專利名稱：一種β-雌二醇模擬抗體的制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種β-雌二醇模擬抗體的篩選方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，用于制備特異識別β-雌二醇的高效模擬抗體與研制可以快速檢測β-雌二醇?xì)埩舻拿庖咚贉y試劑盒的用途。
背景技術(shù)：
β-雌二醇(β-estradiol，β-E2，以下簡稱E2)為白色或乳白色晶體粉末，無臭，易溶于二氧六環(huán)或丙酮，微溶于乙醇，不溶于水。其分子式為C18H24O2，摩爾質(zhì)量為272.39g/mol，熔點(diǎn)為173 179°C，E2在動物和人體內(nèi)合成，具有內(nèi)源性激素的活性，對人類和動物的影響是通過模擬、干擾或?qū)箼C(jī)體內(nèi)生荷爾蒙原有的正常合成、運(yùn)輸、釋放和作用，使其無法維持自身的平衡和調(diào)節(jié)來實現(xiàn)E2對生物的危害，以水生生物居多，主要表現(xiàn)在對生殖系統(tǒng)的影響，可導(dǎo)致生物體中卵黃蛋白原的合成加速，性器官變異，出現(xiàn)動物雌性化現(xiàn)象。這是因為E2能夠?qū)εc生殖有關(guān)的類固醇合成過程中的酶起到抑制作用，使類固醇的合成受到阻礙。Irwin等發(fā)現(xiàn)，受E2影響的雌性海龜體內(nèi)的卵黃蛋白原水平明顯提高，并且認(rèn)為可通過改變能量分配、生理或產(chǎn)卵以導(dǎo)致海龜生殖某種程度上的損害。Colucci等認(rèn)為E2造成了野生魚類的生殖畸形，Purdom等認(rèn)為魚類的雌雄同體也是與E2相關(guān)聯(lián)的。此外，E2可通過飲食、空氣吸入和皮膚接觸等途徑侵入人體，對人類的直接危害是干擾內(nèi)分泌生殖系統(tǒng)的正常功能，造成男性生育能力 的下降甚至喪失。Peterson等認(rèn)為，男性精子數(shù)量的下降，睪丸癌、前列腺癌和乳腺癌發(fā)病率的增加以及男性生殖障礙都與E2有直接聯(lián)系。Rajapakse等也認(rèn)為男性精子數(shù)量的減少是受E2的影響?？梢奅2來源廣泛、危害極大，因此需要建立一套快速簡便、科學(xué)靈敏的檢測及篩檢方法。核糖體展示技術(shù)(ribosome display, RD)是一種體外展示技術(shù),基因型(DNA序列)和表型(蛋白質(zhì))可以聯(lián)系起來，即將可擴(kuò)增的基因組信息DNA或RNA與可選擇的突變體蛋白質(zhì)聯(lián)系在一起。RD技術(shù)中mRNA缺乏終止密碼子并經(jīng)過適當(dāng)修飾，在體外翻譯過程中核糖體會停留在mRNA的3'末端，形成十分穩(wěn)定的“mRNA-核糖體-蛋白質(zhì)”三元復(fù)合物，這種三元復(fù)合體形式將蛋白質(zhì)和mRNA信息連接到一起，應(yīng)用RD可進(jìn)行特殊功能的肽和蛋白質(zhì)篩選。Lipocalin是從細(xì)菌到人都含有的一組胞外親脂蛋白的總稱，作為受體較強(qiáng)的結(jié)合小分子具有重要的生物學(xué)功能。盡管Iipocalin在一級結(jié)構(gòu)上存在多樣性，但其二級結(jié)構(gòu)與四級結(jié)構(gòu)卻驚人的相似:由8條反相平行的β折疊片與一個α螺旋扭曲形成一個桶狀結(jié)構(gòu)，形成了 “Lipocalin支架”結(jié)構(gòu)，含有一個配體結(jié)合位點(diǎn)，桶的開口端由連接β條帶的多個Loop組成，是整個分子比較柔韌的部分，且氨基酸成員為極性氨基酸，LoopULoop2,Loop3,Loop4是其隨機(jī)突變的區(qū)域，最近研究表明，通過改造Lipocalin骨架作為特異性配體可以結(jié)合特定祀標(biāo)，亦即通過設(shè)計lipocalin的支架可模擬抗體與小分子結(jié)合，這些設(shè)計的lipocalin突變體稱為Anticalin,具有配體特異性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是提供一種潛在的檢測用雌二醇模擬抗體。本發(fā)明的第二個目的提供一種雌二醇模擬抗體的制備方法。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:本發(fā)明提供的抗雌二醇模擬抗體是從核糖體展示anticalin模擬抗體庫中篩選獲得的并進(jìn)行了可溶性功能表達(dá)。本發(fā)明提供的抗雌二醇模擬抗體的制備方法為:1.核糖體展示anticalin模擬抗體庫的構(gòu)建選擇膽汁三烯結(jié)合蛋白(bilin binding protein, bbp)作為anticalin庫的模板，設(shè)計隨機(jī)突變位點(diǎn)，以合成的BBP基因序列為模板，由設(shè)計的引物進(jìn)行重疊引物延伸PCR擴(kuò)增來合成Anticalin模擬抗體庫片段，約522bp，再通過PCR方法添加啟動子、間隔序列、莖環(huán)結(jié)構(gòu)等核糖體展示所需要的元件，最終構(gòu)建成功的核糖體展示anticalin模擬抗體庫，該庫轉(zhuǎn)錄后的RNA分子包括一個5’ -loop和3’ -loop莖環(huán)結(jié)構(gòu)，一個核糖體結(jié)合位點(diǎn)，隨機(jī)突變的anticalin庫，C末端間隔序列等,全長約950bp。其中突變庫的模板可以是其他lipocalin分子,優(yōu)選bbp。2.抗雌二醇模擬抗體的篩選將構(gòu)建的核糖體展示anticalin模擬抗體庫進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄翻譯后,用E2-BSA和E2-磁珠作為抗原固液相交替篩選雌二醇的模擬抗體，通過改變Mg2+濃度將篩選得到的模擬抗體-核糖體-mRNA三聯(lián)體解離，得到相應(yīng)的mRNA，經(jīng)過RT-PCR得到篩選后的DNA文庫。然后重復(fù)體外轉(zhuǎn)錄-體外翻譯-親 和篩選-RT-PCR擴(kuò)增過程，得到反復(fù)篩選幾輪的模擬抗體DNA文庫。經(jīng)過八輪核糖體展示篩選后，模擬抗體文庫中抗原陽性的模擬抗體序列明顯富集。3.雌二醇模擬抗體的可溶性功能表達(dá)將八輪篩選后對模擬抗體文庫進(jìn)行序列鑒定，隨機(jī)挑選20個克隆子，將該基因與pTIG-TRX連接成表達(dá)載體，在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE和Western Blot鑒定，在20KDa處有目的蛋白條帶，與理論蛋白大小一致，確定表達(dá)產(chǎn)物存在于破碎菌體后的上清液中，以空質(zhì)粒宿主菌為對照，E2-BSA為包被原，E2為競爭小分子，競爭ELSIA檢測誘導(dǎo)上清的競爭結(jié)合活性，有競爭結(jié)合活性的進(jìn)一步大規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)并純化。4.雌二醇模擬抗體的純化與鑒定利用Ant1-His tag親和層析柱對表達(dá)的特異結(jié)合物進(jìn)行了純化,使目的條帶得到了明顯的濃縮和分離，競爭ELISA分析純化后產(chǎn)物的競爭結(jié)合活性。SPR法檢測所獲模擬抗體的親和力。本發(fā)明還可以提供一種測定環(huán)境和食品中雌二醇?xì)埩舻臋z測試劑盒中的最關(guān)鍵檢測試劑——特異結(jié)合模擬抗體，盡管E2殘留嚴(yán)重威脅著人體健康，但它在畜牧業(yè)上的應(yīng)用仍能帶來一定的經(jīng)濟(jì)價值，這使得非法使用現(xiàn)象屢禁不止，本發(fā)明制備的雌二醇模擬抗體可以部分取代測定食品和環(huán)境樣品中雌二醇?xì)埩魷y定所需試劑，該模擬抗體還可以進(jìn)一步應(yīng)用于臨床上血清或尿液中雌二醇的檢測。本發(fā)明所制備的抗雌二醇模擬抗體的優(yōu)勢在于:(1)利用雌二醇-BSA和雌二醇-磁珠作為抗原固相和液相交替篩選，可以克服BSA造成的干擾，從而獲得E2高特異性的抗體；(2)所獲得的ancalin-E2序列清楚，便于基因工程操作，易于在大腸桿菌中可以大量功能表達(dá)；(3)分子量小，免疫原性弱，為將來的進(jìn)一步臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。


圖1核糖體展示anticalin模擬抗體庫的構(gòu)建，A為建庫的過程示意圖，B為模擬抗體庫框架示意圖.
圖2構(gòu)建核糖體展示anticalin模擬抗體庫的瓊脂糖凝膠電泳圖，M為DNAmarker, I為核糖體展示anticalin模擬抗體庫DNA圖3八輪篩選后每輪RT-PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量分析。圖4anticalin_E2誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的鑒定，其中A圖誘導(dǎo)破碎后上清的SDS-PAGE電泳圖，B圖為相應(yīng)的Western-blotting圖，1-4分別為四種anticalin_E2,M為蛋白Marker。圖5 直接 ELISA 分析 anticalin_E2 的結(jié)合活性.其中 E2-A、E2-B、E2-C 和 E2-D分別為四種anticalin_E2.
圖6間接競爭ELISA分析anticalin_E2的競爭結(jié)合活性，四種anticalin_E2檢測 E2 的 IC50 分別為 0.05,0.92,2.52,0.41 μ g/ml。圖7SPR分析anticalin_E2A的結(jié)合動力學(xué)常數(shù)
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試劑與材料，如無特殊說明，均可從常規(guī)試劑公司購買得到。實施例1核糖體展示anticalin模擬抗體的構(gòu)建一.引物合成根據(jù)bbp 序列及構(gòu)建Anticalin抗體庫需要改變的突變位點(diǎn)來設(shè)計合成引物，隨機(jī)核酸編碼區(qū)設(shè)計成NNK (N為G、C、A、T ;K為G和T)，同時設(shè)計與核糖體展示元件相連的引物，主要引物如下表所示。表I寡核苷酸引物
權(quán)利要求
1.一種雌二醇模擬抗體的制備方法，主要由以下步驟組成: (1)核糖體展示anticalin模擬抗體庫的構(gòu)建 選擇膽汁三烯結(jié)合蛋白(bilin binding protein, bbp)作為anticalin庫的模板,設(shè)計隨機(jī)突變位點(diǎn)，以合成的BBP基因序列為模板，由設(shè)計的引物進(jìn)行重疊引物延伸PCR擴(kuò)增來合成Anticalin模擬抗體庫片段，約522bp，再通過PCR方法添加啟動子、間隔序列、莖環(huán)結(jié)構(gòu)等核糖體展示所需要的元件，最終構(gòu)建成功的核糖體展示anticalin模擬抗體庫,該庫轉(zhuǎn)錄后的RNA分子包括一個5’ -loop和3’ -loop莖環(huán)結(jié)構(gòu)，一個核糖體結(jié)合位點(diǎn)，隨機(jī)突變的anticalin庫，C末端間隔序列等,全長約950bp ； (2)抗雌二醇模擬抗體的篩選 將構(gòu)建的核糖體展示anticalin模擬抗體庫進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄翻譯后,用E2-BSA和E2-磁珠作為抗原固液相交替篩選雌二醇的模擬抗體，通過改變Mg2+濃度將篩選得到的模擬抗體-核糖體-mRNA三聯(lián)體解離，得到相應(yīng)的mRNA，經(jīng)過RT-PCR得到篩選后的DNA文庫；然后重復(fù)體外轉(zhuǎn)錄-體外翻譯-親和篩選-RT-PCR擴(kuò)增過程，得到反復(fù)篩選幾輪的模擬抗體DNA文庫；經(jīng)過八輪核糖體展示篩選后，模擬抗體文庫中抗原陽性的模擬抗體序列明顯富集； (3)雌二醇模擬抗體的可溶性功能表達(dá) 將八輪篩選后對模擬抗體文庫進(jìn)行序列鑒定，隨機(jī)挑選20個克隆子，將該基因與pTIG-TRX連接成表達(dá)載體，在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE和Western Blot鑒定，在20KDa處有目的蛋白條帶，與理論蛋白大小一致，確定表達(dá)產(chǎn)物存在于破碎菌體后的上清液中，以空質(zhì)粒宿主菌為對照，E2-BSA為包被原，E2為競爭小分子，競爭ELSIA檢測誘導(dǎo)上清的競爭結(jié)合活性，有競爭結(jié)合活性的進(jìn)一步大規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)并純化； (4)雌二醇模擬抗體的純化與鑒定 利用Ant1-His tag親和層析柱對表達(dá)的特異結(jié)合物進(jìn)行了純化，使目的條帶得到了明顯的濃縮和分離，競爭ELISA分析純化后產(chǎn)物的競爭結(jié)合活性；SPR法檢測所獲模擬抗體的親和力。
2.權(quán)利要求1所述隨機(jī)突變庫的模板可以是其他Iipocalin分子,優(yōu)選bbp。
3.權(quán)利要求1所述篩選方法中的包被原可以選用E2-BSA，還可以選用E2-磁珠進(jìn)行篩選，優(yōu)選交叉篩選。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種β-雌二醇模擬抗體的篩選方法及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，該模擬抗體是由核糖體展示anticalin模擬抗體庫中篩選出來的并進(jìn)行了可溶性功能表達(dá)。本發(fā)明還涉及應(yīng)用核糖體展示技術(shù)篩選雌二醇模擬抗體的方法。本發(fā)明篩選出的雌二醇模擬抗體可以應(yīng)用于雌二醇非法添加及濫用檢測與研制快速檢測雌二醇?xì)埩舻拿庖咚贉y試劑盒。
文檔編號G01N33/74GK103172740SQ20111044066
公開日2013年6月26日 申請日期2011年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月26日
發(fā)明者寧保安, 劉建青, 彭媛, 孫亞楠, 白家磊, 柳明, 高志賢, 孫思明 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所