專利名稱：一種補(bǔ)體系統(tǒng)激活水平的elisa檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫學(xué)檢測方法領(lǐng)域，具體涉及一種藥物影響補(bǔ)體系統(tǒng)三條激活途徑激活水平的ELISA檢測方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)公開了補(bǔ)體系統(tǒng)包括30余種組分，廣泛分布于人和脊椎動(dòng)物的血清、組織液和細(xì)胞膜表面，是具有精密調(diào)控機(jī)制的蛋白質(zhì)反應(yīng)系統(tǒng)。補(bǔ)體不僅是機(jī)體固有免疫防御的重要組成部分，也是抗體發(fā)揮免疫效應(yīng)的主要機(jī)制之一。研究顯示，補(bǔ)體系統(tǒng)的正?；罨山閷?dǎo)防御微生物感染和炎癥應(yīng)答，但是其非正?；罨瘯?huì)導(dǎo)致機(jī)體的嚴(yán)重?fù)p傷。臨床上觀察補(bǔ)體的動(dòng)態(tài)變化，對(duì)一些疾病的診斷、病因研究等有重要的意義。多種疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、免疫復(fù)合物引起的腎炎、急性肺損傷，缺血再灌注引發(fā)的組織損傷及同種異體器官移植排異反應(yīng)等均涉及補(bǔ)體系統(tǒng)過度激活。建立快速和高效補(bǔ)體抑制劑篩選平臺(tái)，對(duì)急、慢性炎性疾病的治療有著重要的意義。研究顯示，多種微生物成分、抗原-抗體復(fù)合物以及其他外源性或內(nèi)源性物質(zhì)可循三條既獨(dú)立又交叉的途徑，即經(jīng)典激活途徑、替代激活途徑和甘露糖激活，通過啟動(dòng)一系列絲氨酸蛋白酶的級(jí)聯(lián)酶解反應(yīng)而激活補(bǔ)體，所形成的活化產(chǎn)物具有調(diào)理吞噬、溶解細(xì)胞、介導(dǎo)炎癥、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和清除免疫復(fù)合物等生物學(xué)功能。其中，補(bǔ)體成分C3是三條激活途徑的共同節(jié)點(diǎn)，C3被激活后裂解成C3a和C3b兩個(gè)片段，隨后大片段C3b可以進(jìn)一步裂解成C3c和C3d，其中較大片段C3c為較穩(wěn)定的裂解產(chǎn)物，并且可以與激活物相連接?，F(xiàn)有補(bǔ)體系統(tǒng)檢測手段主要是溶血試驗(yàn)和補(bǔ)體缺失血清試驗(yàn)，以及酶聯(lián)免疫吸附測定實(shí)驗(yàn)。其中，溶血試驗(yàn)應(yīng)用最為廣泛。溶血試驗(yàn)是目前最常用的檢測方法。三條補(bǔ)體激活途徑所介導(dǎo)的終產(chǎn)物均為膜攻擊復(fù)合物，具有溶解能力，可以反映補(bǔ)體的功能，因此常采用補(bǔ)體溶血試驗(yàn)測定經(jīng)典途徑或替代途徑的總補(bǔ)體活性。補(bǔ)體溶血反應(yīng)是基于抗紅細(xì)胞血清與紅細(xì)胞結(jié)合后，遇到補(bǔ)體即可使紅細(xì)胞發(fā)生溶血這一特點(diǎn)所建立的。具體方法是將抗紅細(xì)胞抗體與紅細(xì)胞結(jié)合，制成致敏紅細(xì)胞，然后用致敏紅細(xì)胞去檢測補(bǔ)體活性。羊紅細(xì)胞可以測定經(jīng)典激活途徑，兔紅細(xì)胞可以測定替代激活途徑。對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)中任何一級(jí)的抑制均可導(dǎo)致部分或全部激活級(jí)聯(lián)反應(yīng)受阻斷，但溶血試驗(yàn)只能反映血清或體液中總的補(bǔ)體活性大小，無法準(zhǔn)確定位藥物作用靶點(diǎn)。此外，膜攻擊復(fù)合物在進(jìn)攻紅細(xì)胞使其裂解時(shí)并非一一對(duì)應(yīng)，即一個(gè)紅細(xì)胞的裂解可能是由一個(gè)膜攻擊復(fù)合物引起的，也可能是由多個(gè)膜攻擊復(fù)合物引起的，因此，紅細(xì)胞的裂解量并不能準(zhǔn)確地反映補(bǔ)體系統(tǒng)的激活水平。目前，溶血試驗(yàn)無法對(duì)甘露糖途徑的激活水平進(jìn)行測定。在補(bǔ)體缺失血清試驗(yàn)中，首先將一定濃度的藥物與一定濃度補(bǔ)體混合使其恰好完全抑制補(bǔ)體溶血，再補(bǔ)充不同成分補(bǔ)體缺失血清，若藥物作用部位恰好為這一缺失成分,則體系依然不溶血；反之，體系溶血。這一方法可用于確定藥物在補(bǔ)體激活體系中的作用位點(diǎn)，但是補(bǔ)體缺失血清大多需自行制備，步驟繁瑣復(fù)雜，且工作量大，研究速度緩慢。如果直接購買補(bǔ)體缺失血清，試劑昂貴。同時(shí)，這種方法無法研究藥物對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)的非特異性作用或半溶血作用，存在一定缺陷。ELISA是酶聯(lián)免疫吸附測定試驗(yàn)的簡稱，它是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的相應(yīng)抗體或抗原既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測定時(shí)，受檢標(biāo)本與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，使其通過反應(yīng)結(jié)合在固相載體上。此時(shí)，固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。國外有文獻(xiàn)報(bào)道，將ELISA方法應(yīng)用于血清中補(bǔ)體水平的檢測，該方法是針對(duì)經(jīng)典途徑、替代途徑和甘露糖途徑三條激活途徑，分別用IgM、LPS和甘露糖三種激活物包被高吸附性酶標(biāo)板，封板后加入含補(bǔ)體的血清，以地高辛連接的抗C3抗體為一抗，捕捉血清中的C3片段，以HRP連接的羊抗地高辛抗體為酶標(biāo)檢測抗體，建立檢測補(bǔ)體水平的ELISA方法,并主要應(yīng)用于患者體內(nèi)補(bǔ)體水平的測定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于，基于ELISA原理，提供一種新的測定補(bǔ)體系統(tǒng)三條激活途徑激活水平的方法，并用于補(bǔ)體抑制劑的高通量篩選。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案:針對(duì)經(jīng)典途徑、替代途徑和甘露糖途徑三條激活途徑，分別用IgM、LPS和甘露糖三種激活物包被96孔高吸附性酶標(biāo)板，封板后加入含補(bǔ)體的豚鼠血清與待研究的藥物，與酶標(biāo)板上固化的激活物作用，使豚鼠血清中的補(bǔ)體系統(tǒng)被激活；以兔抗人C3c多克隆抗體為一抗，捕捉補(bǔ)體中被激活裂解的C3c片段，以羊抗兔IgG-HRP為酶標(biāo)檢測抗體，建立檢測補(bǔ)體激活水平的ELISA方法。具體而言，本發(fā)明的檢測補(bǔ)體激活水平的ELISA方法，其特征在于，其包括步驟:將IgM、LPS和甘露糖三種激活物包被于ELISA板上，50ul/孔，4°C過夜；將豚鼠血清或豚鼠血清和待測藥物混合液加入與酶標(biāo)板上，與酶標(biāo)板上的激活物作用，使豚鼠血清中的補(bǔ)體系統(tǒng)被激活，37°C孵育Ih ;加入兔抗人C3c多克隆抗體，37°C孵育lh，使之結(jié)合到被固相化捕捉的C3c片段上；加入羊抗兔IgG-HRP酶標(biāo)抗體，37°C孵育lh，使之與兔抗人C3c多克隆抗體結(jié)合，用以檢測補(bǔ)體系統(tǒng)的激活水平。本方法中，酶標(biāo)板為購自Nunc公司的96孔高吸附性可拆卸式酶標(biāo)板，包被緩沖液為pH9.6的0.lmol/L碳酸鹽緩沖液，經(jīng)典途徑和甘露糖途徑的豚鼠血清和待測藥物稀釋液為pH7.5的BVB++緩沖液，替代途徑豚鼠血清和待測藥物稀釋液為pH7.5的GVB/Mg++_EGTA緩沖液，洗滌液為PH7.4的0.05%的PBS-T緩沖液。商品化的兔抗人C3c多克隆抗體和羊抗兔IgG-HRP酶標(biāo)抗體購自上海長島生物技術(shù)有限公司，商品化甘露糖和LPS購自Sigma公司，人IgM購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。更具體的，本發(fā)明方法包括步驟:(I)建立經(jīng)典途徑補(bǔ)體激活水平標(biāo)準(zhǔn)曲線:
5 μ g/ml人IgM包被液包被酶標(biāo)板，50 μ I/孔，4°C過夜；PBS_T洗滌3次，250 μ I/孔，輕輕震蕩后在吸水紙上拍干屮85-1%854封閉，10(^1/孔，371:孵育Ih ;PBS_T洗滌3次，250 μ I/孔，輕輕震蕩后在吸水紙上拍干；加不同稀釋度的豚鼠血清，將豚鼠血清稀釋為1: 5，1: 10，1: 20，1: 40，1: 80，1: 160，同時(shí)設(shè)滅活的小牛血清(I: 500稀釋)為空白對(duì)照，均用ρΗ7.5的BVB++緩沖液稀釋，370C孵育Ih ;PBS_T洗滌3次，250 μ I/孔，輕輕震蕩后在吸水紙上拍干；加1/1000稀釋的兔抗人C3c多克隆抗體，100 μ I/孔，37°C孵育Ih ；PBS-T洗滌5次，250 μ I/孔，輕輕震蕩后在吸水紙上拍干；加1/1000稀釋的羊抗兔IgG-HRP酶標(biāo)抗體，100 μ I/孔，37°C孵育Ih ；PBS-T洗滌5次，250 μ I/孔，輕輕震蕩后在吸水紙上拍干；加入(^底物溶液，10(^1/孔，371:避光孵育201^11 ;加入2Μ H2SO4終止反應(yīng)，50 μ I/孔，用酶標(biāo)儀測定OD492 ;以不同稀釋度的豚鼠血清對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程。(2)建立甘露糖途徑補(bǔ)體激活水平標(biāo)準(zhǔn)曲線:100 μ g/ml甘露糖包被液包被酶標(biāo)板，50 μ I/孔，4 °C過夜；PBS_T洗滌3次，250 μ I/孔，輕輕震蕩后在吸水紙上拍干屮85-1%85么封閉，10(^1/孔，371:孵育Ih ；PBS-T洗滌3次，250 μ I/孔， 輕輕震蕩后在吸水紙上拍干；加不同稀釋度的豚鼠血清，將豚鼠血清稀釋為1: 10，I: 20，I: 40,1: 80，I: 160，I: 320，同時(shí)設(shè)滅活的小牛血清(I: 500稀釋)為空白對(duì)照，均用ρΗ7.5的BVB++緩沖液稀釋，37°C孵育Ih5PBS-T洗滌3次，250 μ I/孔，輕輕震蕩后在吸水紙上拍干；加1/1000稀釋的兔抗人C3c多克隆抗體，100 μ I/孔，37°C孵育Ih ；PBS-T洗滌5次，250 μ I/孔，輕輕震蕩后在吸水紙上拍干；力口1/1000稀釋的羊抗兔IgG-HRP酶標(biāo)抗體，100 μ I/孔，37°C孵育Ih ;PBS_T洗滌5次，250 μ I/ L，輕輕震蕩后在吸水紙上拍干；加入OPD底物溶液，100 μ I/孔，37°C避光孵育20min ;力口入2M H2SO4終止反應(yīng)，50μ I/孔，用酶標(biāo)儀測定OD492 ;以不同稀釋度的豚鼠血清對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程。(3)建立替代途徑補(bǔ)體激活水平標(biāo)準(zhǔn)曲線:10 μ g/ml LPS包被液包被酶標(biāo)板，50 μ I/孔，4°C過夜；PBS_T洗滌3次，250 μ I/孔，輕輕震蕩后在吸水紙上拍干屮85-1%854封閉，10(^1/孔，371:孵育Ih ;PBS_T洗滌3次，250 μ I/孔，輕輕震蕩后在吸水紙上拍干；加不同稀釋度的豚鼠血清，將豚鼠血清稀釋為1: 2.5，1: 5，1: 10，1: 20，1: 40，1: 80，同時(shí)設(shè)滅活的小牛血清1: 500稀釋為空白對(duì)照，均用ΡΗ7.5的GVB/Mg-EGTA緩沖液稀釋，37°C孵育Ih ；PBS-T洗滌3次，250 μ I/孔，輕輕震蕩后在吸水紙上拍干；加1/1000稀釋的兔抗人C3c多克隆抗體，100 μ I/孔，37°C孵育Ih ；PBS-T洗滌5次，250 μ I/孔，輕輕震蕩后在吸水紙上拍干；加1/1000稀釋的羊抗兔IgG-HRP酶標(biāo)抗體，100 μ I/孔，37°C孵育Ih ；PBS-T洗滌5次，250 μ I/孔，輕輕震蕩后在吸水紙上拍干；加入(^底物溶液，10(^1/孔，371:避光孵育201^11 ;加入2Μ H2SO4終止反應(yīng)，50 μ I/孔，用酶標(biāo)儀測定OD492 ;以不同稀釋度的豚鼠血清對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程。(4)經(jīng)典途徑補(bǔ)體抑制劑的篩選:5 μ g/ml人IgM包被液包被酶標(biāo)板，50 μ I/孔，4°C過夜；PBS_T洗滌3次，250 μ I/孔，輕輕震蕩后在吸水紙上拍干屮85-1%854封閉，10(^1/孔，371:孵育Ih ;PBS_T洗滌3次，250 μ I/孔，輕輕震蕩后在吸水紙上拍干；將等體積的豚鼠血清(I: 5稀釋)與一定濃度梯度的待測補(bǔ)體抑制劑溫和均勻混合(均用PH7.5的BVB++緩沖液稀釋)，4°C預(yù)孵育4511^11后加板，20(^1/孔，371:孵育Ih ；PBS-T洗滌3次，250 μ I/孔，輕輕震蕩后在吸水紙上拍干；加1/1000稀釋的兔抗人C3c多克隆抗體，100 μ I/孔，37°C孵育Ih ;PBS_T洗滌5次，250 μ I/孔，輕輕震蕩后在吸水紙上拍干；加1/1000稀釋的羊抗兔IgG-HRP酶標(biāo)抗體，100 μ I/孔，37°C孵育Ih ；PBS-T洗滌5次，250 μ I/孔，輕輕震蕩后在吸水紙上拍干；加入OPD底物溶液，100 μ I/孔，37°C避光孵育20min ;加入2M H2SO4終止反應(yīng)，50 μ I/孔，用酶標(biāo)儀測定OD492 ;將測得的OD492與相同條件下標(biāo)準(zhǔn)曲線中豚鼠血清(I: 10稀釋)OD492相比較，得到百分抑制率；以不同稀釋度的待測補(bǔ)體抑制劑對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的百分抑制率為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程，計(jì)算CH5(i。(5)篩選甘露糖途徑補(bǔ)體抑制劑:100 μ g/ml甘露糖包被液包被酶標(biāo)板，50 μ I/孔，4 °C過夜；PBS_T洗滌3次，250 μ I/孔，輕輕震蕩后在吸水紙上拍干屮85-1%85么封閉，10(^1/孔，371:孵育Ih ；PBS-T洗滌3次，250 μ I/孔，輕輕震蕩后在吸水紙上拍干；將等體積的豚鼠血清(I: 10稀釋)與一定濃度梯度的待測補(bǔ)體抑制劑溫和均勻混合(均用ΡΗ7.5的BVB++緩沖液稀釋)，4°C預(yù)孵育45min后加板，200 μ I/孔，37°C孵育Ih ;PBS_T洗滌3次，250 μ I/孔，輕輕震蕩后在吸水紙上拍干；加1/1000稀釋的兔抗人C3c多克隆抗體，100 μ I/孔，37°C孵育Ih ；PBS-T洗滌5次，250 μ I/孔，輕輕震蕩后在吸水紙上拍干；加1/1000稀釋的羊抗兔IgG-HRP酶標(biāo)抗體，100 μ I/孔，37°C孵育Ih ；PBS-T洗滌5次，250 μ I/孔，輕輕震蕩后在吸水紙上拍干；加入OPD底物溶液，100 μ I/孔，37°C避光孵育20min ;加入2M H2SO4終止反應(yīng)，50 μ I/孔，用酶標(biāo)儀測定OD492 ;將測得的OD492與相同條件下標(biāo)準(zhǔn)曲線中豚鼠血清(I: 20稀釋)OD492相比較，得到百分抑制率；以不同稀釋度的待測補(bǔ)體抑制劑對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的百分抑制率為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程，計(jì)算CH5tlt5(6)篩選替代途徑補(bǔ)體抑制劑:10 μ g/ml LPS包被液包被酶標(biāo)板，50 μ I/孔，4°C過夜;PBS_T洗滌3次，250 μ I/孔，輕輕震蕩后在吸水紙上拍干；PBS-1% BSA封閉，100 μ I/孔，37°C孵育Ih ；PBS-T洗滌3次，250 μ I/孔，輕輕震蕩后在吸水紙上拍干；將等體積的豚鼠血清(I: 1.25稀釋)與一定濃度梯度的待測補(bǔ)體抑制劑溫和均勻混合(均用ΡΗ7.5的GVB/Mg-EGTA緩沖液稀釋)，4°C預(yù)孵育4511^11后加板，20(^1/孔，371:孵育Ih ;PBS_T洗滌3次，250 μ I/孔，輕輕震蕩后在吸水紙上拍干；加1/1000稀釋的兔抗人C3c多克隆抗體，100 μ I/孔，37°C孵育Ih ;PBS_T洗滌5次，250 μ I/孔，輕輕震蕩后在吸水紙上拍干；加1/1000稀釋的羊抗兔IgG-HRP酶標(biāo)抗體，100 μ I/孔，37°C孵育Ih ；PBS-T洗滌5次，250 μ I/孔，輕輕震蕩后在吸水紙上拍干；力口入OPD底物溶液，100 μ I/孔，37°C避光孵育20min ;加入2M H2SO4終止反應(yīng)，50 μ I/孔，用酶標(biāo)儀測定OD492 ;將測得的OD492與相同條件下標(biāo)準(zhǔn)曲線中豚鼠血清(I: 5稀釋)OD492相比較，得到百分抑制率；以不同稀釋度的待測補(bǔ)體抑制劑對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的百分抑制率為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程，計(jì)算CH5tlt5本發(fā)明中采用二步法作為放大系統(tǒng)替代現(xiàn)有技術(shù)中采用的傳統(tǒng)的三步法。本發(fā)明方法中的第二抗體將特異抗體和辣根過氧化酶(HRP)結(jié)合在一種葡聚糖的聚合物上制成，使第二抗體有較多的結(jié)合位 點(diǎn)(超過20個(gè))，充分地和第一抗體結(jié)合；同時(shí)在顯色時(shí)，第二抗體有充足的酶與顯色劑起反應(yīng)，從而將待測的抗原水平顯示出來。本方法敏感性高于一般的三步法。而且克服了三步法中所采用的地高辛不僅價(jià)格昂貴，而且很難標(biāo)記在特異性抗體上的缺陷。因此，本方法耗時(shí)少，操作過程簡便，省去了地高辛標(biāo)記一抗的步驟，使實(shí)驗(yàn)更加便捷。本發(fā)明中采用抗C3c多克隆抗體為一抗，能特異性的捕捉補(bǔ)體系統(tǒng)中的激活成分C3c，有效反映補(bǔ)體系統(tǒng)的激活情況，克服了現(xiàn)有技術(shù)中采用抗C3的抗體無法通過其含量的測定反映補(bǔ)體系統(tǒng)的激活情況的缺陷。且本方法中所采用的Nunc 96孔酶標(biāo)板具有高吸附性，抗體的結(jié)合量高，提高了反應(yīng)的靈敏度；96孔板為快速篩選多種濃度的多種藥物提供了可能，從而實(shí)現(xiàn)高通量新藥篩選。本發(fā)明測定補(bǔ)體系統(tǒng)激活水平的方法與現(xiàn)有方法相比，具有如下突出的優(yōu)點(diǎn):提供了對(duì)甘露糖途徑激活水平的新的檢測方法；利用抗原抗體一一結(jié)合的特點(diǎn)，避免了溶血試驗(yàn)中由于膜攻擊復(fù)合物與紅細(xì)胞非一一對(duì)應(yīng)作用所引起的檢測誤差；酶標(biāo)抗體檢測時(shí)采用兩步法，簡化實(shí)驗(yàn)條件和步驟，進(jìn)行優(yōu)化；通過檢測抗體對(duì)C3c片段的特異性捕捉，可以反映補(bǔ)體系統(tǒng)的激活水平，用于制備補(bǔ)體激活水平檢測試劑盒；可應(yīng)用于補(bǔ)體抑制劑的研究，實(shí)現(xiàn)對(duì)補(bǔ)體抑制劑的進(jìn)行高通量的篩選；同時(shí)，通過對(duì)已知作用的補(bǔ)體抑制藥物的檢測，可以用于補(bǔ)體抑制藥物質(zhì)量控制。


圖1是本發(fā)明操作流程的示意2是經(jīng)典途徑補(bǔ)體激活水平標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為不同稀釋濃度的豚鼠血清負(fù)對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)為相應(yīng)的OD492值。圖3是甘露糖途徑補(bǔ)體激活水平標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為不同稀釋濃度的豚鼠血清負(fù)對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)為相應(yīng)的OD492值。圖4是替代途徑補(bǔ)體激活水平標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為不同稀釋濃度的豚鼠血清負(fù)對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)為相應(yīng)的OD492值。圖5是具體實(shí)施方法中補(bǔ)體抑制劑蘇拉明經(jīng)典途徑檢測結(jié)果，橫坐標(biāo)為不同稀釋濃度的蘇拉明負(fù)對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)為相應(yīng)的百分抑制率。圖6是具體實(shí)施方法中補(bǔ)體抑制劑蘇拉明甘露糖途徑檢測結(jié)果，橫坐標(biāo)為不同稀釋濃度的蘇拉明負(fù)對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)為相應(yīng)的百分抑制率。
具體實(shí)施例方式下面以已知補(bǔ)體抑制藥物蘇拉明的研究過程及結(jié)果為例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。實(shí)施例1測定蘇拉明對(duì)經(jīng)典途徑和甘露糖途徑補(bǔ)體激活水平的作用本實(shí)施例中的酶標(biāo)板為購自Nunc公司的96孔單孔可拆卸式酶標(biāo)板，包被緩沖液為pH9.6的0.lmol/L碳酸鹽緩沖液，經(jīng)典途徑和甘露糖途徑的豚鼠血清和待測藥物緩沖液為pH7.5的BVB++緩沖液，替代途徑豚鼠血清和待測藥物緩沖液為pH7.5的GVB/Mg++_EGTA緩沖液，洗滌液為PH7.4的0.05%的PBS-T緩沖液。商品化的兔抗人C3c多克隆抗體和羊抗兔IgG-HRP酶標(biāo)抗體購自上海長島生物技術(shù)有限公司。蘇拉明(Sigma公司)1、方法:分別用5 μ g/ml人IgM和100 μ g/ml甘露糖包被液包被酶標(biāo)板，50 μ I/孔，4°C過夜；PBS-T洗滌3次，250 μ I/孔，輕輕震蕩后在吸水紙上拍干；PBS-1 % BSA封閉，100 μ I/ L 37°C孵育Ih ；PBS-T洗滌3次，250 μ I/孔，輕輕震蕩后在吸水紙上拍干；將5mg的蘇拉明溶解于Iml的補(bǔ)體緩沖液中，取500 μ I依次稀釋為2.5mg/ml, 1.25mg/ml,0.3125mg/ml,0.07813mg/ml,0.01953mg/ml,0.00488mg/ml,0.00122mg/ml,將等體積的豚鼠血清稀釋液與上述濃度梯度的蘇拉明溫和均勻混合(兩條途徑均用PH7.5的BVB++緩沖液稀釋；經(jīng)典途徑中豚鼠血清1: 5稀釋，甘露糖途徑中豚鼠血清1: 10稀釋)，分別得到豚鼠血清稀釋倍數(shù)為 1: 10、蘇拉明濃度依次為 2.5mg/ml, 1.25mg/ml、0.3125mg/ml、0.07813mg/ml、0.01953mg/ml、0.00488mg/ml、0.00122mg/ml、0.00030mg/ml 的經(jīng)典途徑加板液和豚鼠血清稀釋倍數(shù)為 1: 20、蘇拉明濃度依次為 2.5mg/ml, 1.25mg/ml、0.3125mg/ml、0.07813mg/ml、
0.01953mg/ml,0.00488mg/ml,0.00122mg/ml,0.00030mg/ml 的甘露糖途徑加板液，4°C預(yù)孵育4511^11后加板，20(^1/孔，371:孵育Ih ;PBS_T洗滌3次，250 μ I/孔，輕輕震蕩后在吸水紙上拍干；加兔抗人C3c多克隆抗體稀釋液(I: 1000)，100μ I/孔，37°C孵育Ih ;PBS-T洗滌5次，250 μ I/孔，輕輕震蕩后在吸水紙上拍干；加1/1000稀釋的羊抗兔IgG-HRP酶標(biāo)抗體，100 μ I/孔，37°C孵育Ih ；PBS-T洗滌5次，250 μ I/孔，輕輕震蕩后在吸水紙上拍干；加入OPD底物溶液，100 μ I/孔，37°C避光孵育20min ;加入2M H2SO4終止反應(yīng)，50 μ I/孔，用酶標(biāo)儀測定OD492 ;將測得的OD492與相同條件下標(biāo)準(zhǔn)曲線中相同稀釋倍數(shù)豚鼠血清OD492相比較(經(jīng)典途徑與1: 10豚鼠血清OD值比較，甘露糖途徑與1: 20豚鼠血清OD值比較)，得到百分抑制率，以不同稀釋度的待測補(bǔ)體抑制劑對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的百分抑制率為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程，計(jì)算CH5(i。2、結(jié)果:
檢測結(jié)果如附圖5、6所示。結(jié)果顯示，蘇拉明對(duì)經(jīng)典途徑的CH5tl = 0.089mg/ml,對(duì)甘露糖途徑的CH5tl = 0.318mg/ml，說明蘇拉明對(duì)經(jīng)典途徑和甘露糖途徑均有明顯的抑制作用，而且對(duì)經(jīng)典途徑作用效果更強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)補(bǔ)體抑制劑的研究有指導(dǎo)性作用，可用于補(bǔ)體抑制劑的高通量篩選。
權(quán)利要求
1.一種補(bǔ)體系統(tǒng)激活水平的ELISA檢測方法，其特征在于，其針對(duì)經(jīng)典途徑、替代途徑和甘露糖途徑三條激活途徑，分別用免疫球蛋白IgM、脂多糖LPS和甘露糖三種激活物包被96孔高吸附性酶標(biāo)板；封板后加入含補(bǔ)體的豚鼠血清與待研的藥物，與酶標(biāo)板上固化的激活物作用，使豚鼠血清中的補(bǔ)體系統(tǒng)被激活；以抗補(bǔ)體抗體為一抗，捕捉被激活裂解的補(bǔ)體片段；以抗IgG-HRP為酶標(biāo)檢測抗體，建立檢測補(bǔ)體激活水平的ELISA方法。
2.按權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述的抗補(bǔ)體抗體為兔抗人C3c多克隆抗體。
3.按權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述的被激活裂解的補(bǔ)體片段是被激活裂解的C3c片段。
4.權(quán)利要求1的方法在制備補(bǔ)體激活水平檢測試劑盒中的用途。
5.權(quán)利要求1的方法在制備在篩選補(bǔ)體抑制劑中的用途。
6.權(quán)利要求1的方法在補(bǔ)體抑制藥物質(zhì)量控制中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于免疫學(xué)檢測方法領(lǐng)域。公開了一種補(bǔ)體系統(tǒng)激活水平的ELISA檢測方法，本發(fā)明針對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)的經(jīng)典、替代和甘露糖三條激活途徑，分別用三種不同的激活物包被96孔高吸附性酶標(biāo)板，實(shí)現(xiàn)在體外激活補(bǔ)體系統(tǒng)，并利用多克隆抗補(bǔ)體抗體為中間物，捕獲激活補(bǔ)體，以抗IgG-HRP為酶標(biāo)檢測抗體，以此反映補(bǔ)體系統(tǒng)的激活情況。本發(fā)明中采用二步法作為放大系統(tǒng)替代傳統(tǒng)的三步法。本方法耗時(shí)少，操作過程簡便，能節(jié)省地高辛標(biāo)記抗體的步驟，使實(shí)驗(yàn)更加便捷。本方法彌補(bǔ)了現(xiàn)有溶血實(shí)驗(yàn)不能測定補(bǔ)體甘露糖途徑激活情況的缺陷，尤其適用于檢測藥物對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)的抑制作用，建立了全新的快速高效的補(bǔ)體抑制劑離體篩選方法。
文檔編號(hào)G01N33/53GK103175951SQ201110441180
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2011年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月24日
發(fā)明者力弘, 章蘊(yùn)毅, 吳牧鷺, 陳道峰 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)