達(dá)到3pg/ml。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要發(fā)明目的在于提供一種移植腎排斥反應(yīng)早期診斷試劑盒；
本發(fā)明的第二發(fā)明目的在于提供一種移植腎排斥反應(yīng)預(yù)警試劑盒；
本發(fā)明的第三發(fā)明目的在于提供以上試劑盒的使用方法；
本發(fā)明的第四發(fā)明目的在于提供蛋白SCF、sRAGE、CXCL7NAP2、CCL14 a-HCCU sCD40L、GCSF、GR0、IL-IRa、MCP3、IL-20、MIPlcU IL-28A、IL-29IFN 入 I 在移植腎急性排斥反應(yīng)或移植腎排斥反應(yīng)預(yù)警中的應(yīng)用。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第一個(gè)發(fā)明目的，采用的技術(shù)方案為
本發(fā)明涉及一種移植腎排斥反應(yīng)早期診斷試劑盒，所述試劑盒包括檢測(cè)移植腎排斥反應(yīng)的蛋白的抗體，所述抗體選自抗EGF,抗Eotaxin,抗FGF-2,抗Flt_31igand,抗 Fractalkine，抗 G-CSF,抗 GM-CSF,抗 GR0,抗 IFN- a 2，抗 IFN- y，抗 IL-10，抗 IL-12 (p40)， 抗 IL-12 (p70)，抗 IL-13，抗 IL-15，抗 IL-17，抗 IL-lra，抗 IL-1 a，抗 IL-1 ^，抗 IL-2，抗 IL-3，抗 IL-4，抗 IL-5，抗 IL-6，抗 IL-7，抗 IL-8，抗 IL-9，抗 IP-10，抗 MCP-1，抗 MCP-3， 抗 MDC (CCL22)，抗 MIP-I a，抗 MIP-I ^，抗 PDGF-AA,抗 PDGF-AB/BB,抗 RANTES,抗 TGF- a，抗 TNF- a，抗 TNF- ^，抗 VEGF,抗 sCD40L,抗 sIL_2R a，抗 6Ckine，抗 BCA-1,抗 CTACK,抗 ENA-78,抗 Eotaxin-2,抗 Eotaxin-3,抗 1-309，抗 IL-16，抗 IL-20，抗 IL-21，抗 IL-23，抗 IL-28a，抗 IL-33，抗 HF,抗 MCP-2，抗 MCP-4，抗 MIP-Id,抗 SCF，抗 SDF-IA+ P，抗 TARC,抗 TP0,抗 TRAIL,抗 TSLP，抗 GCP2,抗 HCC-1，抗 I-TAC,抗 IL-11，抗 IL-29，抗 Lymphotactin, 抗 M-CSF，抗 MIG,抗 MIP-3 a，抗 MIP-3 ^，抗 NAP2,抗 sCD30 (sTNFRSF8)，抗 sEGFR,抗 sIL-lRI(sCD121a),抗 sIL-lRII(sCD121b)，抗 sIL_2Ra (SCD25)，抗 sIL_4R(sCD124)， 抗 sIL-6R(sCD126)，抗 sRAGE，抗 sTNFRI(sTNFRSFlA)，抗 sTNFRII(sTNFRSF IB)，抗 sVEGFRl(sFlt-1),抗 sVEGFR2(sFlk-1)，抗 sVEGFR3(sFlt-4)，抗 sgp 130，抗 MIF，抗 PAI-I (Total),抗sFas,抗sFasL,抗sICAM-1或抗sVCAM-1抗體中的至少一種，優(yōu)選至少兩種抗體，更優(yōu)選至少3種抗體，再優(yōu)選至少4種抗體，最優(yōu)選至少5種抗體。
本發(fā)明該技術(shù)方案的第一優(yōu)選技術(shù)方案為所述試劑盒包括檢測(cè)移植腎排斥反應(yīng)的蛋白的抗體，所述抗體選自抗SCF，抗sEGFR，抗sIL-2Ra，抗SRAGE，抗sTNFRI，抗 STNFR2，抗 SVEGFR2，抗 sVCAMl，抗 sFas，抗 CCL14 a -HCCl，抗 sCD40L，抗 Eotaxin,抗 FGF2, 抗 Flt31igand,抗 Fracktalkine,抗 GC SF,抗 GR0,抗 IFN y，抗 IL-IR a，抗 IL-3,抗 IL-4, 抗 IL-6，抗 IL-12p70，抗 IL-13，抗 IP10，抗 MIPl a，抗 VEGF，抗 BCA-1，抗 IL-16，抗 MIPId， 抗IL-20，抗IL-28A，抗CXCL9MIG，抗0中的至少一種抗體，優(yōu)選至少兩種抗體，更優(yōu)選至少3種,再優(yōu)選至少4種,最優(yōu)選至少5種。
本發(fā)明該技術(shù)方案的第三優(yōu)選技術(shù)方案為所述試劑盒還含有
(1)96孔濾膜板和兩張封板膜；
(2)所述試劑盒中蛋白抗體的標(biāo)準(zhǔn)品；
(3)質(zhì)控對(duì)照；
(4)血清基質(zhì)；
(5)實(shí)驗(yàn)液；
(6)洗液；
(7) streptavidin-phycoerythrin (藻紅蛋白_鏈霉親合素)標(biāo)記抗體；
(8)珠子稀釋液；
(9)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)移植腎排斥反應(yīng)的蛋白的抗體；
(10)預(yù)包被抗體的珠子。
本發(fā)明該技術(shù)方案的第四優(yōu)選技術(shù)方案為所述試劑盒中
(I)所述96孔濾膜板和兩張封板膜購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)MX-PLATE ；
(2)所述標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自 Millipore 公司，貨號(hào)MXH8060，MXH8062，MXH8063，LHSP-8063 和 HSCR-8032 ；
(3)所述質(zhì)控對(duì)照購(gòu)自 Mi 11 ipore 公司，貨號(hào)為MXH6060，MXH6062，MXH6063， LHSP-6063 和 HSCR-6032 ；
(4)所述血清基質(zhì)購(gòu)自 Millipore 公司，貨號(hào)為MXHSM，LHSP-SM, HSCR-SM ；
(5)所述實(shí)驗(yàn)液購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)L-AB ;
(6)所述洗液購(gòu)自Mi 11 ipore公司，貨號(hào)L-WB ；
(7)所述 streptavidin-phycoerythrin 標(biāo)記抗體購(gòu)自 Millipore 公司，貨號(hào) L-SAPE9, L-SAPE3, L-SAPE10, L-SAPElI, L-SAPE6 ；
(8)所述珠子稀釋液購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)LBD ；
(9)檢測(cè)抗體購(gòu)自 Millipore 公司，貨號(hào) MXH1060，MXH1062，MXH1063，LHSP-1063， HSCR-1032 ；
(10)所述預(yù)包被抗體的珠子購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)MXHPMX39，MXHP2PMX23, HSP, HASP-PAII, MXH3PMX9, HSCRPMX14。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第二發(fā)明目的，采用的技術(shù)方案為一種移植腎排斥反應(yīng)預(yù)警試劑盒，所述試劑盒包括檢測(cè)移植腎排斥反應(yīng)的蛋白的抗體，所述抗體選自抗EGF， 抗 Eotaxin,抗 FGF-2,抗 Flt_31igand,抗 Fractalkine,抗 G-CSF,抗 GM-CSF,抗 GR0, 抗 IFN-a 2，抗 IFNi，抗 IL-10，抗 IL_12(p40)，抗 IL_12(p70)，抗 IL-13，抗 IL-15， 抗 IL-17，抗 IL-lra，抗 IL-1 a，抗 IL-1 ^，抗 IL-2，抗 IL-3，抗 IL-4，抗 IL-5，抗 IL-6， 抗 IL-I,抗 IL-8，抗 IL-9，抗 IP-IO，抗 MCP-I，抗 MCP-3，抗 MDC(CCL22)，抗 MIP-I a， 抗 MIP-I ^，抗 PDGF-AA，抗 PDGF-AB/BB，抗 RANTES，抗 TGF- a，抗 TNF- a，抗 TNF- ^，抗 VEGF,抗 SCD40L,抗 sIL_2Ra，抗 6Ckine,抗 BCA-I,抗 CTACK,抗 ENA-78，抗 Eotaxin-2, 抗 Eotaxin-3,抗 1-309，抗 IL-16，抗 IL-20，抗 IL-21，抗 IL-23，抗 IL_28a，抗 IL-33，抗 HF,抗 MCP-2，抗 MCP-4，抗 MIP-Id,抗 SCF，抗 SDF-IA+^，抗 TARC,抗 TP0,抗 TRAIL,抗 TSLP，抗 GCP2,抗 HCC-I，抗 I-TAC,抗 IL-11，抗 IL-29，抗 Lymphotactin,抗 M-CSF,抗 MIG, 抗 MIP-3 a，抗 MIP-3 P，抗 NAP2,抗 sCD30 (sTNFRSF8)，抗 sEGFR,抗 sIL-lRI (sCD121a)， 抗 sIL-lRII(sCD121b),抗 sIL-2Ra (sCD25)，抗 sIL_4R(sCD124)，抗 sIL_6R(sCD126)， 抗 sRAGE，抗 sTNFRI(sTNFRSFlA)，抗 sTNFRII(sTNFRSFIB)，抗 sVEGFRl(sFlt-1)，抗 sVEGFR2 (sFlk-1)，抗 sVEGFR3 (sFlt-4)，抗 sgpl30,抗 MIF,抗 PAI-I (Total)，抗 sFas,抗 sFasL，抗sICAM-I或抗sVCAM_l抗體中的至少一種，優(yōu)選至少兩種抗體，更優(yōu)選至少3種抗體，再優(yōu)選至少4種抗體，最優(yōu)選至少5種抗體。
本發(fā)明該技術(shù)方案的第一優(yōu)選技術(shù)方案為所述試劑盒包括檢測(cè)移植腎排斥反應(yīng)的蛋白的抗體，所述抗體選自抗SCF，抗sEGFR，抗sIL-2Ra，抗SRAGE，抗sTNFRI，抗 STNFR2，抗 SVEGFR2，抗 sVCAMl，抗 sFas，抗 CCL14a -HCC1，抗 SCD40L，抗 Eotaxin，抗 FGF2， 抗 Flt31igand,抗 Fracktalkine,抗 GC SF,抗 GR0,抗 IFN y，抗 IL-IR a，抗 IL-3,抗 IL-4, 抗 IL-6，抗 IL-12p70，抗 IL-13，抗 IP10，抗 MIPl a，抗 VEGF，抗 BCA-1，抗 IL-16，抗 MIPId， 抗IL-20，抗IL-28A，抗CXCL9MIG，抗0中的至少一種抗體，優(yōu)選至少兩種抗體，更優(yōu)選至少3種,再優(yōu)選至少4種,最優(yōu)選至少5種。
本發(fā)明該技術(shù)方案的第二優(yōu)選技術(shù)方案為，所述試劑盒還含有
(1)96孔濾膜板和兩張封板膜；
(2)所述試劑盒中蛋白抗體的標(biāo)準(zhǔn)品；
(3)質(zhì)控對(duì)照；
(4)血清基質(zhì)；
(5)實(shí)驗(yàn)液；
(6)洗液；
(7) streptavidin-phycoerythrin 標(biāo)記抗體；
(8)珠子稀釋液；
(9)權(quán)利要求10所述的檢測(cè)移植腎排斥反應(yīng)的蛋白的抗體；
(10)預(yù)包被抗體的珠子。
本發(fā)明該技術(shù)方案的第三優(yōu)選技術(shù)方案為所述試劑盒中
(I)所述96孔濾膜板和兩張封板膜購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)MX-PLATE ；
(2)所述標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自 Millipore 公司，貨號(hào)MXH8060，MXH8062，MXH8063，LHSP-8063 和 HSCR-8032 ；
(3)所述質(zhì)控對(duì)照購(gòu)自 Mi 11 ipore 公司，貨號(hào)為MXH6060，MXH6062，MXH6063， LHSP-6063 和 HSCR-6032 ；
(4)所述血清基質(zhì)購(gòu)自 Millipore 公司，貨號(hào)為MXHSM，LHSP-SM, HSCR-SM ；
(5)所述實(shí)驗(yàn)液購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)L-AB ；
(6)所述洗液購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)L-WB ；
(7)所述 streptavidin-phycoerythrin 標(biāo)記抗體購(gòu)自 Millipore 公司，貨號(hào) L-SAPE9, L-SAPE3, L-SAPE10, L-SAPElI, L-SAPE6 ；
(8)所述珠子稀釋液購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)LBD ；
(9)檢測(cè)抗體購(gòu)自 Millipore 公司，貨號(hào) MXH1060，MXH1062，MXH1063，LHSP-1063， HSCR-1032 ；
(10)所述預(yù)包被抗體的珠子購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)MXHPMX39，MXHP2PMX23, HSP, HASP-PAII, MXH3PMX9, HSCRPMX14。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第三個(gè)發(fā)明目的，采用的技術(shù)方案為
本發(fā)明的試劑盒的使用方法為包括以下步驟
(I)采集全血，室溫靜置，IOOOrpm離心5 15分鐘收取上清，分裝后冷凍保存?zhèn)溆茫?br> (2)用實(shí)驗(yàn)液或洗滌液預(yù)濕實(shí)驗(yàn)板，置于振蕩器振搖5 20分鐘；吸走實(shí)驗(yàn)板孔中的液體，吸干實(shí)驗(yàn)板底；
(3)相應(yīng)孔分別加入梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控對(duì)照和樣品；
(4)在背景孔、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控對(duì)照孔中加入血清基質(zhì)；
(5)每孔加入珠子；
(6)封板后將實(shí)驗(yàn)板振搖4°C孵育過(guò)夜或室溫下孵育0. 5 2h ;吸走實(shí)驗(yàn)板孔中的液體，吸干實(shí)驗(yàn)板底；利用洗液洗滌實(shí)驗(yàn)板兩次；
(7)每孔加入相應(yīng)的檢測(cè)抗體；室溫下振搖實(shí)驗(yàn)板0. 5 2h ;
(8)每孔加入streptavidin-phycoerythrin標(biāo)記抗體；室溫下振搖實(shí)驗(yàn)板孵育 20 40min ;用洗液洗滌洗扳兩次；
(9)每孔加入鞘液，檢測(cè)分析得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
本發(fā)明所述的試劑盒的使用方法的第一優(yōu)選技術(shù)方案為，包括以下步驟
(I)采集全血，室溫靜置Ih后，IOOOrpm離心10分鐘收取上清，分裝后_80。C冰箱保存?zhèn)溆?ml ；
(2)應(yīng)用200 U I實(shí)驗(yàn)液或洗滌液預(yù)濕實(shí)驗(yàn)板，置于振蕩器振搖10 15分鐘；應(yīng)用負(fù)壓吸引器吸走實(shí)驗(yàn)板孔中的液體，紙巾吸干實(shí)驗(yàn)板底；
(3)相應(yīng)孔分別加入25 U I梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控對(duì)照和樣品；
(4)在背景孔、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控對(duì)照孔中加入血清基質(zhì)25 ii I ;
(5)每孔加入25 U I珠子；
(6)封板后將實(shí)驗(yàn)板置于振蕩器振搖4°C孵育過(guò)夜或室溫下孵育Ih ;應(yīng)用負(fù)壓吸引器吸走實(shí)驗(yàn)板孔中的液體，紙巾吸干實(shí)驗(yàn)板底；每孔加入200 Ul洗液，應(yīng)用負(fù)壓吸引器吸走實(shí)驗(yàn)板孔中的液體，紙巾吸干實(shí)驗(yàn)板底，洗扳兩次；
(7)每孔加入25 U I檢測(cè)抗體，室溫下振蕩器振搖實(shí)驗(yàn)板Ih ；
(8)每孔加入25 ill streptavidin-phycoerythrin標(biāo)記抗體,室溫下振蕩器振搖實(shí)驗(yàn)板孵育30min ;每孔加入200 y I洗液,應(yīng)用負(fù)壓吸引器吸走實(shí)驗(yàn)板孔中的液體,紙巾吸干實(shí)驗(yàn)板底，洗扳兩次；
(9)每孔加入150 Ul鞘液，流式點(diǎn)陣儀檢測(cè)，軟件分析，得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
本發(fā)明所述的試劑盒的使用方法的第二優(yōu)選技術(shù)方案為，在步驟(3)中標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控對(duì)照和樣品的按照I ;4 5的比例逐級(jí)稀釋。標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控對(duì)照的初始濃度米用了與 Luminex 檢測(cè)試劑盒 Human Cytokine/Chemokine (MPXHCYT0-60K)、Human Cytokine/Chemokine Panel II(MPXHCYP2-62K)、Human Cytokine/Chemokine Panel III(MPXHCYP3-63K)、Human Soluble Cytokine Receptor Panel(HSCR-32K-PMX14)、Human Sepsis Panel I (HSEP-63K)中相同的濃度。
本發(fā)明所述的試劑盒的使用方法的第三優(yōu)選技術(shù)方案為，在步驟(9)中所述的鞘液購(gòu)自Iuminex公司，貨號(hào)為#40-50000。
本發(fā)明所述的試劑盒的使用方法的第四優(yōu)選技術(shù)方案為，在步驟(9)中所述的流式點(diǎn)陣儀為luminex200，軟件為MILLIPLEX Analyst分析。
本發(fā)明的第四發(fā)明目的在于提供蛋白SCF、sRAGE、CXCL7NAP2、CCL14 a -HCCU sCD40L、GCSF、GR0、IL-IRa、MCP3、IL-20、MIPId、IL-28A、IL-29IFN 入 I 在移植腎急性排斥反應(yīng)或移植腎排斥反應(yīng)預(yù)警中的應(yīng)用。
其中，所述的蛋白的篩選方法為首先，采集腎移植受者的移植術(shù)后多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血清，并對(duì)臨床病例進(jìn)行分析和分組；然后應(yīng)用Luminex系統(tǒng)對(duì)各組血清中96種細(xì)胞因子及趨化因子的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)；最后，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法篩選出移植排斥反應(yīng)相關(guān)的標(biāo)志物， 聯(lián)合應(yīng)用這些標(biāo)志物群，建立以多因子綜合分析為特征的移植腎排斥反應(yīng)的診斷和預(yù)警體系。
本發(fā)明應(yīng)用美國(guó)密理博公司(Millipore)的Luminex檢測(cè)試劑盒MPXHCYT0_60K、 MPXHCYP2PMX23、MPXHCYP2-62K、MPXHCYP3-63K、HSCR-32K-PMX14、HSEP-63K-06，共檢測(cè) 96 種細(xì)胞因子、細(xì)胞因子受體以及趨化因子在急性排斥反應(yīng)組和移植腎功能穩(wěn)定組病人血清中的表達(dá)水平。具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程見(jiàn)各試劑盒說(shuō)明書(shū)。
應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件SPSS16. 0對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)后， 非正態(tài)分布資料應(yīng)用minitabl5. 0進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，經(jīng)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后為正態(tài)分布的應(yīng)用T檢驗(yàn)分析急性排斥反應(yīng)組和移植腎功能穩(wěn)定組間表達(dá)水平有顯著性差異的標(biāo)記物，未能轉(zhuǎn)換為正態(tài)分布的資料經(jīng)非參分析的方法分析表達(dá)水平有顯著性差異的標(biāo)記物。分析后共得到35 個(gè)有顯著性差異的標(biāo)記物SCF，sEGFR, sIL-2R a，sRAGE, sTNFRI, sTNFR2, sVEGFR2, sVCAMl, sFas,CCL14 a -HCC1，sCD40L，Eotaxin,FGF2,Flt31igand,Fracktalkine, GCSF, GRO,IFNy， IL-IRa，IL-3, IL-4, IL-6, IL_12p70，IL-13, IP10, MIPl a，VEGF, BCA-1, IL-16, MIPId, IL-20, IL-28A, CXCL9MIG, CXCLl11TAC, CCL19MIP3 ^。其中，蛋白 SCF, llsRAGE, CXCL7NAP2,CCL14a -HCC1, sCD40L，GCSF, GRO, IL-IRa，MCP3, IL-20, MIPId, IL-28A，IL-29IFN 入 I 未見(jiàn)有在移植腎急性排斥反應(yīng)或移植腎排斥反應(yīng)預(yù)警中的報(bào)道。
下面對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明
發(fā)明人應(yīng)用液態(tài)蛋白質(zhì)芯片Iuminex檢測(cè)技術(shù)對(duì)142例急性移植腎排斥反應(yīng)病人和移植腎功能穩(wěn)定的移植受者共266份血清中的96種細(xì)胞因子/趨化因子及其受體的表達(dá)水平進(jìn)行了監(jiān)測(cè)和綜合分析，建立了含至少一種聯(lián)合標(biāo)志物的移植腎排斥反應(yīng)預(yù)警系統(tǒng)和含至少一種因子聯(lián)合標(biāo)志物的移植腎排斥反應(yīng)早期診斷系統(tǒng)，對(duì)急性排斥反應(yīng)的預(yù)測(cè)和準(zhǔn)確率達(dá)到98. 6%，內(nèi)部交叉驗(yàn)證率分別為97. I %和97. 2%。其中，優(yōu)選的，移植腎排斥反應(yīng)預(yù)警系統(tǒng)中優(yōu)選含有至少3種所述的蛋白抗體，移植腎排斥反應(yīng)早期診斷系統(tǒng)含有至少 4種所述的蛋白抗體。其中，所述試劑盒中所含有的本發(fā)明所述的蛋白因子越多，其準(zhǔn)確度越高，但會(huì)增加實(shí)際操作中的復(fù)雜性。
本發(fā)明所述的標(biāo)記物蛋白的篩選過(guò)程為
(I)采集腎移植受者的移植術(shù)前及術(shù)后多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血清、尿樣和PBMC，并對(duì)臨床病例進(jìn)行分析和分組。
(2)應(yīng)用Luminex系統(tǒng)對(duì)各組血清和尿液中96種細(xì)胞因及趨化因子的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。
(3)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法(ANOVA)篩選出移植排斥反應(yīng)相關(guān)的標(biāo)志物，聯(lián)合應(yīng)用這些標(biāo)志物群，建立以多因子綜合分析為特征的移植腎排斥反應(yīng)的診斷和預(yù)警體系。
本發(fā)明的試劑盒是在美國(guó)密理博公司(Millipore)的Luminex檢測(cè)試劑盒 HumanCytokine/Chemokine(MPXHCYT0-60K)> Human Cytokine/Chemokine Panel II (MPXHCYP2-62K)、Human Cytokine/Chemokine Panel III (MPXHCYP3-63K)、Human Soluble Cytokine Receptor Panel(HSCR-32K-PMX14)、Human Sepsis Panel I(HSEP-63K) 的基礎(chǔ)上，對(duì)急性移植腎排斥反應(yīng)病人和移植腎功能穩(wěn)定的移植受者血清中的96種細(xì)胞因子/趨化因子及其受體的表達(dá)水平進(jìn)行了分析得到的，本發(fā)明試劑盒中的試劑的大部分購(gòu)自Millipore公司，公眾可通過(guò)本發(fā)明中公開(kāi)的貨號(hào)從市場(chǎng)上購(gòu)得。Luminex檢測(cè)試劑盒的原理為雙抗體夾心法。
本發(fā)明通過(guò)建立排斥反應(yīng)的聯(lián)合標(biāo)志物群診斷和預(yù)警體系，具有更強(qiáng)的可行性和更高的敏感度。


圖I為實(shí)施例2中移植腎排斥反應(yīng)早期診斷試劑盒的診斷曲線下面積圖2為實(shí)施例3中移植腎排斥反應(yīng)早期診斷試劑盒的診斷曲線下面積圖3為實(shí)施例5中移植腎排斥反應(yīng)預(yù)警試劑盒的診斷曲線下面積圖4為實(shí)施例6中移植腎排斥反應(yīng)預(yù)警試劑盒的診斷曲線下面積圖5為移植腎功能穩(wěn)定組和急性移植腎排斥反應(yīng)組在早期診斷系統(tǒng)中各因子在血清中的濃度比較圖，其中0為穩(wěn)定組，I為排斥組；
圖6為移植腎功能穩(wěn)定組和急性移植腎排斥反應(yīng)組在預(yù)警系統(tǒng)中各因子在血清中的濃度比較圖，其中0為穩(wěn)定組，I為排斥組。
以下具體實(shí)施方式
僅對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容做進(jìn)一步的解釋和說(shuō)明，并不對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容構(gòu)成限制。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例I移植腎排斥反應(yīng)早期診斷試劑盒顯著性差異標(biāo)記物的篩選
I、采集腎移植受者的移植術(shù)后多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血清，并對(duì)臨床病例進(jìn)行分析和分組。
I. I選取術(shù)前基礎(chǔ)病或者并發(fā)癥少，手術(shù)未發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥的移植腎受者，分別在腎移植受者移植術(shù)后I天、7天、14天、21天、28天、2個(gè)月、3個(gè)月 12個(gè)月采集全血2ml， 室溫靜置Ih后，IOOOrpm離心10分鐘收取上清，分裝后_80°C冰箱保存?zhèn)溆?。另外隨時(shí)收取急性排斥反應(yīng)組患者在急性排斥反應(yīng)確診后的血清。
I. 2根據(jù)腎移植患者血清肌酐、尿素氮、移植腎B超、臨床表現(xiàn)、穿刺病理診斷結(jié)果和激素沖擊治療是否有效等綜合分析和病例篩選，將收集病例分為兩組急性排斥反應(yīng)組和移植腎功能穩(wěn)定組。急性排斥反應(yīng)組33例，移植腎功能穩(wěn)定組38例。
I. 3急性排斥反應(yīng)組入組標(biāo)準(zhǔn)
①未發(fā)生腎移植外科并發(fā)癥、感染以及其他嚴(yán)重并發(fā)癥的腎移植患者；
②活檢穿刺病理診斷為急性排斥反應(yīng)的病例；
③未經(jīng)活檢穿刺的病例根據(jù)臨床診斷和激素沖擊治療的有效性進(jìn)行判斷腎移植患者血清肌酐> 120iimol/L，尿素氮> 8. 3mmol/L，移植腎B超顯示移植腎體積增大、血流減少、血管阻力增加，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱，伴乏力關(guān)節(jié)酸痛、體重增加、血壓升高、尿量減少和移植腎脹痛等，穿刺病理診斷結(jié)果為急性排斥反應(yīng)，激素沖擊治療后血清肌酐下降10%以上。
1.4移植腎功能穩(wěn)定組入組標(biāo)準(zhǔn)
①未發(fā)生腎移植外科并發(fā)癥、感染以及其他嚴(yán)重并發(fā)癥的腎移植患者；
②未發(fā)生排斥反應(yīng)；
③移植腎功能恢復(fù)較快(14天內(nèi)血清肌酐降至正常(< 120i!mOl/L))。
2、應(yīng)用Luminex系統(tǒng)對(duì)各組血清中96種細(xì)胞因子及趨化因子的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。
2. I選取移植腎功能穩(wěn)定組病人血清肌酐恢復(fù)正常時(shí)(腎移植術(shù)后7天或14天) 的血清樣本共38份急性排斥反應(yīng)組發(fā)生排斥反應(yīng)并確診后時(shí)收取的血清32份；
2. 2應(yīng)用美國(guó)密理博公司(Mi 11 ipore) Luminex檢測(cè)試劑盒(MPXHCYT0-60K、 MPXHCYP2PMX23、MPXHCYP2-62K、MPXHCYP3-63K、HSCR-32K-PMX14、HSEP-63K-06)共檢測(cè) 96 種細(xì)胞因子、細(xì)胞因子受體以及趨化因子在急性排斥反應(yīng)組和移植腎功能穩(wěn)定組病人血清中的表達(dá)水平；具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程見(jiàn)各試劑盒說(shuō)明書(shū)；其中，移植腎功能穩(wěn)定組和急性移植腎排斥反應(yīng)組早期診斷系統(tǒng)中各因子在血清中的濃度比較如圖5所示，其中0為穩(wěn)定組，I為排斥組；
簡(jiǎn)要實(shí)驗(yàn)過(guò)程為應(yīng)用assay buffer200 U I預(yù)濕實(shí)驗(yàn)板，置于振蕩器振搖10分鐘后應(yīng)用負(fù)壓吸引器吸走實(shí)驗(yàn)板孔中的液體，紙巾吸干實(shí)驗(yàn)板底后分別加入 25ul梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照和樣品，隨后每孔加入25 Ul珠子，封板后將實(shí)驗(yàn)板置于振蕩器振搖4°C孵育過(guò)夜，洗板后加入檢測(cè)抗體，室溫振蕩器振搖實(shí)驗(yàn)板lh，再加入streptavidin-phycoerythrin 標(biāo)記抗體后孵育 30min,洗板后 luminex200 上機(jī)檢測(cè)， MILLIPLEX Analyst 軟件分析；
3、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法篩選出移植排斥反應(yīng)相關(guān)的標(biāo)志物，聯(lián)合應(yīng)用這些標(biāo)志物群，建立以多因子綜合分析為特征的移植腎排斥反應(yīng)的診斷體系。
應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件SPSS16. 0對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)后， 非正態(tài)分布資料應(yīng)用minitabl5. 0進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，經(jīng)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后為正態(tài)分布的應(yīng)用T檢驗(yàn)分析急性排斥反應(yīng)組和移植腎功能穩(wěn)定組間表達(dá)水平有顯著性差異的標(biāo)記物，未能轉(zhuǎn)換為正態(tài)分布的資料經(jīng)非參分析的方法分析表達(dá)水平有顯著性差異的標(biāo)記物。分析后共得到35 個(gè)有顯著性差異的標(biāo)記物SCF，sEGFR, sIL-2R a，sRAGE, sTNFRI, sTNFR2, sVEGFR2, sVCAMl, sFas，CCL14a -HCC1，sCD40L，Eotaxin，F(xiàn)GF2，F(xiàn)lt31igand，F(xiàn)racktalkine，GCSF，GRO，IFNy, IL-IRa，IL-3, IL-4, IL-6, IL_12p70，IL-13, IP10, MIPl a，VEGF, BCA-1, IL-16, MIPId, IL-20, IL-28A, CXCL9MIG, CXCLl11TAC, CCL19MIP3 ^。
實(shí)施例2
將實(shí)施例I得到的35個(gè)有顯著性差異的標(biāo)記物進(jìn)行分析，對(duì)這些表達(dá)水平有顯著性差異的標(biāo)記物進(jìn)行IogStic回歸分析后得到4個(gè)因子SCF、sEGFR、sIL2Ralpha 和Eotaxin組成的移植腎急性排斥反應(yīng)的預(yù)警診斷系統(tǒng)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得到預(yù)測(cè)陽(yáng)性率為 91.4。ROC診斷曲線下面積為97. 5%，見(jiàn)附圖I。
其中，試劑盒的具體組成為
(I) 96孔濾膜板和兩張封板膜；購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)MX-PLATE ；
(2)所述試劑盒中蛋白抗體的標(biāo)準(zhǔn)品；購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)MXH8060， MXH8062, MXH8063, LHSP-8063 和 HSCR-8032 ；
(3)質(zhì)控對(duì)照；購(gòu)自 Millipore 公司，貨號(hào)為MXH6060, MXH6062, MXH6063, LHSP-6063 和 HSCR-6032 ；
(4)血清基質(zhì)；購(gòu)自 Millipore 公司，貨號(hào)為MXHSM，LHSP-SM, HSCR-SM ；
(5)實(shí)驗(yàn)液；購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)L-AB ;
(6)洗液；購(gòu)自 Millipore 公司，貨號(hào) L-WB ；
(7) streptavidin-phycoerythrin 標(biāo)記抗體；購(gòu)自 Millipore 公司，貨號(hào) L-SAPE9, L-SAPE3, L-SAPE10, L-SAPElI, L-SAPE6 ；
(8)珠子稀釋液；液購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)LBD ；
(9)抗SCF的抗體、抗sEGFR的抗體、抗sIL2Ralpha的抗體和抗Eotaxin的抗體； 購(gòu)自 Millipore 公司，貨號(hào) MXH1060，MXH1062, M皿063，LHSP-1063, HSCR-1032 ；
(10)預(yù)包被抗體的珠子，購(gòu)自 Millipore 公司，貨號(hào) MXHPMX39，MXHP2PMX23，HSP， HASP-PAII, MXH3PMX9, HSCRPMX14。
實(shí)施例3 :移植腎急性排斥反應(yīng)早期診斷試劑盒的組成
將實(shí)施例I得到的35個(gè)有顯著性差異的標(biāo)記物進(jìn)行分析，對(duì)這些表達(dá)水平有顯著性差異的標(biāo)記物進(jìn)行IogStic回歸分析后得到14個(gè)因子sTNFR2、Flt3Ligand、 Fractalkine、ILlra、IL2、MDC, MIPlalpha、SDFlalphabeta、TARC, TRAIL、SCF、CCL20、 MIP3alpha和XCLlLymphotactin ;統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得到早期診斷系統(tǒng)預(yù)測(cè)陽(yáng)性率為98. 6%,ROC 診斷曲線下面積為99.8%，見(jiàn)附圖2。
其中，試劑盒的具體組成為
(I) 96孔濾膜板和兩張封板膜；購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)MX-PLATE ；
(2)所述試劑盒中蛋白抗體的標(biāo)準(zhǔn)品；購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)MXH8060， MXH8062, MXH8063, LHSP-8063 和 HSCR-8032 ；
(3)質(zhì)控對(duì)照；購(gòu)自 Millipore 公司，貨號(hào)為MXH6060，MXH6062, MXH6063, LHSP-6063 和 HSCR-6032 ；
(4)血清基質(zhì)；購(gòu)自 Millipore 公司，貨號(hào)為MXHSM，LHSP-SM, HSCR-SM ；
(5)實(shí)驗(yàn)液；購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)L-AB ；
(6)洗液；購(gòu)自 Millipore 公司，貨號(hào) L-WB ；
(7) streptavidin-phycoerythrin 標(biāo)記抗體；購(gòu)自 Millipore 公司，貨號(hào) L-SAPE9, L-SAPE3, L-SAPE10, L-SAPElI, L-SAPE6 ；
(8)珠子稀釋液；液購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)LBD ；
(9)抗 sTNFR2 的抗體、抗 Flt3Ligand 的抗體、抗 Fractalkine 的抗體、抗 ILlra 的抗體、抗IL2的抗體、抗MDC的抗體、抗MIPlalpha的抗體、抗SDFlalphabeta的抗體、 抗TARC的抗體、抗TRAIL的抗體、抗SCF的抗體、抗CCL20的抗體、抗MIP3alpha的抗體和抗 XCLlLymphotactin 的抗體；購(gòu)自 Millipore 公司，貨號(hào) MXH1060，MXH1062, MXH1063, LHSP-1063, HSCR-1032 ；
(10)預(yù)包被抗體的珠子，購(gòu)自 Millipore 公司，貨號(hào) MXHPMX39，MXHP2PMX23，HSP， HASP-PAII, MXH3PMX9, HSCRPMX14。
實(shí)施例4移植腎排斥反應(yīng)預(yù)警試劑盒的顯著性差異標(biāo)記物的篩選
I、采集腎移植受者的移植術(shù)后多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血清，并對(duì)臨床病例進(jìn)行分析和分組。
I. I選取術(shù)前基礎(chǔ)病或者并發(fā)癥少，手術(shù)未發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥的移植腎受者，分別在腎移植受者移植術(shù)后I天、7天、14天、21天、28天、2個(gè)月、3個(gè)月...12個(gè)月采集全血2ml， 室溫靜置Ih后，IOOOrpm離心10分鐘收取上清，分裝后_80°C冰箱保存?zhèn)溆?。另外隨時(shí)收取急性排斥反應(yīng)組患者在急性排斥反應(yīng)確診后的血清。
I. 2根據(jù)腎移植患者血清肌酐、尿素氮、移植腎B超、臨床表現(xiàn)、穿刺病理診斷結(jié)果和激素沖擊治療是否有效等綜合分析和病例篩選，將收集病例分為兩組急性排斥反應(yīng)組和移植腎功能穩(wěn)定組。急性排斥反應(yīng)組33例，移植腎功能穩(wěn)定組38例。
1.3急性排斥反應(yīng)組入組標(biāo)準(zhǔn)
①未發(fā)生腎移植外科并發(fā)癥、感染以及其他嚴(yán)重并發(fā)癥的腎移植患者。
②活檢穿刺病理診斷為急性排斥反應(yīng)的病例
③未經(jīng)活檢穿刺的病例根據(jù)臨床診斷和激素沖擊治療的有效性進(jìn)行判斷腎移植患者血清肌酐> 120iimol/L，尿素氮> 8. 3mmol/L，移植腎B超顯示移植腎體積增大、血流減少、血管阻力增加，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱，伴乏力關(guān)節(jié)酸痛、體重增加、血壓升高、尿量減少和移植腎脹痛等，穿刺病理診斷結(jié)果為急性排斥反應(yīng)，激素沖擊治療后血清肌酐下降10%以上；
1.4移植腎功能穩(wěn)定組入組標(biāo)準(zhǔn)
①未發(fā)生腎移植外科并發(fā)癥、感染以及其他嚴(yán)重并發(fā)癥的腎移植患者。
②未發(fā)生排斥反應(yīng)
③移植腎功能恢復(fù)較快(14天內(nèi)血清肌酐降至正常(< 120i!mOl/L))
2、應(yīng)用Luminex系統(tǒng)對(duì)各組血清中96種細(xì)胞因子及趨化因子的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。
2. I選取移植腎功能穩(wěn)定組病人血清肌酐恢復(fù)正常時(shí)(腎移植術(shù)后7天或14天) 的血清樣本共38份急性排斥反應(yīng)組發(fā)生排斥反應(yīng)并確診后時(shí)收取的血清32份
2. 2應(yīng)用美國(guó)密理博公司(Millipore) Luminex檢測(cè)試劑盒MPXHCYT0_60K、 MPXHCYP2PMX23、MPXHCYP2-62K、MPXHCYP3-63K、HSCR-32K-PMX14、HSEP-63K-06 ;共檢測(cè) 96 種細(xì)胞因子、細(xì)胞因子受體以及趨化因子在急性排斥反應(yīng)組和移植腎功能穩(wěn)定組病人血清中的表達(dá)水平。具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程見(jiàn)各試劑盒說(shuō)明書(shū)。其中，移植腎功能穩(wěn)定組和急性移植腎排斥反應(yīng)組在預(yù)警系統(tǒng)中各因子在血清中的濃度比較如圖6所示，其中0為穩(wěn)定組，I為排斥組；
簡(jiǎn)要實(shí)驗(yàn)過(guò)程應(yīng)用assay bufTer200 ii I預(yù)濕實(shí)驗(yàn)板，置于振蕩器振搖10 分鐘后應(yīng)用負(fù)壓吸引器吸走實(shí)驗(yàn)板孔中的液體，紙巾吸干實(shí)驗(yàn)板底后分別加入25 Ul 梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照和樣品，隨后每孔加入25 Ul珠子，封板后將實(shí)驗(yàn)板置于振蕩器振搖4°C孵育過(guò)夜，洗板后加入檢測(cè)抗體，室溫振蕩器振搖實(shí)驗(yàn)板lh，再加入 streptavidin-phycoerythrin 標(biāo)記抗體后孵育 30min,洗板后 luminex200 上機(jī)檢測(cè)， MILLIPLEX Analyst 軟件分析
3、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法篩選出移植排斥反應(yīng)相關(guān)的標(biāo)志物，聯(lián)合應(yīng)用這些標(biāo)志物群，建立以多因子綜合分析為特征的移植腎排斥反應(yīng)預(yù)警體系。
應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件SPSS16. 0對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)后， 非正態(tài)分布資料應(yīng)用minitabl5. 0進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，經(jīng)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后為正態(tài)分布的應(yīng)用T檢驗(yàn)分析急性排斥反應(yīng)組和移植腎功能穩(wěn)定組間表達(dá)水平有顯著性差異的標(biāo)記物，未能轉(zhuǎn)換為正態(tài)分布的資料經(jīng)非參分析的方法分析表達(dá)水平有顯著性差異的標(biāo)記物。分析后共得到35 個(gè)有顯著性差異的標(biāo)記物SCF，sEGFR, sIL-2R a，sRAGE, sTNFRI, sTNFR2, sVEGFR2, sVCAMl, sFas, CCL 14a -HCCl, sCD40L， Eotaxin, FGF2, Flt31igand, Fracktalkine, GC SF, GRO, IFNy , IL-IRa，IL-3, IL-4, IL-6, IL_12p70，IL-13, IP10, MIPl a，VEGF, BCA-1, IL-16, MIPId, IL-20, IL-28A, CXCL9MIG, CXCLl11TAC, CCL19MIP3 ^。
實(shí)施例5移植腎排斥反應(yīng)預(yù)警試劑盒
將實(shí)施例4得到的35個(gè)有顯著性差異的標(biāo)記物進(jìn)行分析，對(duì)這些表達(dá)水平有顯著性差異的標(biāo)記物進(jìn)行IogStic回歸分析后得到3個(gè)因子IL_lRa，S⑶40L和IL-20組成的移植腎急性排斥反應(yīng)的預(yù)警診斷系統(tǒng)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得到預(yù)測(cè)陽(yáng)性率為91. 4。ROC診斷曲線下面積為97. 5%，見(jiàn)附圖3。
其中，試劑盒的具體組成為
(I) 96孔濾膜板和兩張封板膜；購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)MX-PLATE ；
(2)所述試劑盒中蛋白抗體的標(biāo)準(zhǔn)品；購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)MXH8060， MXH8062, MXH8063, LHSP-8063 和 HSCR-8032 ；
(3)質(zhì)控對(duì)照；購(gòu)自 Millipore 公司，貨號(hào)為MXH6060, MXH6062, MXH6063, LHSP-6063 和 HSCR-6032 ；
(4)血清基質(zhì)；購(gòu)自 Millipore 公司，貨號(hào)為MXHSM，LHSP-SM, HSCR-SM ；
(5)實(shí)驗(yàn)液；購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)L-AB ;
(6)洗液；購(gòu)自 Millipore 公司，貨號(hào) L-WB ；
(7) streptavidin-phycoerythrin 標(biāo)記抗體；購(gòu)自 Millipore 公司，貨號(hào) L-SAPE9, L-SAPE3, L-SAPE10, L-SAPElI, L-SAPE6 ；
(8)珠子稀釋液；液購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)LBD ；
(9)抗IL-IRa的抗體，抗sCD40L的抗體和抗IL-20的抗體；購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào) MXH1060，MXH1062, MXH1063, LHSP-1063, HSCR-1032 ；
(10)預(yù)包被抗體的珠子，購(gòu)自 Millipore 公司，貨號(hào) MXHPMX39，MXHP2PMX23，HSP， HASP-PAII, MXH3PMX9, HSCRPMX14。
實(shí)施例6移植腎排斥反應(yīng)預(yù)警試劑盒
將實(shí)施例4得到的35個(gè)有顯著性差異的標(biāo)記物進(jìn)行分析，對(duì)這些表達(dá)水平有顯著性差異的標(biāo)記物進(jìn)行IogStic回歸分析后得到11個(gè)因子SIL-1R1，sVCAMl, SICAM-I, Fracktalkine, IL-IRa，IP10, MDC, MIPl a，SDF a 旦，TRAIL 和 SCF 組成的移植腎急性排斥反應(yīng)的預(yù)警診斷系統(tǒng)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得到預(yù)測(cè)陽(yáng)性率為98.6%，ROC診斷曲線下面積為 99. 8%。，見(jiàn)附圖4。
其中，試劑盒的具體組成為
(I) 96孔濾膜板和兩張封板膜；購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)MX-PLATE ；
(2)所述試劑盒中蛋白抗體的標(biāo)準(zhǔn)品；購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)MXH8060， MXH8062, MXH8063, LHSP-8063 和 HSCR-8032 ；
(3)質(zhì)控對(duì)照；購(gòu)自 Millipore 公司，貨號(hào)為MXH6060，MXH6062, MXH6063, LHSP-6063 和 HSCR-6032 ；
(4)血清基質(zhì)；購(gòu)自 Millipore 公司，貨號(hào)為MXHSM，LHSP-SM, HSCR-SM ；
(5)實(shí)驗(yàn)液；購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)L-AB ;
(6)洗液；購(gòu)自 Millipore 公司，貨號(hào) L-WB ；
(7) streptavidin-phycoerythrin 標(biāo)記抗體；購(gòu)自 Millipore 公司，貨號(hào) L-SAPE9, L-SAPE3, L-SAPE10, L-SAPElI, L-SAPE6 ；
(8)珠子稀釋液；液購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)LBD ；
(9)抗 sIL-lRI 的抗體，抗 sVCAMl 的抗體，抗 SICAM-1 的抗體，抗 Fracktalkine 的抗體,抗IL-IRa的抗體，抗IPlO的抗體，抗MDC的抗體，抗MIPl a的抗體，抗SDFa^ 的抗體，抗TRAIL的抗體和抗SCF的抗體；購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)MXH1060，MXH1062, M皿063，LHSP-1063, HSCR-1032 ；
(10)預(yù)包被抗體的珠子，購(gòu)自 Millipore 公司，貨號(hào) MXHPMX39，MXHP2PMX23，HSP， HASP-PAII, MXH3PMX9, HSCRPMX14。
權(quán)利要求
1.一種移植腎排斥反應(yīng)早期診斷試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括檢測(cè)移植腎排斥反應(yīng)的蛋白的抗體，所述抗體選自抗EGF,抗Eotaxin,抗FGF-2,抗Flt_31igand,抗 Fractalkine，抗 G-CSF,抗 GM-CSF,抗 GRO,抗 IFN- a 2，抗 IFN- y，抗 IL-10，抗 IL-12 (p40)， 抗 IL-12 (p70)，抗 IL-13，抗 IL-15，抗 IL-17，抗 IL-lra，抗 IL-1 a，抗 IL-1 ^，抗 IL-2，抗 IL-3，抗 IL-4，抗 IL-5，抗 IL-6，抗 IL-7，抗 IL-8，抗 IL-9，抗 IP-10，抗 MCP-1，抗 MCP-3， 抗 MDC (CCL22)，抗 MIP-I a，抗 MIP-I ^，抗 PDGF-AA,抗 PDGF-AB/BB，抗 RANTES,抗 TGF- a， 抗 TNF- a，抗 TNF- ^，抗 VEGF,抗 sCD40L,抗 sIL_2R a，抗 6Ckine，抗 BCA-1，抗 CTACK,抗 ENA-78,抗 Eotaxin-2,抗 Eotaxin-3，抗 1-309，抗 IL-16，抗 IL-20，抗 IL-21，抗 IL-23，抗 IL-28a，抗 IL-33，抗 HF,抗 MCP-2，抗 MCP-4，抗 MIP-Id,抗 SCF，抗 SDF-IA+ P，抗 TARC,抗 TP0,抗 TRAIL,抗 TSLP，抗 GCP2,抗 HCC-1，抗 I-TAC,抗 IL-11，抗 IL-29，抗 Lymphotactin, 抗 M-CSF，抗 MIG,抗 MIP-3 a，抗 MIP-3 ^，抗 NAP2,抗 sCD30 (sTNFRSF8)，抗 sEGFR,抗 sIL-lRI(sCD121a),抗 sIL-lRII(sCD121b)，抗 sIL_2Ra (SCD25)，抗 sIL_4R(sCD124)， 抗 sIL-6R(sCD126)，抗 sRAGE，抗 sTNFRI(sTNFRSFlA)，抗 sTNFRII(sTNFRSFIB)，抗 sVEGFRl(sFlt-1),抗 sVEGFR2 (sFlk-1)，抗 sVEGFR3(sFlt-4)，抗 sgpl30，抗 MIF，抗 PAI-I (Total),抗sFas,抗sFasL,抗sICAM-1或抗sVCAM-1抗體中的至少一種，優(yōu)選至少兩種抗體，更優(yōu)選至少3種抗體，再優(yōu)選至少4種抗體，最優(yōu)選至少5種抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的移植腎排斥反應(yīng)早期診斷試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括檢測(cè)移植腎排斥反應(yīng)的蛋白的抗體，所述抗體選自抗SCF，抗sEGFR，抗sIL-2R a， 抗 sRAGE，抗 sTNFRl，抗 sTNFR2，抗 sVEGFR2，抗 sVCAMl，抗 sFas，抗 CCL14a -HCC1，抗 sCD40L,抗 Eotaxin,抗 FGF2,抗 Flt31igand,抗 Fracktalkine,抗 GCSF,抗 GRO,抗 IFN y， 抗 IL-IR a，抗 IL-3，抗 IL-4，抗 IL-6，抗 IL_12p70，抗 IL-13，抗 IP10，抗 MIPl a，抗 VEGF, 抗 BCA-I，抗 IL-16,抗 MIPld,抗 IL-20,抗 IL-28A，抗 CXCL9MIG,抗 CXCLlIITAC 或抗 CCL19MIP3 ^中的至少一種抗體，優(yōu)選至少兩種抗體,更優(yōu)選至少3種抗體，再優(yōu)選至少4種抗體，最優(yōu)選至少5種抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的移植腎排斥反應(yīng)早期診斷試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還含有(1)96孔濾膜板和兩張封板膜；(2)所述試劑盒中蛋白抗體的標(biāo)準(zhǔn)品；(3)質(zhì)控對(duì)照；(4)血清基質(zhì)；(5)實(shí)驗(yàn)液；(6)洗液；(7)藻紅蛋白-鏈霉親合素標(biāo)記抗體；(8)珠子稀釋液；(9)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)移植腎排斥反應(yīng)的蛋白的抗體；(10)預(yù)包被抗體的珠子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的移植腎排斥反應(yīng)早期診斷試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中(I)所述96孔濾膜板和兩張封板膜購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)MX-PLATE ；(2)所述標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Millipore 公司，貨號(hào) MXH8060，MXH8062, MXH8063, LHSP-8063 和 HSCR-8032 ；(3)所述質(zhì)控對(duì)照購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)為MXH6060，MXH6062,MXH6063, LHSP-6063 和 HSCR-6032 ；(4)所述血清基質(zhì)購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)為MXHSM，LHSP-SM，HSCR-SM；(5)所述實(shí)驗(yàn)液購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)L-AB;(6)所述洗液購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)L-WB；(7)所述藻紅蛋白-鏈霉親合素標(biāo)記抗體購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)L-SAPE9, L-SAPE3, L-SAPE10, L-SAPElI, L-SAPE6 ；(8)所述珠子稀釋液購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)LBD；(9)檢測(cè)抗體購(gòu)自Millipore 公司，貨號(hào) MXH1060，MXH1062, MXH1063, LHSP-1063， HSCR-1032 ；(10)所述預(yù)包被抗體的珠子購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)MXHPMX39，MXHP2PMX23，HSP, HASP-PAII, MXH3PMX9, HSCRPMX14。
5.一種移植腎排斥反應(yīng)預(yù)警試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括檢測(cè)移植腎排斥反應(yīng)的蛋白的抗體，所述抗體選自抗EGF,抗Eotaxin,抗FGF-2,抗Flt_31igand,抗 Fractalkine，抗 G-CSF,抗 GM-CSF,抗 GRO,抗 IFN- a 2，抗 IFN- y，抗 IL-10，抗 IL-12 (p40)， 抗 IL-12 (p70)，抗 IL-13，抗 IL-15，抗 IL-17，抗 IL-lra，抗 IL-1 a，抗 IL-1 ^，抗 IL-2，抗 IL-3，抗 IL-4，抗 IL-5，抗 IL-6，抗 IL-7，抗 IL-8，抗 IL-9，抗 IP-10，抗 MCP-1，抗 MCP-3， 抗 MDC (CCL22)，抗 MIP-I a，抗 MIP-I ^，抗 PDGF-AA,抗 PDGF-AB/BB，抗 RANTES,抗 TGF- a， 抗 TNF- a，抗 TNF- ^，抗 VEGF,抗 sCD40L,抗 sIL_2R a，抗 6Ckine，抗 BCA-1，抗 CTACK,抗 ENA-78,抗 Eotaxin-2,抗 Eotaxin-3,抗 1-309，抗 IL-16，抗 IL-20，抗 IL-21，抗 IL-23，抗 IL-28a，抗 IL-33，抗 HF,抗 MCP-2，抗 MCP-4，抗 MIP-Id,抗 SCF，抗 SDF-IA+ P，抗 TARC,抗 TPO,抗 TRAIL,抗 TSLP，抗 GCP2,抗 HCC-1，抗 I-TAC,抗 IL-11，抗 IL-29，抗 Lymphotactin, 抗 M-CSF，抗 MIG,抗 MIP-3 a，抗 MIP-3 ^，抗 NAP2,抗 sCD30 (sTNFRSF8)，抗 sEGFR,抗 sIL-lRI(sCD121a),抗 sIL-lRII(sCD121b)，抗 sIL_2Ra (SCD25)，抗 sIL_4R(sCD124)， 抗 sIL-6R(sCD126)，抗 sRAGE，抗 sTNFRI(sTNFRSFlA)，抗 sTNFRII(sTNFRSFIB)，抗 sVEGFRl(sFlt-1),抗 sVEGFR2 (sFlk-1)，抗 sVEGFR3(sFlt-4)，抗 sgpl30，抗 MIF，抗 PAI-I (Total),抗sFas,抗sFasL,抗sICAM-1或抗sVCAM-1抗體中的至少一種，優(yōu)選至少兩種抗體，更優(yōu)選至少3種抗體，再優(yōu)選至少4種抗體，最優(yōu)選至少5種抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的移植腎排斥反應(yīng)預(yù)警試劑盒，其特征在于，所述抗體選自抗 SCF，抗 sEGFR,抗 sIL-2Ra，抗 sRAGE,抗 sTNFRI，抗 sTNFR2,抗 sVEGFR2,抗 sVCAMl,抗 sFas,抗 CCL14 a -HCCl,抗 sCD40L,抗 Eotaxin,抗 FGF2,抗 Flt31igand,抗 Fracktalkine, 抗 GCSF，抗 GRO,抗 IFN Y ,抗 IL-IR a，抗 IL-3，抗 IL-4，抗 IL-6，抗 IL_12p70，抗 IL-13，抗 1卩10，抗]\0 10，抗 VEGF，抗 BCA-1，抗 IL-16，抗 MIPId，抗 IL-20，抗 IL-28A，抗 CXCL9MIG， 抗CXCL111TAC或抗CCL19MIP3P中的至少一種抗體，優(yōu)選至少兩種抗體，更優(yōu)選至少3種抗體，再優(yōu)選至少4種抗體，最優(yōu)選至少5種抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的移植腎排斥反應(yīng)預(yù)警試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還含有(1)96孔濾膜板和兩張封板膜；(2)所述試劑盒中蛋白抗體的標(biāo)準(zhǔn)品；(3)質(zhì)控對(duì)照；(4)血清基質(zhì)；(5)實(shí)驗(yàn)液；(6)洗液；(7)藻紅蛋白-鏈霉親合素標(biāo)記抗體；(8)珠子稀釋液；(9)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)移植腎排斥反應(yīng)的蛋白的抗體；(10)預(yù)包被抗體的珠子。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的移植腎排斥反應(yīng)預(yù)警試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中(1)所述96孔濾膜板和兩張封板膜購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)MX-PLATE；(2)所述標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Millipore 公司，貨號(hào) MXH8060，MXH8062, MXH8063, LHSP-8063 和 HSCR-8032 ；(3)所述質(zhì)控對(duì)照購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)為MXH6060，MXH6062,MXH6063, LHSP-6063 和 HSCR-6032 ；(4)所述血清基質(zhì)購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)為MXHSM，LHSP-SM，HSCR-SM；(5)所述實(shí)驗(yàn)液購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)L-AB;(6)所述洗液購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)L-WB；(7)所述藻紅蛋白-鏈霉親合素標(biāo)記抗體購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)L-SAPE9, L-SAPE3, L-SAPE10, L-SAPElI, L-SAPE6 ；(8)所述珠子稀釋液購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)LBD；(9)檢測(cè)抗體購(gòu)自Millipore 公司，貨號(hào) MXH1060，MXH1062, MXH1063, LHSP-1063， HSCR-1032 ；(10)所述預(yù)包被抗體的珠子購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)MXHPMX39，MXHP2PMX23，HSP, HASP-PAII, MXH3PMX9, HSCRPMX14。
9.權(quán)利要求I或5所述試劑盒的使用方法，其特征在于(1)采集全血，室溫靜置，IOOOrpm離心5 15分鐘收取上清，分裝后冷凍保存?zhèn)溆茫?2)用實(shí)驗(yàn)液或洗滌液預(yù)濕實(shí)驗(yàn)板，置于振蕩器振搖5 20分鐘；吸走實(shí)驗(yàn)板孔中的液體，吸干實(shí)驗(yàn)板底；(3)相應(yīng)孔分別加入梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控對(duì)照和樣品；(4)在背景孔、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控對(duì)照孔中加入血清基質(zhì)；(5)每孔加入珠子；(6)封板后將實(shí)驗(yàn)板振搖4°C孵育過(guò)夜或室溫下孵育0.5 2h ;吸走實(shí)驗(yàn)板孔中的液體，吸干實(shí)驗(yàn)板底；利用洗液洗滌實(shí)驗(yàn)板兩次；(7)每孔加入相應(yīng)的檢測(cè)抗體；室溫下振搖實(shí)驗(yàn)板0.5 2h ;(8)每孔加入藻紅蛋白-鏈霉親合素標(biāo)記抗體；室溫下振搖實(shí)驗(yàn)板孵育20 40min;用洗液洗滌洗扳兩次；(9)每孔加入鞘液，檢測(cè)分析得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒的使用方法，其特征在于(1)采集全血，室溫靜置Ih后，IOOOrpm離心10分鐘收取上清，分裝后_80°C冰箱保存?zhèn)溆?ml ；(2)應(yīng)用200Ul實(shí)驗(yàn)液或洗滌液預(yù)濕實(shí)驗(yàn)板，置于振蕩器振搖10 15分鐘；應(yīng)用負(fù)壓吸引器吸走實(shí)驗(yàn)板孔中的液體，紙巾吸干實(shí)驗(yàn)板底；(3)相應(yīng)孔分別加入25Ul梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控對(duì)照和樣品；(4)在背景孔、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控對(duì)照孔中加入血清基質(zhì)25iU;(5)每孔加入25ii I珠子；(6)封板后將實(shí)驗(yàn)板置于振蕩器振搖4°C孵育過(guò)夜或室溫下孵育Ih;應(yīng)用負(fù)壓吸引器吸走實(shí)驗(yàn)板孔中的液體，紙巾吸干實(shí)驗(yàn)板底；每孔加入200 Ul洗液，應(yīng)用負(fù)壓吸引器吸走實(shí)驗(yàn)板孔中的液體，紙巾吸干實(shí)驗(yàn)板底，洗扳兩次；(7)每孔加入25ii I檢測(cè)抗體，室溫下振蕩器振搖實(shí)驗(yàn)板Ih ；(8)每孔加入25Ul藻紅蛋白-鏈霉親合素標(biāo)記抗體，室溫下振蕩器振搖實(shí)驗(yàn)板孵育 30min ;每孔加入200 y I洗液,應(yīng)用負(fù)壓吸引器吸走實(shí)驗(yàn)板孔中的液體,紙巾吸干實(shí)驗(yàn)板底，洗扳兩次；(9)每孔加入150Ul鞘液，流式點(diǎn)陣儀檢測(cè)，軟件分析，得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的實(shí)用方法，其特征在于，在步驟(3)中標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控對(duì)照和樣品的按照I : 4 5的比例逐級(jí)稀釋。
12.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的實(shí)用方法，其特征在于，在步驟(9)中所述的鞘液購(gòu)自 Iuminex 公司，貨號(hào)為 #40-50000。
13.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的實(shí)用方法，其特征在于，在步驟(9)中所述的流式點(diǎn)陣儀為 luminex200，軟件為 MILLIPLEX Analyst 分析。
14.蛋白SCF及其抗體在移植腎急性排斥反應(yīng)或移植腎排斥反應(yīng)預(yù)警中的應(yīng)用。
15.蛋白sRAGE及其抗體在移植腎急性排斥反應(yīng)或移植腎排斥反應(yīng)預(yù)警中的應(yīng)用。
16.蛋白CXCL7NAP2及其抗體在移植腎急性排斥反應(yīng)或移植腎排斥反應(yīng)預(yù)警中的應(yīng)用。
17.蛋白CCLMa-HCCl及其抗體在移植腎急性排斥反應(yīng)或移植腎排斥反應(yīng)預(yù)警中的應(yīng)用。
18.蛋白SCD40L及其抗體在移植腎急性排斥反應(yīng)或移植腎排斥反應(yīng)預(yù)警中的應(yīng)用。
19.蛋白GCSF及其抗體在移植腎急性排斥反應(yīng)或移植腎排斥反應(yīng)預(yù)警中的應(yīng)用。
20.蛋白GRO及其抗體在移植腎急性排斥反應(yīng)或移植腎排斥反應(yīng)預(yù)警中的應(yīng)用。
21.蛋白IL-IRa及其抗體在移植腎急性排斥反應(yīng)或移植腎排斥反應(yīng)預(yù)警中的應(yīng)用。
22.蛋白MCP3及其抗體在移植腎急性排斥反應(yīng)或移植腎排斥反應(yīng)預(yù)警中的應(yīng)用。
23.蛋白IL-20及其抗體在移植腎急性排斥反應(yīng)或移植腎排斥反應(yīng)預(yù)警中的應(yīng)用。
24.蛋白MIPld及其抗體在移植腎急性排斥反應(yīng)或移植腎排斥反應(yīng)預(yù)警中的應(yīng)用。
25.蛋白IL-28A及其抗體在移植腎急性排斥反應(yīng)或移植腎排斥反應(yīng)預(yù)警中的應(yīng)用。
26.蛋白IL-29IFNXI及其抗體在移植腎急性排斥反應(yīng)或移植腎排斥反應(yīng)預(yù)警中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種早期診斷試劑盒和一種預(yù)警試劑盒，具體講，涉及一種移植腎排斥反應(yīng)早期診斷及預(yù)警試劑盒及其使用方法，還涉及一些在移植腎急性排斥反應(yīng)或移植腎排斥反應(yīng)預(yù)警中的應(yīng)用的蛋白質(zhì)。應(yīng)用液態(tài)蛋白質(zhì)芯片luminex檢測(cè)技術(shù)對(duì)142例急性移植腎排斥反應(yīng)病人和移植腎功能穩(wěn)定的移植受者共266份血清中的96種細(xì)胞因子/趨化因子及其受體的表達(dá)水平進(jìn)行了監(jiān)測(cè)和綜合分析，建立了含至少一種聯(lián)合標(biāo)志物的移植腎排斥反應(yīng)預(yù)警系統(tǒng)和含至少一種因子聯(lián)合標(biāo)志物的移植腎排斥反應(yīng)早期診斷系統(tǒng)，對(duì)急性排斥反應(yīng)的預(yù)測(cè)和準(zhǔn)確率達(dá)到98.6％，內(nèi)部交叉驗(yàn)證率分別為97.1％和97.2％。
文檔編號(hào)G01N33/543GK102539745SQ201110438939
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者石炳毅, 許曉光, 黃海燕 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三〇九醫(yī)院