專利名稱：利用微型膜保護(hù)透析技術(shù)測定生物樣品中的活性成分的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬藥物分析領(lǐng)域，涉及體內(nèi)生物樣品的分析測定方法，具體涉及一種利用多孔高分子材料膜制成的微型裝置對(duì)基質(zhì)復(fù)雜的生物樣品進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)合高效液相色譜法對(duì)富集濃縮后的目標(biāo)成分進(jìn)行測定的方法。
背景技術(shù)：
(1)目前，國內(nèi)外對(duì)于體內(nèi)樣品測定前的預(yù)處理通常都是采用常規(guī)的蛋白沉淀、 液液萃取、固相萃取等方法，這些方法存在靈敏度低，操作繁瑣費(fèi)時(shí)、效率低、有效成分損失較多、蛋白沉淀不完全等種種缺點(diǎn)。而血樣中的成分含量往往較低，運(yùn)用常規(guī)方法處理后提取回收率低，低濃度的活性成分可能因此而難以檢測到。一些聯(lián)用技術(shù)因高靈敏度低檢測限應(yīng)用于體內(nèi)藥物分析，如HPLC-MS-MS等，但儀器價(jià)格昂貴難以推廣應(yīng)用。故建立提取效率高、簡單快捷、適用的微量生物樣品檢測方法對(duì)藥效學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)研究有著重要的科學(xué)價(jià)值。(2)本發(fā)明將多孔聚合物膜制備成微型裝置，生物樣品置于裝置內(nèi)，采用適當(dāng)?shù)娜軇┻M(jìn)行透析，由于目標(biāo)小分子可以自由穿過膜孔，大分子的干擾物質(zhì)如蛋白質(zhì)等不能穿透膜孔而被滯留于膜袋內(nèi)，在恒溫振蕩器的振蕩下，目標(biāo)成分快速擴(kuò)散并溶于膜外的溶劑中達(dá)到平衡，該方法實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)等干擾物質(zhì)的去除與目標(biāo)成分的富集同步進(jìn)行，提取分離效率高，成本低廉，操作簡單，實(shí)用性強(qiáng)，可用于多種生物樣品中低濃度活性成分的檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服已有技術(shù)的不足，提供一種簡便、快捷、靈敏的測定體內(nèi)活性成分濃度的方法。本方法無需昂貴的儀器和試劑，具有操作簡單、快速、樣品用量少、成本低等優(yōu)點(diǎn)， 適合于常規(guī)生物樣品含量濃度測定。本發(fā)明通過以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，具體包括步驟如下
(1)將孔徑為0.22μ m的聚丙烯膜或聚醚砜膜采用塑封機(jī)熱封制成1.5CmXlCm的長方形膜袋；
(2)取適量的脫脂棉用去離子水潤濕，以濾紙將多余的水分吸掉后，將脫脂棉填充到膜袋底部作為載體；
(3)精密吸取100μ L待測樣品(如血漿、組織液、尿液等樣品)，加載于載體上，然后將膜袋口密封；
(4)將制備好的料袋放入裝有4mL提取溶劑的具塞試管中，再將試管置于恒溫振蕩儀中振蕩30 min ；
(5)將料袋取出，將剩余洗脫液用氮?dú)獯蹈?，再用甲醇或流?dòng)相將剩余殘?jiān)ㄈ葜?.5mL ；
(6)將所得溶液用0. 22 μ m微孔濾膜過濾，用高效液相色譜法對(duì)其中所含的活性成分進(jìn)行含量測定。以測定大鼠血漿樣品中金絲桃苷和異槲皮素為例，與常規(guī)前處理方法相比，本發(fā)明方法快速簡便、靈敏度高，最低檢測限達(dá)到0. 20 μ g/mL，有更高的絕對(duì)回收提取率，見表一。從表一中數(shù)據(jù)表明，本方法的絕對(duì)回收率高于其它常規(guī)預(yù)處理方法。常規(guī)方法的前處理方法如下
Cw固相萃取法將C18-SPE萃取柱(規(guī)格100 mg，1 mL)安裝于真空固相萃取裝置上， 用5 mL甲醇、5 mL水依次活化平衡萃取小柱，精密吸取100 μ L血漿樣品上柱，棄去濾液， 用5 mL水除雜質(zhì)后，再用5 mL 80%甲醇淋洗，收集甲醇洗脫液，用N2吹干，殘留物用80%甲醇定容至0. 5 mL,過0. 22 μ m微孔濾膜后20 μ L進(jìn)樣，用外標(biāo)法定量。蛋白沉淀法精密量取血漿樣品100 yL，加入甲醇300 μ L，渦旋1 min后，于4°C 下以10000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液；再將沉淀下來蛋白加甲醇1 mL，渦旋1 min，4°C下以10000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min取上清液，重復(fù)此操作兩次。合并三次清液， 用N2吹干吹干，殘留物用80%甲醇定容至0.5 mL，過0.22 μ m微孔濾膜后取20 μ L進(jìn)樣， 用外標(biāo)法定量。液液萃取法精密量取血漿樣品100 yL，加入氯仿-異丙醇混合溶液(ν/ν=1:1) 2 mL進(jìn)行萃取，然后于4°C下以10000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液，重復(fù)此萃取操作3次，合并清液，用N2吹干，殘留物用80%甲醇定容至0.5 mL，過0.22 μ m微孔濾膜后取 20 μ L進(jìn)樣，用外標(biāo)法定量。表一、四種不同前處理方法富集同一血漿樣品中待測物的絕對(duì)回收率的比較。


圖1 用四種方法處理后的血樣HPLC圖譜a.微型膜保護(hù)透析法；b.液液萃取；C. C18固相萃??；d.蛋白沉淀。從色譜圖中可以看出，采用本方法測定的金絲桃苷和異槲皮素的含量是最高的。
具體實(shí)施例方式
下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方案和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例 1。實(shí)施例1
1.將孔徑為0.22 μ m的聚丙烯膜剪成適當(dāng)大小的膜片，對(duì)折后用塑封機(jī)封制成規(guī)格為1. 5 cmX 1 cm的長方形的膜袋，取適量的脫脂棉用去離子水潤濕，以濾紙將多余的水分吸掉后，將脫脂棉填充如袋子的底部作為載體；精密吸取100 μ L待測血樣，加載至載體上，然后將料袋口密封；將密封好的膜裝置放入裝有4 mL80%甲醇的離心管中，再將離心管放置到恒溫振蕩儀中振蕩30 min ；將膜裝置取出，用N2吹干透析液，殘留物用80%甲醇定容至0.5 mL，過0.22 μ m微孔濾膜后取20 μ L進(jìn)樣，采用高效液相色譜法進(jìn)行定量，測得金絲桃苷濃度為11. 93 μ g/mL。
高效液相色譜法檢測色譜條件為
依利特 hypersil C18 色譜柱 QOO mm X 4. 6 mm i. d. , 5 μ m, 成為10 mmol L-I乙酸銨溶液(醋酸調(diào)pH至4.0) (A)和乙腈(B), min, 6% B; 4 min, 8% B; 6 min, 10% B; 8 min, 12% B; 45 min, mL min-1,進(jìn)樣量20 μ 1。柱溫30 °C。檢測波長為254 nm。
大連)，流動(dòng)相組流動(dòng)相梯度為0 16% B ；流速為1. 0
權(quán)利要求
1.本發(fā)明的目的在于提供一種方便快捷、高靈敏度且高提取回收率的生物樣品中低含量活性成分的測定方法。
2.權(quán)利要求1所述測定生物樣品中低含量活性成分方法，其特征在于，包括以下步驟(1)首先將孔徑為0.22 μ m的聚丙烯膜用塑封機(jī)熱封制成1. 5cmX Icm的長方形膜袋， 即膜裝置；(2)取適量的脫脂棉用去離子水潤濕，以濾紙將多余的水分吸掉后，將脫脂棉填充到膜袋底部作為載體；(3)精密吸取100μ L待測樣品(如血漿、組織液、尿液等樣品)，加載于載體上，然后將膜袋口密封；(4)將制備好的料袋放入裝有4mL提取溶劑的具塞試管中，再將試管置于恒溫振蕩儀中振蕩30 min ；(5)將料袋取出，將剩余洗脫液用氮?dú)獯蹈?，再用甲醇或流?dòng)相將剩余殘?jiān)ㄈ葜?.5mL ；(6)將所得溶液用0.22 μ m微孔濾膜過濾，用高效液相色譜法對(duì)其中所含的活性成分進(jìn)行含量測定。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的要求，所使用的多孔膜使用的材料為聚丙烯膜或聚醚砜膜，孔徑為0. 1 -0. 45 μ m，采用熱封法制成1-2 cmX 1-2 cm的膜袋。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的要求，載體的材料為吸水材料。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的要求，生物樣品可以包括血漿樣品、全血樣品、血清樣品、組織液樣品、尿液樣品等。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的要求，上述生物樣品的取樣量為20-300UL0
7.根據(jù)權(quán)利要求2的要求，所使用的提取取劑為甲醇、乙醇、乙腈等，提取溶劑的用量為 2-10 mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求2的要求，采用恒溫振蕩儀加速透析，振蕩洗脫時(shí)間為20-40min0
9.根據(jù)權(quán)利要求2的要求，洗脫液用氮?dú)獯蹈珊笮柙儆眉状蓟蛄鲃?dòng)相定容至0.5-1mLo
全文摘要
本發(fā)明提供一種生物樣品中微量活性成分的測定方法。本方法采用多孔膜熱封制成1.5cm×1cm膜裝置，于其中填裝適量載體，并將生物樣品加載于載體上，熱封膜裝置；然后將此裝置放入提取容器中用提取溶劑進(jìn)行透析富集目標(biāo)成分，最后結(jié)合高效液相色譜法完成活性成分的定量分析。本方法實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)成分的富集和復(fù)雜大分子干擾物的去除一步化操作，具有樣品用量少，提取回收率高，檢測限低，操作簡單，成本低，適用范圍廣的特點(diǎn)，特別適合于基質(zhì)復(fù)雜、低濃度活性成分的生物樣品的檢測。
文檔編號(hào)G01N30/08GK102539560SQ20111044124
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月26日
發(fā)明者尹小英, 李進(jìn)進(jìn), 江一帆, 沙碧瑩, 游菁菁, 羅杠, 馬興霞 申請人:江西中醫(yī)學(xué)院