專利名稱：利用生物酶電極法檢測根系分泌物中蘋果酸的電化學(xué)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用酶電極檢測根系分泌物中蘋果酸的方法，屬于生化分析領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
根系分泌物是植物生長過程中向根際釋放的一類物質(zhì)。廣義的根系分泌物是植物根系釋放到根際環(huán)境中各種物質(zhì)的總稱，而狹義的根系分泌物是指植物根系通過溢泌作用釋放到根際環(huán)境中各種可溶性有機(jī)物的總稱。根系分泌物的種類繁多，目前已鑒定出來的有機(jī)化合物有200多種，主要包括有機(jī)酸、糖類、氨基酸和酚酸(化感物質(zhì))等低分子量的有機(jī)物，還包括類似于黏膠和酶之類的高分子量有機(jī)物質(zhì)。在根系分泌物的眾多物質(zhì)中，低分子量有機(jī)酸是研究最為廣泛也是最為重要的一類物質(zhì)。根系分泌物中低分子量有機(jī)酸主要包括諸如甲酸，乙酸，草酸，蘋果酸，丁二酸，馬來酸，檸檬酸，富馬酸等等。其中蘋果酸是根系分泌物中的重要有機(jī)酸，在特定的植物中，根系分泌的蘋果酸量不僅與根系分泌的有機(jī)酸總量有顯著的正相關(guān)，而且還與草酸、檸檬酸等呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)，因此，測定根系分泌的蘋果酸量可以評價(jià)某一物種在特定條件下的有機(jī)酸分泌情況。根系分泌物的成分復(fù)雜，目前，常見的測定根系分泌物中的蘋果酸的氣相色譜法 (GC)、離子色譜法(IC)和高效液相色譜法(HPLC)等方法，都需要繁雜的前處理過程，而且常常出現(xiàn)靈敏度低、效果不理想的情況。同時(shí)這些方法還存在單個(gè)樣品分析時(shí)間長，色譜柱易污染，分析價(jià)格昂貴的缺陷。生物傳感器是一個(gè)非?；钴S的研究和工程技術(shù)領(lǐng)域，它與生物信息學(xué)、生物芯片、 生物控制論、仿生學(xué)、生物計(jì)算機(jī)等學(xué)科一起，處在生命科學(xué)和信息科學(xué)的交叉區(qū)域。生物傳感器研究起源于20世紀(jì)的60年代，1967年Updike和Hicks把葡萄糖氧化酶(GOD)固定化膜和氧電極組裝在一起，首先制成了第一種生物傳感器，即葡萄糖酶電極。到80年代生物傳感器研究領(lǐng)域已基本形成。其標(biāo)志性事件是1985年“生物傳感器”國際刊物在英國創(chuàng)刊；1987年生物傳感器經(jīng)典著作在牛津出版社出版；1990年首屆世界生物傳感器學(xué)術(shù)大會(huì)在新加坡召開，并且確定以后每隔二年召開一次。此后包括酶傳感器的生物傳感器研究逐漸興旺起來，從用一種或多種酶作為分子識別元件的傳感器，逐漸發(fā)展設(shè)計(jì)出用其他的生物分子作識別元件的傳感器。酶傳感器的優(yōu)點(diǎn)有穩(wěn)定性好，分析精度高、分析成本最低、品種多，應(yīng)用范圍廣、分析速度快。要在眾多成分共存的根系分泌物中測定蘋果酸，利用蘋果酸及其蘋果酸脫氫酶的專一性，制作生物傳感器進(jìn)行檢測，將提高檢測的特異性，同時(shí)能達(dá)到簡便、快速、靈敏的效果。石墨烯(Graphene)，它是2004年由曼徹斯特大學(xué)的科斯提亞？？諾沃謝夫和安德烈？？蓋姆小組首先發(fā)現(xiàn)的。自發(fā)現(xiàn)以來，石墨烯受到了全世界科學(xué)家的廣泛關(guān)注。純石墨烯是一種只有一個(gè)原子厚的結(jié)晶體，具有超堅(jiān)固、超強(qiáng)導(dǎo)電性、優(yōu)異的電學(xué)、熱學(xué)和力學(xué)性能等特性。石墨烯納米復(fù)合物作為一種新型的高性能材料，不僅保持了石墨烯的一系列優(yōu)良性能，還具有純石墨烯材料不具有的其它優(yōu)良性能如催化活性和易分散性等，從而為石墨烯的廣泛應(yīng)用提供了前提條件。由于石墨烯納米復(fù)合物良好的導(dǎo)電性，將其應(yīng)用于生物傳感可提高裝置的靈敏度、響應(yīng)速度和抗干擾能力等一系列性能，這是目前許多材料制作的生物傳感器無法比擬的。應(yīng)用石墨烯納米復(fù)合物作材料制作蘋果酸脫氫酶電極，建立酶電極傳感器檢測根系分泌物中的蘋果酸，可達(dá)到靈敏度高、檢測限低、特異性好、儀器簡單便宜、操作簡便快速的效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，提供一種利用生物酶電極法檢測根系分泌物中蘋果酸的電化學(xué)方法，該方法用石墨烯納米復(fù)合物作為一種新型的高性能材料，修飾電極制備蘋果酸脫氫酶電極，直接測定根系分泌物中的蘋果酸，以克服其它方法中樣品的處理較為復(fù)雜，單個(gè)樣品分析時(shí)間長，色譜柱易污染，干擾因素多的缺點(diǎn)。本發(fā)明采取以下技術(shù)方案，它包括以下過程第一，制作蘋果酸脫氫酶(MDH)電極；第二，蘋果酸脫氫酶電極、飽和甘汞電極和鉬絲電極與電化學(xué)工作站連接，在焦磷酸鈉緩沖體系下研究該電極反應(yīng)的優(yōu)化條件；第三，在恒溫電磁攪拌下，設(shè)置操作電壓，待背景電流穩(wěn)定后，連續(xù)加入一定濃度的蘋果酸溶液到電解池中，利用恒電位計(jì)時(shí)電流法，測定不同蘋果酸濃度下相應(yīng)的電流變化值，得到一個(gè)催化電流與蘋果酸濃度的線性范圍，要求在實(shí)際檢測過程中結(jié)果必須在這個(gè)線性范圍內(nèi)；第四，加入根系分泌物樣品到電解池中，利用恒電位計(jì)時(shí)電流法，在恒溫電磁攪拌下，將電流的增加值作為y軸，純蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液加入量作為χ軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求y=0時(shí)的χ值，此時(shí)χ的絕對值就是稀釋一定倍數(shù)后樣品中的蘋果酸的濃度。在第一過程中包含有以下步驟(1)制作硫化鎘-石墨烯復(fù)合材料；(2)以硫化鎘-石墨烯復(fù)合材料制備修飾電極；(3)制作蘋果酸脫氫酶電極。在所述的第一過程的步驟(1)中，首先合成富含羧基、羥基等官能團(tuán)的氧化石墨片。然后以氧化石墨片為初始材料進(jìn)一步合成CdS/G納米復(fù)合物，其制備方法如下，稱取17 mg氧化石墨片(GO)超聲分散于10 mL 二次蒸餾水中，通過超聲將氧化石墨片剝離為單層氧化石墨烯，30分鐘后得到均相棕色溶液，即氧化石墨烯的水溶液。在攪拌情況下向該溶液逐滴加入50 mL 0. 035 mol/LCd(NO3)2溶液，并在常溫下攪拌3小時(shí)使混合液中的Cd2+與氧化石墨的-C00H、-0H等官能團(tuán)充分發(fā)生離子交換。然后向混合液中通入H2S氣體，一小時(shí)后得到綠色沉淀，所得的固體經(jīng)離心分離，分別用二次蒸餾水，丙酮各洗滌3次，最后在45 V 下真空干燥M小時(shí)即得到石墨烯參雜量為4. 6%的CdS/G納米復(fù)合物。在所述的第一過程的步驟(2)中，玻碳電極(GCE，Φ =3. 0 mm)使用前，首先在金相砂紙上打磨，然后依次用1.0 ？ m,0.3 ？ m Al2O3拋光粉在拋光布上拋光成鏡面，用二次蒸餾水沖洗干凈后依次在0. 1 mol/L HClU.O mol/L NaOH和無水乙醇中超聲清洗一分鐘，再用二次蒸餾水超聲清洗兩分鐘，晾干備用。稱取l.Omg CdS/G納米復(fù)合物分散在1. OmL 0.5%殼聚糖溶液中，超聲分散后得至IJCdS-G納米復(fù)合物的均勻懸浮液。取6 ？ L該懸浮液滴涂在預(yù)先處理好的玻碳電極表面， 室溫下晾干，制得CdS-G納米復(fù)合物修飾電極(記為CdS/G/CHIT/GCE)。在所述的第一過程的步驟(3)中，取5 ？ L lOmg/mL的蘋果酸脫氫酶(MDH)溶液滴在CdS-G納米復(fù)合物修飾電極表面，室溫晾干，待電極表面晾干之后放入4°C冰箱保存待用。這樣獲得了蘋果酸脫氫酶電極。在所述的第二過程中，電解池中的反應(yīng)條件為焦磷酸鈉緩沖液的PH值9.0，氧化電位是0.7 V，氧化態(tài)輔酶NAD+濃度為5X10_3moL 選擇30°C作為反應(yīng)溫度。在所述的第三過程中，在恒溫30°C電磁攪拌下，焦磷酸鈉緩沖液的PH值9. 0，氧化電位是0.7 V，氧化態(tài)輔酶NAD+濃度為5X IO-3HioL L—1，待背景電流穩(wěn)定后，連續(xù)加入一定濃度的蘋果酸溶液到電解池中，利用恒電位計(jì)時(shí)電流法，測定不同蘋果酸濃度下相應(yīng)的電流變化值，得到一個(gè)催化電流與蘋果酸濃度的線性范圍圖。在所述的第四過程中，溫度控制為30°C，操作電壓控制為0. 7V，取1 mL待測樣品加入到4 mL的pH=9.0、輔酶NAD+濃度為5X10_3moL L—1的焦磷酸鈉緩沖液中，電磁攪拌下下，待背景電流穩(wěn)定后，每50 s進(jìn)樣一次，每次加入5 L濃度為0.01 moL L—1標(biāo)準(zhǔn)蘋果酸溶液到電解池中，共4次，測定相應(yīng)的電流變化值，將電流的增加值作為y軸，純蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液加入量作為χ軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，令y=0，求出χ的值，χ的絕對值就是稀釋了 5倍后樣品的蘋果酸的濃度。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下
(1)蘋果酸脫氫酶電極穩(wěn)定性好，分析精度高。(2)本發(fā)明可以直接測定組成成分復(fù)雜的根系分泌物中蘋果酸，而無需繁雜的前處理過程。(3)本發(fā)明操作簡便快速，檢測限低、專一性強(qiáng)、靈敏度高、儀器簡單便宜。


圖Ia為全磷處理的油菜根系分泌物中蘋果酸恒電位計(jì)時(shí)電流曲線圖； 圖Ib為全磷處理的油菜根系分泌物中蘋果酸-電流線性關(guān)系附圖加為無磷處理的油菜根系分泌物中蘋果酸恒電位計(jì)時(shí)電流曲線圖； 附圖2b為無磷處理的油菜根系分泌物中蘋果酸-電流線性關(guān)系圖； 附圖3a為聚乙二醇處理的油菜根系分泌物中蘋果酸恒電位計(jì)時(shí)電流曲線圖； 附圖北為聚乙二醇處理的油菜根系分泌物中蘋果酸-電流線性關(guān)系圖。
具體實(shí)施例方式
具體實(shí)施例方式它包括以下過程第一，制作蘋果酸脫氫酶(MDH)電極；第二，蘋果酸脫氫酶電極、飽和甘汞電極和鉬絲電極與電化學(xué)工作站連接，在焦磷酸鈉緩沖體系下研究該電極反應(yīng)的優(yōu)化條件；第三，在恒溫電磁攪拌下，設(shè)置操作電壓，待背景電流穩(wěn)定后，連續(xù)加入一定濃度的蘋果酸溶液到電解池中，利用恒電位計(jì)時(shí)電流法，測定不同蘋果酸濃度下相應(yīng)的電流變化值，得到一個(gè)催化電流與蘋果酸濃度的線性范圍，要求在實(shí)際檢測過程中結(jié)果必須在這個(gè)線性范圍內(nèi)；第四，加入根系分泌物樣品到電解池中，利用恒電位計(jì)時(shí)電流法，在恒溫電磁攪拌下，將電流的增加值作為y軸，純蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液加入量作為χ軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求y=0時(shí)的χ值，此時(shí)χ的絕對值就是稀釋一定倍數(shù)后樣品中的蘋果酸的濃度。在第一過程中包含有以下步驟(1)制作硫化鎘-石墨烯復(fù)合材料；(2)以硫化鎘-石墨烯復(fù)合材料制備修飾電極；(3)制作蘋果酸脫氫酶電極。在所述的第一過程的步驟(1)中，首先合成富含羧基、羥基等官能團(tuán)的氧化石墨片。然后以氧化石墨片為初始材料進(jìn)一步合成CdS/G納米復(fù)合物，其制備方法如下，稱取17 mg氧化石墨片(GO)超聲分散于10 mL 二次蒸餾水中，通過超聲將氧化石墨片剝離為單層氧化石墨烯，30分鐘后得到均相棕色溶液，即氧化石墨烯的水溶液。在攪拌情況下向該溶液逐滴加入50 mL 0. 035 mol/LCd(NO3)2溶液，并在常溫下攪拌3小時(shí)使混合液中的Cd2+與氧化石墨的-C00H、-0H等官能團(tuán)充分發(fā)生離子交換。然后向混合液中通入H2S氣體，一小時(shí)后得到綠色沉淀，所得的固體經(jīng)離心分離，分別用二次蒸餾水，丙酮各洗滌3次，最后在45 V 下真空干燥M小時(shí)即得到石墨烯參雜量為4. 6%的CdS/G納米復(fù)合物。在所述的第一過程的步驟(2)中，玻碳電極(GCE，Φ =3. 0 mm)使用前，首先在金相砂紙上打磨，然后依次用1.0 ？ m,0.3 ？ m Al2O3拋光粉在拋光布上拋光成鏡面，用二次蒸餾水沖洗干凈后依次在0. 1 mol/L HClU.O mol/L NaOH和無水乙醇中超聲清洗一分鐘，再用二次蒸餾水超聲清洗兩分鐘，晾干備用。稱取l.Omg CdS/G納米復(fù)合物分散在1. OmL 0.5%殼聚糖溶液中，超聲分散后得至IJCdS-G納米復(fù)合物的均勻懸浮液。取6 ？ L該懸浮液滴涂在預(yù)先處理好的玻碳電極表面， 室溫下晾干，制得CdS-G納米復(fù)合物修飾電極(記為CdS/G/CHIT/GCE)。在所述的第一過程的步驟(3)中，取5 ？ L lOmg/mL的蘋果酸脫氫酶(MDH)溶液滴在CdS-G納米復(fù)合物修飾電極表面，室溫晾干，待電極表面晾干之后放入4°C冰箱保存待用。這樣獲得了蘋果酸脫氫酶電極。在所述的第二過程中，電解池中的反應(yīng)條件為焦磷酸鈉緩沖液的PH值9.0，氧化電位是0.7 V，氧化態(tài)輔酶NAD+濃度為5X10_3moL 選擇30°C作為反應(yīng)溫度。在所述的第三過程中，在恒溫30°C電磁攪拌下，焦磷酸鈉緩沖液的PH值9. 0，氧化電位是0.7 V，氧化態(tài)輔酶NAD+濃度為5X IO-3HioL L—1，待背景電流穩(wěn)定后，連續(xù)加入一定濃度的蘋果酸溶液到電解池中，利用恒電位計(jì)時(shí)電流法，測定不同蘋果酸濃度下相應(yīng)的電流變化值，得到一個(gè)催化電流與蘋果酸濃度的線性范圍圖。在所述的第四過程中，溫度控制為30°C，操作電壓控制為0. 7V，取1 mL待測樣品加入到4 mL的pH=9.0、輔酶NAD+濃度為5X10_3moL L—1的焦磷酸鈉緩沖液中，電磁攪拌下下，待背景電流穩(wěn)定后，每50 s進(jìn)樣一次，每次加入5 L濃度為0.01 moL L—1標(biāo)準(zhǔn)蘋果酸溶液到電解池中，共4次，測定相應(yīng)的電流變化值，將電流的增加值作為y軸，純蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液加入量作為χ軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，令y=0，求出χ的值，χ的絕對值就是稀釋了 5倍后樣品的蘋果酸的濃度。應(yīng)用實(shí)例1 為了證明本發(fā)明的實(shí)施效果，將生長30天后的油菜，用全磷 (Hoagland培養(yǎng)液)處理，15天后對油菜根系分泌物進(jìn)行收集并定容，取ImL此根系分泌物加入到4 mL的pH=9. 0、輔酶NAD+濃度為5X 10_3moL Γ1的焦磷酸鈉緩沖液，溫度控制在 30°C，電磁攪拌且操作電壓設(shè)置為0.7 V，當(dāng)背景電流達(dá)到穩(wěn)定值后，每次加入5 L濃度為 0.01 moL L—1標(biāo)準(zhǔn)蘋果酸溶液到電解池中，每50 s進(jìn)樣一次，共4次，測定相應(yīng)的電流變化值，將電流的增加值作為y軸，純蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液加入量作為χ軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求y=0時(shí)的X值，此時(shí)χ的絕對值就是稀釋了 5倍的全磷油菜根系分泌物中的蘋果酸濃度，再將X的絕對值乘以5即是收集并定容后全磷油菜根系分泌物中的蘋果酸濃度，如附圖la、附圖lb。應(yīng)用實(shí)例2 為了證明本發(fā)明的實(shí)施效果，將生長30天后的油菜，用無磷培養(yǎng)液處理，15天后對油菜根系分泌物進(jìn)行收集并定容，取ImL此根系分泌物加入到4 mL的 pH=9. 0、輔酶NAD+濃度為5X 10_3moL Γ1的焦磷酸鈉緩沖液，溫度控制在30°C，電磁攪拌且操作電壓設(shè)置為0.7 V，當(dāng)背景電流達(dá)到穩(wěn)定值后，每次加入5 L濃度為0.01 moL L—1標(biāo)準(zhǔn)蘋果酸溶液到電解池中，每50 s進(jìn)樣一次，共4次，測定相應(yīng)的電流變化值，將電流的增加值作為y軸，純蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液加入量作為X軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求y=0時(shí)的X值，此時(shí)X的絕對值就是稀釋了 5倍的無磷油菜根系分泌物中的蘋果酸濃度，再將X 的絕對值乘以5即是收集并定容后無磷油菜根系分泌物中的蘋果酸濃度，如附圖2 a、附圖
2b ο應(yīng)用實(shí)例3:
為了證明本發(fā)明的實(shí)施效果，將生長30天后的油菜，用聚乙二醇模擬干旱處理，15天后對油菜根系分泌物進(jìn)行收集并定容，取ImL此根系分泌物加入到4 mL的pH=9.0、輔酶 NAD+濃度為5 X 10_3moL Γ1的焦磷酸鈉緩沖液，溫度控制在30°C，電磁攪拌且操作電壓設(shè)置為0.7 V，當(dāng)背景電流達(dá)到穩(wěn)定值后，每次加入5 L濃度為0.01 moL L—1標(biāo)準(zhǔn)蘋果酸溶液到電解池中，每50 s進(jìn)樣一次，共4次，測定相應(yīng)的電流變化值，將電流的增加值作為y軸， 純蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液加入量作為χ軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求y=0時(shí)的χ值，此時(shí)χ 的絕對值就是稀釋了 5倍的聚乙二醇模擬干旱處理的油菜根系分泌物中的蘋果酸濃度，再將χ的絕對值乘以5即是收集并定容后聚乙二醇模擬干旱處理的油菜根系分泌物中的蘋果酸濃度，如附圖3 a、附圖北。通過以上應(yīng)用實(shí)例，三個(gè)實(shí)施例的實(shí)施效果如表1。從表1中可以看出，油菜未受到環(huán)境或營養(yǎng)脅迫時(shí)，蘋果酸含量最小，磷的缺乏促進(jìn)了油菜分泌蘋果酸，導(dǎo)致無磷處理根系分泌的蘋果酸最多。干旱也促進(jìn)根系分泌有機(jī)酸，其中也促進(jìn)了蘋果酸的分泌。這與根系分泌有機(jī)酸的規(guī)律是一致的。
表1油菜根系分泌物中蘋果酸含量
權(quán)利要求
1.一種利用生物酶電極法檢測根系分泌物中蘋果酸的電化學(xué)方法，其特征在于它包括以下過程第一，制作蘋果酸脫氫酶電極；第二，蘋果酸脫氫酶電極、飽和甘汞電極和鉬絲電極與電化學(xué)工作站連接，在焦磷酸鈉緩沖體系下研究該電極反應(yīng)的優(yōu)化條件；第三，在恒溫電磁攪拌下，設(shè)置操作電壓，待背景電流穩(wěn)定后，連續(xù)加入一定濃度的蘋果酸溶液到電解池中，利用恒電位計(jì)時(shí)電流法，測定不同蘋果酸濃度下相應(yīng)的電流變化值，得到催化電流與蘋果酸濃度的線性范圍，要求實(shí)際檢測過程中的結(jié)果在這個(gè)線性范圍內(nèi)；第四，加入根系分泌物樣品到電解池中，利用恒電位計(jì)時(shí)電流法，在恒溫電磁攪拌下，將電流的增加值作為 y軸，純蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液加入量作為χ軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求y=0時(shí)的χ值，此時(shí)χ的絕對值就是稀釋一定倍數(shù)后樣品中的蘋果酸的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用生物酶電極法檢測根系分泌物中蘋果酸的電化學(xué)方法， 其特征在于在所述的第一過程中包含有以下步驟(1)制作硫化鎘-石墨烯復(fù)合材料； (2)以硫化鎘-石墨烯復(fù)合材料制備修飾電極；(3)制作蘋果酸脫氫酶電極。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用生物酶電極法檢測根系分泌物中蘋果酸的電化學(xué)方法， 其特征在于在所述的第一過程的步驟(1)中，首先合成富含羧基、羥基等官能團(tuán)的氧化石墨片，然后以氧化石墨片為初始材料進(jìn)一步合成CdS/G納米復(fù)合物，其制備方法如下稱取 17 mg氧化石墨片超聲分散于10 mL二次蒸餾水中，通過超聲將氧化石墨片剝離為單層氧化石墨烯，30分鐘后得到均相棕色溶液，即氧化石墨烯的水溶液；在攪拌情況下向該溶液逐滴加入50 mL 0. 035 mo 1/LCd (NO3) 2溶液，并在常溫下攪拌3小時(shí)使混合液中的Cd2+與氧化石墨的-C00H、-0H等官能團(tuán)充分發(fā)生離子交換；然后向混合液中通入氣體，一小時(shí)后得到綠色沉淀，所得的固體經(jīng)離心分離，分別用二次蒸餾水，丙酮各洗滌3次，最后在45 V 下真空干燥M小時(shí)即得到石墨烯參雜量為4. 6%的CdS/G納米復(fù)合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用生物酶電極法檢測根系分泌物中蘋果酸的電化學(xué)方法， 其特征在于在所述的第一過程的步驟(2)中，玻碳電極使用前，首先在金相砂紙上打磨， 然后依次用1.0 ？ m,0.3 ？ m Al2O3拋光粉在拋光布上拋光成鏡面，用二次蒸餾水沖洗干凈后依次在0.1 mol/L HClU.O mol/L NaOH和無水乙醇中超聲清洗一分鐘，再用二次蒸餾水超聲清洗兩分鐘，晾干備用；稱取1. Omg CdS/G納米復(fù)合物分散在1. OmL 0. 5%殼聚糖溶液中，超聲分散后得到CdS-G納米復(fù)合物的均勻懸浮液；再取6 ？ L該懸浮液滴涂在預(yù)先處理好的玻碳電極表面，室溫下晾干，制得CdS-G納米復(fù)合物修飾電極。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用生物酶電極法檢測根系分泌物中蘋果酸的電化學(xué)方法， 其特征在于在所述的第一過程的步驟(3)中，取5 ？ L lOmg/mL的蘋果酸脫氫酶溶液滴在 CdS-G納米復(fù)合物修飾電極表面，室溫晾干，待電極表面晾干之后放入4°C冰箱保存待用， 這樣獲得了蘋果酸脫氫酶電極。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用生物酶電極法檢測根系分泌物中蘋果酸的電化學(xué)方法， 其特征在于在所述的第二過程中，電解池中的反應(yīng)條件為焦磷酸鈉緩沖液的PH值9. 0， 氧化電位是0.7 V，氧化態(tài)輔酶NAD+濃度為5X10_3moL 選擇30°C作為反應(yīng)溫度。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用生物酶電極法檢測根系分泌物中蘋果酸的電化學(xué)方法， 其特征在于在所述的第三過程中，在恒溫30°C電磁攪拌下，焦磷酸鈉緩沖液的pH值9. 0， 氧化電位是0.7 V，氧化態(tài)輔酶NAD+濃度為5X IO-3HioL L—1，待背景電流穩(wěn)定后，連續(xù)加入一定濃度的蘋果酸溶液到電解池中，利用恒電位計(jì)時(shí)電流法，測定不同蘋果酸濃度下相應(yīng)的電流變化值，得到催化電流與蘋果酸濃度的線性范圍圖。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用生物酶電極法檢測根系分泌物中蘋果酸的電化學(xué)方法，它包括以下過程第一，制作蘋果酸脫氫酶電極；第二，蘋果酸脫氫酶電極、飽和甘汞電極和鉑絲電極與電化學(xué)工作站連接，在焦磷酸鈉緩沖體系下研究該電極反應(yīng)的優(yōu)化條件；第三，在恒溫電磁攪拌下，設(shè)置操作電壓，待背景電流穩(wěn)定后，連續(xù)加入一定濃度的蘋果酸溶液到電解池中，測定不同蘋果酸濃度下相應(yīng)的電流變化值，得到催化電流與蘋果酸濃度的線性范圍；第四，加入根系分泌物樣品到電解池中，在恒溫電磁攪拌下，將電流的增加值作為y軸，純蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液加入量作為x軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求y=0時(shí)的x值，此時(shí)x的絕對值就是稀釋后樣品中的蘋果酸的濃度。
文檔編號G01N27/26GK102495115SQ20111043911
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月23日
發(fā)明者劉倩, 吳沿友, 朱詠莉, 牛慧樣, 王坤, 董曉婭, 趙寬 申請人:中國科學(xué)院地球化學(xué)研究所, 江蘇大學(xué), 鎮(zhèn)江梧之現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有限公司