專利名稱：一種檢測(cè)抗U1-snRNP抗體的試劑裝置及其方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明申請(qǐng)涉及一種檢測(cè)抗Ul-snRNP抗體的試劑裝置及其方法，屬于臨床免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
混合性 結(jié)締組織病(Mixed connective tissue disease, MCTD)是一種以系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，系統(tǒng)性硬化(SSc)，多發(fā)性肌炎/皮肌炎(PM/DM)及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)等疾病的癥狀相重疊為特征的風(fēng)濕性綜合征，其突出的特點(diǎn)是在其血清中有很高滴度的斑點(diǎn)型抗核抗體(ANA)和抗Ul-snRNP抗體。在真核細(xì)胞，異質(zhì)性胞核核糖核蛋白(hnRNP)與小核核糖核蛋白(snRNP)共同參與mRNA成熟的過(guò)程。snRNA是在真核細(xì)胞核內(nèi)的一組小分子RNA，約含50 200個(gè)核苷酸，故稱為小核RNA。其與有關(guān)蛋白結(jié)合形成的snRNP，主要在加工RNA前體，切除多余的片段(如內(nèi)含子)時(shí)發(fā)揮重要作用。由于這組小分子的snRNP中尿嘧啶含量豐富，故snRNP又被稱為U-snRNP。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的U-snRNP至少有13種(Ul U13)，大都分布于核質(zhì)。6種富含U的snRNA(Ul U6)大量存在于動(dòng)物細(xì)胞核。每種snRNP均由I種8111 ^(分別對(duì)應(yīng)稱仍、似、況、邪和服)與6 10個(gè)對(duì)應(yīng)蛋白構(gòu)成。與Ul-snRNP反應(yīng)的抗體包括Sm抗體和RNP抗體。RNP抗體含有抗Ul-snRNP抗體，抗Ul-snRNP抗體陽(yáng)性而抗Sm抗體陽(yáng)性是MCTD的特點(diǎn)。但在患者血清中同時(shí)發(fā)現(xiàn)抗Ul-snRNP抗體和抗Sm抗體的情況很多見(jiàn),這可能與自身免疫擴(kuò)展有關(guān)。臨床檢測(cè)抗Ul-snRNP抗體的常見(jiàn)方法包括免疫印跡法、對(duì)流免疫電泳法和ELISA法，但這些方法都存在著不足之處。一、免疫印跡法免疫印跡是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過(guò)融合部分的抗體檢測(cè)。其不足之處在于:(I)只能進(jìn)行定性和半定量分析，無(wú)法得出被檢物質(zhì)具體的量。(2)操作步驟繁瑣，試驗(yàn)用時(shí)較長(zhǎng)。(3)檢測(cè)的靈敏度還有待提聞。二、對(duì)流免疫電泳法對(duì)流免疫電泳是在瓊脂擴(kuò)散基礎(chǔ)上結(jié)合電泳技術(shù)而建立的一種簡(jiǎn)便而快速的方法。此方法能在短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)結(jié)果，故可用于快速診斷。但其也存在著不足之處:(I)當(dāng)抗原抗體比例不適合時(shí)，均不能出現(xiàn)明顯可見(jiàn)的沉淀線；(2)選擇不同的電泳緩沖液對(duì)其靈敏度有一定的影響；(3)電壓和電流的選擇會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。三、酶聯(lián)免疫吸附法酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)抗Ul-snRNP抗體，但該方法也存在著下述的不足之處:(I)使用12X8型、6X8型、8X12型或整板型96孔專用微孔板作為抗原包被用具和反應(yīng)容器，在使用時(shí)只能分成12批次、6批次、8批次或整板一次使用，無(wú)法進(jìn)行獨(dú)立的、單人份的檢測(cè)；(2)定量測(cè)定所用的試劑種類較多，每一種檢測(cè)試劑都要用試劑瓶來(lái)盛裝，并且每使用一種試劑時(shí)都需要更換吸液嘴來(lái)分別加注到微孔板的微孔中，不但試劑瓶種類多，力口注試劑的操作也極為繁瑣；(3)缺少對(duì)檢測(cè)信息的相應(yīng)標(biāo)注，只能通過(guò)查看試劑盒外包裝盒的標(biāo)識(shí)才能了解或知悉檢測(cè)試劑的生產(chǎn)批號(hào)及有效期信息，而且所知悉的信息在檢測(cè)過(guò)程中不受控，具有很大的隨意性；(4)檢測(cè)試劑在檢測(cè)過(guò)程中處于開(kāi)放的空間，容易引起各種試劑之間的交叉污染而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性；(5)檢測(cè)過(guò)程多采用手工操作，試劑或樣本的加量不很精確，操作過(guò)程極為繁瑣和復(fù)雜，容易發(fā)生操作差錯(cuò)，檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度較差；(6)在檢測(cè)項(xiàng)目成套試劑的數(shù)量配置及使用上均為項(xiàng)目數(shù)X48/96人份，如果需要檢測(cè)10個(gè)項(xiàng)目，則試劑的配置及使用數(shù)須為10X48/96人份，如果只有一份樣本需要檢測(cè)10個(gè)不同的項(xiàng)目，也需要配置10X48/96人份的試劑，存在著不夠經(jīng)濟(jì)合理的缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明專利申請(qǐng)即是針對(duì)目前對(duì)于抗Ul-snRNP抗體的檢測(cè)中存在的上述不足之處，提供一種能夠進(jìn)行獨(dú)立單人份檢測(cè)的試劑裝置及其檢測(cè)方法。本發(fā)明專利申請(qǐng)基于酶聯(lián)免疫檢測(cè)的原理來(lái)實(shí)現(xiàn)抗Ul-snRNP抗體的檢測(cè)，是一種獨(dú)立的、單人份的、一次性的檢驗(yàn)方法；進(jìn)一步的，本發(fā)明申請(qǐng)還提供了與該方法配套的相應(yīng)的試劑裝置，該試劑裝置將抗Ul-snRNP抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)所需要的多種試劑盛裝在一個(gè)獨(dú)立的、多孔結(jié)構(gòu)的試劑裝置內(nèi)，通過(guò)分步加注移棄完成檢測(cè)步驟；進(jìn)一步的，所述的試劑裝置還可以通過(guò)專用的免疫分析儀進(jìn)行相應(yīng)的全自動(dòng)檢測(cè)。本發(fā)明申請(qǐng)的目的之一是提供一種檢測(cè)抗Ul-snRNP抗體的試劑裝置，該目的是通過(guò)下述的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明申請(qǐng)所述的檢測(cè)抗Ul-snRNP抗體的試劑裝置為長(zhǎng)條狀，包括具有八個(gè)孔位的基體和位于基體一端的手柄，八個(gè)孔位的排列順序從近手柄端開(kāi)始依次為樣本孔、輔劑孔、酶結(jié)合物孔、底物孔、終止液孔、稀釋液孔、反應(yīng)孔和稀釋孔，樣本孔內(nèi)盛有待測(cè)樣本，輔劑孔供檢測(cè)有需要時(shí)加入輔助試劑使用，酶結(jié)合物孔內(nèi)盛有酶結(jié)合物溶液，底物孔內(nèi)盛有底物溶液，終止液孔內(nèi)盛有終止液，稀釋液孔內(nèi)盛有稀釋液，反應(yīng)孔為平底且具有高的光通透性,孔內(nèi)包被有Ul-snRNP抗原，并作為反應(yīng)容器加注待測(cè)的液體樣本和檢測(cè)試劑及洗滌液，反應(yīng)終止后進(jìn)行吸光度測(cè)定，稀釋孔作為樣本稀釋容器，供稀釋樣本時(shí)用。進(jìn)一步的，所述的試劑裝置中，輔劑孔、酶結(jié)合物孔、底物孔、終止液孔和稀釋液孔上覆蓋有密封薄膜，該密封薄膜主要起到在運(yùn)輸和移動(dòng)的過(guò)程中防止液體溢出的作用，另夕卜，也起到防塵防污染及增強(qiáng)穩(wěn)定性的作用。進(jìn)一步的，所述的手柄上粘貼有條形碼，該條形碼標(biāo)識(shí)有抗Ul-snRNP抗體檢測(cè)試劑及分析裝置的相關(guān)信息。更進(jìn)一步的，所述的信息包括檢測(cè)項(xiàng)目代碼、檢測(cè)試劑生產(chǎn)批號(hào)、試劑有效期、定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)、酶聯(lián)免疫反應(yīng)類型、試劑及分析裝置的序列號(hào)。進(jìn)一步的，所述試劑裝置還包括若干個(gè)支撐柱，所述的支撐柱位于所述試劑裝置基體的下面，相鄰支撐柱之間間隔有一個(gè)以上的孔位，支撐柱的作用是為了加強(qiáng)基體的機(jī)械強(qiáng)度及平衡性。進(jìn)一步的，所述試劑裝置中反應(yīng)孔由外孔和內(nèi)孔構(gòu)成，外孔的底部開(kāi)有底孔，內(nèi)孔穿過(guò)底孔且與底孔緊配合，外孔和內(nèi)孔之間留有防溢腔，防溢腔的作用是在反應(yīng)過(guò)程中，如果液體溢出，可以留在腔內(nèi)，防止污染儀器和其他試劑裝置。更進(jìn)一步的，所述試劑裝置中反應(yīng)孔的內(nèi)孔包被的U1-snRNP抗原包括天然的Ul-snRNP 或重組的 Ul-snRNP。應(yīng)該明確的是，本發(fā)明申請(qǐng)中，所述試劑裝置中各孔位的大小、形狀并不加以限制，例如各孔位的開(kāi)放口緣可為方形或圓形，其剖面的形狀也可以是方形、“U”型、或“V”型，但對(duì)于反應(yīng)孔來(lái)說(shuō)，為了獲得較好的光通透性，底部應(yīng)為平底。進(jìn)一步的，所述的樣本孔內(nèi)加入的樣本為待測(cè)血清或血漿，加入的量根據(jù)樣本孔的大小和檢測(cè)需要稀釋的倍數(shù)來(lái)確定。所述的輔劑孔是在必要的時(shí)候加入輔助試劑之用，例如吸附劑、中和劑、抑制劑、緩沖液等，以去除檢測(cè)過(guò)程中其他物質(zhì)對(duì)檢測(cè)反應(yīng)及結(jié)果的干擾。所述的酶結(jié)合物孔內(nèi)加入酶結(jié)合物溶液，主要成份為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG、或IgA、或IgM、或Ig(GAM)抗體，堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人IgG、或IgA、或IgM、或Ig (GAM)抗體，葡萄糖氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG、或IgA、或IgM、或Ig(GAM)抗體,或β -半乳糖苷酶標(biāo)記的抗人IgG、或IgA、或IgM、或Ig(GAM)抗體。所述的底物孔中加入的底物溶液主要成份為TMB、OPD或ABTS。TMB作為一種新型安全的色原試劑，已逐步取代強(qiáng)致癌物聯(lián)苯胺和其他致癌性的聯(lián)苯胺衍生物，應(yīng)用于臨床化驗(yàn)、法醫(yī)檢驗(yàn)、刑事偵破及環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域，尤其是在臨床生化檢驗(yàn)方面，TMB作為過(guò)氧化物酶的新底物，在酶免疫分析法(EIA)和酶聯(lián)免疫吸附檢驗(yàn)法(ELISA)中獲得了廣泛的應(yīng)用。所述的終止液孔中加入的終止液主要成份為濃度是0.1 0.5M的硫酸或鹽酸溶液。所述的稀釋液孔中加入的稀釋液主要成份為磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、硼酸鹽緩沖液或碳酸鹽緩沖液，并含一定濃度的牛血清白蛋白、疊氮化鈉等組份，用于排除樣本中小分子物質(zhì)的非特異性反應(yīng)的干擾及增加穩(wěn)定性。本發(fā)明申請(qǐng)的另一個(gè)目的是提供利用上述試劑裝置進(jìn)行抗Ul-snRNP抗體的檢測(cè)方法，所述的方法包括如下的步驟:I)在所述的樣本孔中加入未稀釋的樣本；2)從稀釋液孔中吸取稀釋液加入稀釋孔中；3)移除稀釋液孔中的剩余液體，從稀釋孔中吸取部分液體回稀釋液孔；4)從樣本孔中吸取樣本加入稀釋液孔中，將樣本進(jìn)行稀釋；5)從稀釋液孔中吸取液體加入稀釋孔中，將樣本進(jìn)行進(jìn)一步的稀釋；
6)從稀釋孔中吸取液體加入反應(yīng)孔中，25 37°C的條件下，孵育30 60min ；7)用洗滌液對(duì)反應(yīng)孔進(jìn)行3 5次洗滌后移除液體；8)從酶結(jié)合物孔中吸取酶結(jié)合物溶液加入反應(yīng)孔中，25 37°C的條件下，反應(yīng)30 60min后移除液體；9)重復(fù)步驟7);10)從底物孔中吸取底物溶液加入反應(yīng)孔中，25 37°C的條件下，反應(yīng)10 20min ；11)從終止液孔中吸取終止液加注至反應(yīng)孔中，I IOmin內(nèi)于450nm讀取OD值，或選擇雙波長(zhǎng)法測(cè)定，波長(zhǎng)范圍在620nm 690nm。進(jìn)一步的，所述的方法包括如下的步驟:I)在所述的樣本孔中加入未稀釋的樣本，體積至少為樣本孔容量的1/4 ；2)從稀釋液孔中吸取稀釋液加入稀釋孔中，吸取的量為孔內(nèi)液體總量的7/10以上；3)移除稀釋液孔中的剩余液體，根據(jù)預(yù)期稀釋倍數(shù)從稀釋孔中吸取部分液體回稀釋液孔；4)從樣本孔中吸取樣本加入稀釋液孔中，將樣本進(jìn)行稀釋，稀釋倍數(shù)為I 10倍;5)從稀釋液孔中吸取液體加入稀釋孔中，將樣本進(jìn)行進(jìn)一步的稀釋，稀釋倍數(shù)為I 100倍；6)從稀釋孔中吸取液體加入反應(yīng)孔中，25 37°C的條件下，孵育30 60min ；7)用洗滌液對(duì)反應(yīng)孔進(jìn)行3 5次洗滌后移除液體；8)從酶結(jié)合物孔中吸取酶結(jié)合物溶液加入反應(yīng)孔中，25 37°C的條件下，反應(yīng)30 60min后移除液體；9)重復(fù)步驟7)；10)從底物孔中吸取底物溶液加入反應(yīng)孔中，25 37°C的條件下，反應(yīng)10 20min ；11)從終止液孔中吸取終止液加入反應(yīng)孔中，I IOmin內(nèi)于450nm讀取OD值，或選擇雙波長(zhǎng)法測(cè)定，波長(zhǎng)范圍在620nm 690nm。更進(jìn)一步的，所述的方法包括如下的步驟:I)在所述的樣本孔中加入樣本80 150 μ L ;2)用精密加液器從稀釋液孔中吸取360 μ L液體到稀釋孔中；3)移除稀釋液孔中的剩余液體，從稀釋孔中吸取180 μ L液體回稀釋液孔；4)用精密加液器從樣本孔中吸取20 μ L液體到稀釋液孔中，樣本10倍稀釋；5)用精密加液器從稀釋液孔中吸取液體20 μ L到稀釋孔中，樣本100倍稀釋；6)用精密加液器從稀釋液孔中吸取液體IOOyL到反應(yīng)孔中，25 37°C下，孵育60min后移除液體；7)用洗滌液對(duì)反應(yīng)孔進(jìn)行3 5次洗滌后移除液體；8)用精密加液器從酶結(jié)合物孔中吸取100 μ L辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體酶結(jié)合物溶液至反應(yīng)孔進(jìn)行反應(yīng)，25 37°C下，反應(yīng)30min后移除液體；
9)重復(fù)步驟7)；10)用精密加液器從底物孔中吸取100 μ L的TMB底物溶液至反應(yīng)孔中反應(yīng)10 15min ；11)用精密加液器從終止液孔中吸取100 μ L的終止液加注至反應(yīng)孔中，I IOmin內(nèi)于450nm和630nm雙波長(zhǎng)條件下進(jìn)行檢測(cè)，讀取OD值。所述的洗滌液包括PBST溶液，PBST溶液是指PBS溶液加上Tween-20，PBS溶液是指磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer Solution),滲透壓近似于生理?xiàng)l件,又有很強(qiáng)的pH緩沖能力，常用來(lái)洗細(xì)胞和作為細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)液，而Tween-20為一種非離子表面活性劑，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)可產(chǎn)生影響，Tween-20有復(fù)性抗原的作用，可提高特異性的識(shí)別能力。本發(fā)明申請(qǐng)所述測(cè)定抗Ul-snRNP抗體的試劑裝置及其方法，不但具有其他檢測(cè)方法所具有的特異性強(qiáng)、靈敏度高，準(zhǔn)確性好、成本較低、使用要求不高、操作較為簡(jiǎn)便、獲得檢測(cè)結(jié)果時(shí)間短、應(yīng)用廣泛等的優(yōu)點(diǎn)，而且解決了其他檢測(cè)方法的諸多不足，具體體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:1.所述的檢測(cè)方法運(yùn)用酶聯(lián)免疫分析原理，利用特定的分析儀器，采用配套專用的檢測(cè)試劑盒及分析試劑裝置，自動(dòng)實(shí)現(xiàn)抗Ul-snRNP抗體定量測(cè)定，是一種全新的、適用的、實(shí)用的、高效的、快速的檢測(cè)抗Ul-snRNP抗體的方案；2.它是一種獨(dú)立的、單人份的檢測(cè)試劑及分析裝置，無(wú)需像通用ELISA法那樣使用12X8型、6X8型、8X 12型或整板型96孔專用酶聯(lián)免疫微孔板作為抗原包被用品和反應(yīng)容器，在使用時(shí)只要有一份樣本即可進(jìn)行對(duì)應(yīng)項(xiàng)目的檢測(cè)而無(wú)試劑的浪費(fèi)，如果樣本的數(shù)量超過(guò)一份，按實(shí)際樣本數(shù)使用該試劑及分析裝置即可；3.它將每一檢測(cè)必需的試劑盛裝在一個(gè)分析試劑裝置的試劑孔位內(nèi)，而無(wú)須將檢測(cè)試劑分別用不同的試劑瓶來(lái)盛裝，不但操作極為簡(jiǎn)便，而且不容易造成操作差錯(cuò)，從而保證檢測(cè)結(jié)果的正確性；4.它對(duì)每一個(gè)分析試劑裝置都有一個(gè)專用條形碼，條形碼的數(shù)值包含檢測(cè)所對(duì)應(yīng)的檢測(cè)項(xiàng)目代碼、檢測(cè)試劑生產(chǎn)批號(hào)、試劑有效期、定量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)、具體的酶聯(lián)免疫反應(yīng)類型、試劑及分析裝置的序列號(hào)等信息，不能隨意被改變，使用時(shí)嚴(yán)格受控，尤其是在使用超過(guò)有效期檢測(cè)試劑時(shí)，將被識(shí)別并阻止發(fā)出檢測(cè)報(bào)告，從而可以確保檢測(cè)的準(zhǔn)確性；5.它將每一檢測(cè)試劑進(jìn)行有效分隔和密封，不會(huì)引起各種試劑之間的交叉污染而影響檢測(cè)結(jié)果；6.它是一種專用于特定分析儀器的分析試劑裝置，在檢測(cè)過(guò)程中用全自動(dòng)的精密加液器來(lái)加注檢測(cè)試劑、洗滌液或樣本，操作自動(dòng)化，加量精確，檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密
度高；7.在檢測(cè)項(xiàng)目成套試劑的數(shù)量配置及使用上，一切按實(shí)際使用需要來(lái)進(jìn)行配備即可，尤其是在對(duì)多項(xiàng)目檢測(cè)上，配備更為適量，不會(huì)出現(xiàn)超配置及使用情況。


圖1是本發(fā)明申請(qǐng)所述試劑裝置的一個(gè)實(shí)施例的剖面結(jié)構(gòu)示意圖；圖2是圖1所述實(shí)施例的平面俯視圖3是本發(fā)明申請(qǐng)所述試劑裝置的另一個(gè)實(shí)施例的剖面結(jié)構(gòu)示意圖；圖4是本發(fā)明申請(qǐng)所述試劑裝置的再一個(gè)實(shí)施例中反應(yīng)孔的平面俯視圖；圖5和圖6是圖4所述試劑裝置中反應(yīng)孔中內(nèi)孔和外孔的裝配示意圖；其中，10為基體、20為手柄、30為條形碼、40為密封薄膜、50為支撐柱、11為樣本孔、12為輔劑孔、13為酶結(jié)合物孔、14為底物孔、15為終止液孔、16為稀釋液孔、17為反應(yīng)孔、18為稀釋孔、171為外孔、172為內(nèi)孔、173為防溢腔、174為底孔。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體的檢測(cè)裝置與實(shí)施步驟對(duì)本發(fā)明申請(qǐng)所述的試劑裝置和檢測(cè)方法進(jìn)行進(jìn)一步的描述，目的是為了公眾更好的理解本發(fā)明申請(qǐng)所述的技術(shù)方案，而不是對(duì)所述技術(shù)方案的限制。事實(shí)上，以相同或近似的原理，對(duì)所述試劑裝置進(jìn)行的改進(jìn)，包括其形狀、尺寸、所用材質(zhì)的改變，以及相應(yīng)結(jié)構(gòu)的增減或替換，都在本發(fā)明申請(qǐng)所要求保護(hù)的技術(shù)方案之內(nèi)。實(shí)施例一檢測(cè)抗Ul-snRNP抗體的試劑裝置一如圖1-2所示，本發(fā)明申請(qǐng)所述的檢測(cè)抗Ul-snRNP抗體的試劑裝置為長(zhǎng)條狀，包括具有八個(gè)孔位的基體10和位于基體10 —端的手柄20，八個(gè)孔位的排列順序從近手柄10端開(kāi)始依次為樣本孔11、輔劑孔12、酶結(jié)合物孔13、底物孔14、終止液孔15、稀釋液孔16、反應(yīng)孔17和稀釋孔18，所述的樣本孔11內(nèi)盛有待測(cè)樣本，輔劑孔12供檢測(cè)需要時(shí)加入輔助試劑使用，在本發(fā)明申請(qǐng)所述的檢測(cè)方法中輔劑孔12內(nèi)未加入任何試劑，酶結(jié)合物孔13內(nèi)加入酶結(jié)合物溶液，底物孔14內(nèi)加入底物溶液，終止液孔15加入終止液，稀釋液孔16內(nèi)加入稀釋液，反應(yīng)孔17為平底并具有很高的光通透性，當(dāng)盛裝無(wú)色或空白試劑溶液時(shí)，對(duì)可見(jiàn)光或紫外光或熒光的吸光度值接近于零，孔內(nèi)已包被有高度純化的Ul-snRNP抗原，并作為反應(yīng)容器加注待測(cè)的液體樣本和檢測(cè)試劑及洗滌液，反應(yīng)終止后進(jìn)行吸光度測(cè)定，稀釋孔18作為樣本稀釋容器，供稀釋樣本時(shí)用。進(jìn)一步的，所述的試劑裝置中，輔劑孔12、酶結(jié)合物孔13、底物孔14、終止液孔15和稀釋液孔16上覆蓋有密封薄膜40，該密封薄膜40主要起到在運(yùn)輸和移動(dòng)的過(guò)程中，防止液體溢出的作用，另外，也起到防塵防污染及增加穩(wěn)定性的作用。進(jìn)一步的，所述的手柄20上粘貼有條形碼30，該條形碼30標(biāo)識(shí)有抗Ul-snRNP抗體檢測(cè)試劑及分析裝置的信息，所述的信息包括檢測(cè)項(xiàng)目代碼、檢測(cè)試劑生產(chǎn)批號(hào)、試劑有效期、定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)、酶聯(lián)免疫反應(yīng)類型、試劑及分析裝置的序列號(hào)。實(shí)施例二檢測(cè)抗Ul-snRNP抗體的試劑裝置二如圖3所示，本實(shí)施例中的檢測(cè)抗Ul-snRNP抗體的試劑裝置，其基本結(jié)構(gòu)與實(shí)施例一中的試劑裝置相同，在所述試劑裝置還包括若干個(gè)支撐柱50，所述的支撐柱50位于所述試劑裝置中基體10的下面，相鄰支撐柱50之間間隔有一個(gè)以上的孔位，支撐柱50的作用是為了加強(qiáng)基體的機(jī)械強(qiáng)度及平衡性。實(shí)施例三檢測(cè)抗Ul-snRNP抗體的試劑裝置三如圖4-6所示，為本發(fā)明申請(qǐng)所述檢測(cè)抗Ul-snRNP抗體的試劑裝置的優(yōu)選的實(shí)施例，其基本結(jié)構(gòu)與實(shí)施例一或?qū)嵤├嗤?，區(qū)別在于反應(yīng)孔17為可拆卸式的結(jié)構(gòu)，反應(yīng)孔17由外孔171和內(nèi)孔172構(gòu)成，外孔171的底部開(kāi)有底孔174，內(nèi)孔172穿過(guò)底孔174且與底孔174緊配合，外孔171和內(nèi)孔172之間留有防溢腔173，防溢腔173的作用是在反應(yīng)過(guò)程中，如果液體溢出，可以留在腔內(nèi)，防止污染儀器和其他試劑裝置。進(jìn)一步的，所述內(nèi)孔和外孔的配合固定方式還可以是將內(nèi)孔的外壁設(shè)計(jì)為兩段，上段外壁的厚度大于下段外壁的厚度，外孔的底孔的直徑與內(nèi)孔下段的外徑相等，這樣將內(nèi)孔下段插入底孔中，內(nèi)孔的上段恰好卡在底孔之上，同樣可以起到緊固的效果。實(shí)施例四試劑裝置或試劑盒的制作一間接法檢測(cè)抗Ul-snRNP抗體本發(fā)明是基于酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)上的一種更加簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、有效的一套方法，其采用的基本原理為間接酶聯(lián)免疫法:將由高度純化的Ul-snRNP抗原吸附于固相上，通過(guò)孵育使稀釋的人血清或血漿中的特異性抗體與抗原結(jié)合，洗滌去除未與固相結(jié)合的抗體，加入用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人免疫球蛋白酶聯(lián)物，孵育，去除未結(jié)合的酶聯(lián)物，加入酶色原底物，產(chǎn)生的顏色與檢測(cè)樣本中的特異性抗體濃度成正比。這種方法主要是通過(guò)用于酶聯(lián)免疫檢測(cè)的分析試劑裝置和配套試劑來(lái)實(shí)現(xiàn)抗Ul-snRNP抗體的免疫檢測(cè)。通過(guò)這種酶聯(lián)免疫方法，同時(shí)運(yùn)用特定分析儀器的分析試劑裝置和試劑，可快速，準(zhǔn)確的做出判斷用于輔助臨床診斷。以孔位11作為樣本孔，在使用時(shí)加入液體樣本，供檢測(cè)時(shí)取用；以孔位12作為輔劑孔，用密封薄膜封口，供檢測(cè)備用；以孔位13作為酶結(jié)合物孔，加入酶結(jié)合物溶液用密封薄膜封口，供檢測(cè)時(shí)取用；以孔位14作為底物孔，加入TMB底物溶液后用密封薄膜封口，供檢測(cè)時(shí)用；以孔位15作為終止液孔，加入終止液后用密封薄膜封口，供檢測(cè)時(shí)用；以孔位16作為稀釋液孔，加入樣本稀釋液后用密封薄膜封口，供檢測(cè)時(shí)用；以孔位17作為包被物孔/反應(yīng)孔/比色孔，已包被有高度純化的Ul-snRNP抗原，并作為反應(yīng)容器加注待測(cè)的液體樣本和檢測(cè)試劑及洗滌液，反應(yīng)終止后進(jìn)行吸光度測(cè)定；以孔位18作為稀釋孔，供稀釋樣本時(shí)用；在手柄20粘貼有抗Ul-snRNP抗體檢測(cè)試劑及分析裝置信息的條形碼30，該條形碼包括檢測(cè)項(xiàng)目代碼、檢測(cè)試劑生產(chǎn)批號(hào)、試劑有效期、定量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)、酶聯(lián)免疫反應(yīng)類型、試劑及分析裝置的序列號(hào)。按照上述方法制備若干分析裝置，另外制備相應(yīng)的校準(zhǔn)品和質(zhì)控物。這樣即構(gòu)成了完整的抗Ul-snRNP抗體測(cè)定試劑盒組份。將檢測(cè)抗Ul-snRNP抗體的試劑裝置及配套使用組份裝入試劑盒的外包裝盒，即制成檢測(cè)抗Ul-snRNP抗體試劑盒。實(shí)施例五抗Ul-snRNP抗體IgG的檢測(cè)方法本發(fā)明申請(qǐng)?zhí)峁┮环N利用上述試劑裝置進(jìn)行抗Ul-snRNP抗體IgG檢測(cè)的方法，所述的方法包括如下的步驟:1.在所述的樣本孔中加入樣本80 150 μ L ;2.用精密加液器從稀釋液孔中吸取360 μ L液體到稀釋孔中；3.移除稀釋液孔中的剩余液體，從稀釋孔中吸取180 μ L液體回稀釋液孔；4.用精密加液器從樣本孔中吸取20 μ L液體到稀釋液孔中，樣本10倍稀釋；5.用精密加液器從稀釋液孔中吸取液體20 μ L到稀釋孔中，樣本100倍稀釋；6.用精密加液器從稀釋液孔中吸取液體100μ L到反應(yīng)孔中，25°C下，孵育60min后移除液體；
7.用洗滌液對(duì)反應(yīng)孔進(jìn)行3 5次洗滌后移除液體；8.用精密加液器從酶結(jié)合物孔中吸取100 μ L辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG抗體酶結(jié)合物溶液至反應(yīng)孔進(jìn)行反應(yīng)，25°C下,反應(yīng)30min后移除液體；9.重復(fù)步驟7;10.用精密加液器從底物孔中吸取100 μ L的TMB底物溶液至反應(yīng)孔中反應(yīng)10 15min ；11.用精密加液器從終止液孔中吸取100 μ L的終止液加注至反應(yīng)孔中，I IOmin內(nèi)于450nm和630nm雙波長(zhǎng)條件下進(jìn)行檢測(cè)，讀取OD值。實(shí)施例六通過(guò)全自動(dòng)分析儀實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本中抗Ul-snRNP抗體IgG檢測(cè)的分析操作流程進(jìn)一步的，本發(fā)明申請(qǐng)所述的檢測(cè)方法還包括相應(yīng)配合使用的全自動(dòng)分析儀，該全自動(dòng)分析儀包括一個(gè)分析裝置托盤，它是與分析裝置的形狀相配套的，一共有30個(gè)位置可供分析裝置放置，用于檢測(cè)分析，此外還包括模塊式集成機(jī)械電子結(jié)構(gòu)及軟件控制系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的加注、稀釋、孵育、洗滌、讀數(shù)、分析過(guò)程。每個(gè)位置獨(dú)立定量分析，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。儀器運(yùn)行后，分析裝置托盤會(huì)自行轉(zhuǎn)動(dòng)到不同的位置進(jìn)行加注，稀釋，孵育，洗滌以及讀數(shù)的步驟。具體的操作包括如下的步驟:(I)檢查程序的準(zhǔn)備:按要求配置好相應(yīng)的溶液，包括洗滌緩沖液，清洗液或消毒液，配制完畢裝入相應(yīng)的液體瓶中；(2)與外接計(jì)算機(jī)相連:儀器和外接計(jì)算機(jī)相連，從而將儀器正常工作所得結(jié)果交由集中式系統(tǒng)處理；(3)開(kāi)機(jī):打開(kāi)儀器開(kāi)關(guān)后，通過(guò)外接計(jì)算機(jī)的工作界面對(duì)儀器設(shè)置自動(dòng)或手動(dòng)自檢，從而為儀器的正常運(yùn)行做準(zhǔn)備；(4)預(yù)熱:在開(kāi)機(jī)后，儀器會(huì)啟動(dòng)加熱程序，將溫度調(diào)至待檢溫度；(5)沖洗檢查；(6)抗 Ul-snRNP 抗體 IgG 的檢測(cè):I)從有密封口的一邊打開(kāi)包裝袋，取用所需數(shù)量的分析試劑裝置，排除空氣后將袋口封緊；2)檢查分析試劑裝置TMB底物孔中的溶液，應(yīng)為無(wú)色澤改變，否則應(yīng)棄掉；3)分別在每個(gè)分析試劑裝置的樣本孔中加50 120 μ L未稀釋的樣本，建議加100 μ L的樣本，每更換一個(gè)批號(hào)的試劑，應(yīng)取其中一個(gè)分析試劑裝置及校準(zhǔn)品進(jìn)行儀器校準(zhǔn)；4)按照所需檢測(cè)的數(shù)量在分析裝置托盤中放入相對(duì)應(yīng)數(shù)量的分析試劑裝置，點(diǎn)擊“開(kāi)始”、“掃描”，儀器可自動(dòng)地掃描分析試劑裝置條碼、質(zhì)控物條碼和校準(zhǔn)品條碼，然后對(duì)樣本進(jìn)行編號(hào)，或通過(guò)外部條碼掃描儀對(duì)樣本條碼進(jìn)行掃描；5)點(diǎn)擊“運(yùn)行”，儀器根據(jù)條碼信息自動(dòng)運(yùn)行，根據(jù)條碼，程序首先檢測(cè)校準(zhǔn)品，通過(guò)校準(zhǔn)，修正標(biāo)準(zhǔn)曲線；其次對(duì)質(zhì)控物進(jìn)行檢測(cè)，如果其檢測(cè)結(jié)果在標(biāo)示的范圍內(nèi)，則表示檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線符合要求，可用于樣本的檢測(cè)，最后開(kāi)始樣本的檢測(cè)程序；6)稀釋:加注針刺破孔位密封薄膜自動(dòng)吸取稀釋液360 μ L到稀釋孔中，并移除稀釋液孔中的剩余液體，再?gòu)南♂尶字形∠♂屢?80μ L回稀釋液孔，加注針從樣本孔自動(dòng)吸取樣品20 μ L到稀釋液孔進(jìn)行樣本稀釋，再?gòu)南♂屢嚎字形?0 μ L到稀釋孔，動(dòng)作完成后，被稀釋的樣本被加注針移至反應(yīng)孔孵育30 60min，通常儀器設(shè)定為60min，之后移除液體；7)洗滌:沖洗針從相應(yīng)的液瓶中吸取一定量的洗滌緩沖液對(duì)試劑孔進(jìn)行三到五次洗滌后移除液體；8)加注針刺破酶結(jié)合物孔密封薄膜吸取IOOyL辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG抗體酶結(jié)合物溶液至反應(yīng)孔進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)30 60min后移除液體，通常儀器設(shè)定為30min ；9)重復(fù)步驟7);10)加注針刺破TMB底物孔密封薄膜吸取100 μ L的TMB底物溶液至反應(yīng)孔反應(yīng)10 20min,通常儀器設(shè)定為IOmin ；11)加注針刺破終止液孔密封薄膜吸取100 μ L的終止液加注至反應(yīng)孔，在I IOmin內(nèi)于450nm/630nm雙波長(zhǎng)下讀取OD值。(7)檢測(cè)結(jié)果:當(dāng)檢測(cè)程序運(yùn)行完畢，可通過(guò)計(jì)算機(jī)上的數(shù)據(jù)處理軟件分析，最后生成報(bào)告單以便查閱；(8)關(guān)機(jī):檢測(cè)結(jié)束后，在儀器關(guān)機(jī)前，必須啟動(dòng)清洗循環(huán)，這樣可以避免來(lái)自溶液中的殘留鹽份在液路中結(jié)晶，避免損壞儀器或?qū)е聶z測(cè)結(jié)果無(wú)效，清洗完成后，儀器電源自動(dòng)關(guān)閉。實(shí)施例七患者樣本中抗Ul-snRNP抗體IgG的檢測(cè)應(yīng)用、結(jié)果分析以及檢測(cè)的質(zhì)控采用實(shí)施例五的操作方法與程序，使用實(shí)施例四所述的試劑盒，可用于定量測(cè)定人血清或血漿中的抗Ul-snRNP抗體IgG水平。MCTD發(fā)病年齡從4歲到80歲，大多數(shù)患者在30_40歲左右出現(xiàn)癥狀，女性多見(jiàn)，占80%。其患者血清中可以檢測(cè)到極高滴度的抗Ul-snRNP抗體?？筛鶕?jù)檢測(cè)的結(jié)果來(lái)輔助臨床診斷,初步判斷患者患病的情況，最終確診應(yīng)結(jié)合臨床表現(xiàn)或其他診斷方法/指標(biāo)進(jìn)行綜合考慮。以下為檢測(cè)結(jié)果的分析:(I)參考值(參考范圍)陰性參考值:<10AU/mL ；各實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)實(shí)際情況建立適宜的參考范圍。(2)檢測(cè)結(jié)果的解釋若樣本檢測(cè)值> 10AU/mL，提示抗Ul-snRNP抗體水平升高，應(yīng)結(jié)合臨床或其他診斷方法/指標(biāo)進(jìn)行診斷。以下是將實(shí)施例六的檢測(cè)過(guò)程重復(fù)檢測(cè)陽(yáng)性和陰性質(zhì)控血清，檢查結(jié)果的再現(xiàn)性，獲得如下的結(jié)果:
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)抗Ul-SnRNP抗體的試劑裝置，其特征在于:所述的試劑裝置為長(zhǎng)條狀，包括具有八個(gè)孔位的基體和位于基體一端的手柄，八個(gè)孔位的排列順序從近手柄端開(kāi)始依次為樣本孔、輔劑孔、酶結(jié)合物孔、底物孔、終止液孔、稀釋液孔、反應(yīng)孔和稀釋孔，樣本孔內(nèi)盛有待測(cè)樣本，輔劑孔供檢測(cè)有需要時(shí)加入輔助試劑使用，酶結(jié)合物孔內(nèi)盛有酶結(jié)合物溶液，底物孔內(nèi)盛有底物溶液，終止液孔內(nèi)盛有終止液，稀釋液孔內(nèi)盛有稀釋液，反應(yīng)孔為平底且具有高的光通透性，孔內(nèi)包被有Ul-snRNP抗原，并作為反應(yīng)容器加注待測(cè)的液體樣本和檢測(cè)試劑及洗滌液，反應(yīng)終止后進(jìn)行吸光度測(cè)定，稀釋孔作為樣本稀釋容器，供稀釋樣本時(shí)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑裝置，其特征在于:所述的試劑裝置中，輔劑孔、酶結(jié)合物孔、底物孔、終止液孔和稀釋液孔上覆蓋有密封薄膜。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑裝置，其特征在于:所述的手柄上粘貼有條形碼，該條形碼標(biāo)識(shí)有抗Ul-snRNP抗體檢測(cè)試劑及分析裝置的相關(guān)信息。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑裝置，其特征在于:所述的信息包括檢測(cè)項(xiàng)目代碼、檢測(cè)試劑生產(chǎn)批號(hào)、試劑有效期、定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)、酶聯(lián)免疫反應(yīng)類型、試劑及分析裝置的序列號(hào)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑裝置，其特征在于:所述試劑裝置還包括若干個(gè)支撐柱，所述的支撐柱位于所述試劑裝置中基體的下面，相鄰支撐柱之間間隔有一個(gè)以上的孔位。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑裝置，其特征在于:所述試劑裝置中反應(yīng)孔由外孔和內(nèi)孔構(gòu)成，外孔的底部開(kāi)有底孔，內(nèi)孔穿過(guò)底孔且與底孔緊配合，外孔和內(nèi)孔之間留有防溢腔。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑裝置，其特征在于:所述試劑裝置中反應(yīng)孔的內(nèi)孔包被的Ul-snRNP抗原包括天然的Ul-snRNP或重組的Ul-snRNP。
8.一種利用權(quán)利要求1-7所述的試劑裝置進(jìn)行抗Ul-snRNP抗體檢測(cè)的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步驟: 1)在所述的樣本孔中加入未稀釋的樣本； 2)從稀釋液孔中吸取稀釋液加入稀釋孔中； 3)移除稀釋液孔中的剩余液體，從稀釋孔中吸取部分液體回稀釋液孔； 4)從樣本孔中吸取樣本加入稀釋液孔中,將樣本進(jìn)行稀釋； 5)從稀釋液孔中吸取液體加入稀釋孔中，將樣本進(jìn)行進(jìn)一步的稀釋； 6)從稀釋孔中吸取液體加入反應(yīng)孔中，25 37°C的條件下，孵育30 60min； 7)用洗滌液對(duì)反應(yīng)孔進(jìn)行3 5次洗滌后移除液體； 8)從酶結(jié)合物孔中吸取酶結(jié)合物溶液加入反應(yīng)孔中，25 37°C的條件下，反應(yīng)30 60min后移除液體； 9)重復(fù)步驟7)； 10)從底物孔中吸取底物溶液加入反應(yīng)孔中，25 37°C的條件下，反應(yīng)10 20min； 11)從終止液孔中吸取終止液加入反應(yīng)孔中，I IOmin內(nèi)于450nm讀取OD值，或選擇雙波長(zhǎng)法測(cè)定，波長(zhǎng)范圍在620nm 690nm。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步驟:1)在所述的樣本孔中加入未稀釋的樣本，體積至少為樣本孔容量的1/4； 2)從稀釋液孔中吸取稀釋液加入稀釋孔中，吸取的量為孔內(nèi)液體總量的7/10以上； 3)移除稀釋液孔中的剩余液體，根據(jù)預(yù)期稀釋倍數(shù)從稀釋孔中吸取部分液體回稀釋液孔； 4)從樣本孔中吸取樣本加入稀釋液孔中，將樣本進(jìn)行稀釋，稀釋倍數(shù)為I 10倍； 5)從稀釋液孔中吸取液體加入稀釋孔中，將樣本進(jìn)行進(jìn)一步的稀釋，稀釋倍數(shù)為I 100倍； 6)從稀釋孔中吸取液體加入反應(yīng)孔中，25 37°C的條件下，孵育30 60min； 7)用洗滌液對(duì)反應(yīng)孔進(jìn)行3 5次洗滌后移除液體； 8)從酶結(jié)合物孔中吸取酶結(jié)合物溶液加入反應(yīng)孔中，25 37°C的條件下，反應(yīng)30 60min后移除液體； 9)重復(fù)步驟7)；10)從底物孔中吸取底物溶液加入反應(yīng)孔中，25 37°C的條件下，反應(yīng)10 20min； 11)從終止液孔中吸取終止液加入反應(yīng)孔中，I IOmin內(nèi)于450nm讀取OD值，或選擇雙波長(zhǎng)法測(cè)定，波長(zhǎng)范圍在620nm 690nm。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步驟: 1)在所述的樣本孔中 加入樣本80 150μ L ; 2)用精密加液器從稀釋液孔中吸取360μ L液體到稀釋孔中； 3)移除稀釋液孔中的剩余液體，從稀釋孔中吸取ISOyL液體回稀釋液孔； 4)用精密加液器從樣本孔中吸取20μ L液體到稀釋液孔中，樣本10倍稀釋； 5)用精密加液器從稀釋液孔中吸取液體20μ L到稀釋孔中，樣本100倍稀釋； 6)用精密加液器從稀釋液孔中吸取液體100μ L到反應(yīng)孔中，25 37°C下，孵育60min后移除液體； 7)用洗滌液對(duì)反應(yīng)孔進(jìn)行3 5次洗滌后移除液體； 8)用精密加液器從酶結(jié)合物孔中吸取100μ L辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體酶結(jié)合物溶液至反應(yīng)孔進(jìn)行反應(yīng)，25 37°C下，反應(yīng)30min后移除液體； 9)重復(fù)步驟7)； 10)用精密加液器從底物孔中吸取IOOyL的TMB底物溶液至反應(yīng)孔中反應(yīng)10 15min ； 11)用精密加液器從終止液孔中吸取100μ L的終止液加注至反應(yīng)孔中，I IOmin內(nèi)于450nm和630nm雙波長(zhǎng)條件下進(jìn)行檢測(cè)，讀取OD值。
全文摘要
本發(fā)明申請(qǐng)公開(kāi)一種檢測(cè)抗U1-snRNP抗體的試劑裝置及其方法，所述的試劑裝置為長(zhǎng)條狀，包括具有八個(gè)孔位的基體和位于基體一端的手柄，八個(gè)孔位的排列順序從近手柄端開(kāi)始依次為樣本孔、輔劑孔、酶結(jié)合物孔、底物孔、終止液孔、稀釋液孔、反應(yīng)孔和稀釋孔。本發(fā)明申請(qǐng)基于酶聯(lián)免疫檢測(cè)的原理，利用上述的試劑裝置對(duì)抗U1-snRNP抗體進(jìn)行檢測(cè)，是一種獨(dú)立的、單人份的分析檢測(cè)方法，并且可以與相應(yīng)的特定分析儀器配合使用，在檢測(cè)過(guò)程中，用全自動(dòng)的精密加液器來(lái)加注檢測(cè)試劑或樣本，具有操作自動(dòng)化，加量精確，檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度高的優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)G01N33/543GK103185780SQ201110451790
公開(kāi)日2013年7月3日 申請(qǐng)日期2011年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月30日
發(fā)明者胡德明, 劉清波, 何林, 陽(yáng)輝 申請(qǐng)人:深圳市亞輝龍生物科技有限公司