專利名稱：一種量子點熒光免疫層析高靈敏定量檢測的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以優(yōu)選材料為基礎(chǔ)，利用熒光量子點標(biāo)記配體實現(xiàn)分析物定量檢測的方法，特別公開了一種高靈敏量子點熒光免疫層析方法，可實現(xiàn)病原體、重大疾病(如腫瘤、心血管疾病)、違禁藥品、毒品檢測、食品安全等多種分析物的半定量與定量檢測，屬于熒光免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
免疫層析(immunochromatography)是近十年來興起的一種快速診斷技術(shù)，以雙抗體夾心法為例，其原理是將特異的抗體先固定于層析膜(如硝酸纖維素膜)的某一區(qū)帶， 當(dāng)該干燥的層析膜一端滴加樣本(尿液或血清)后，由于毛細作用，樣本將沿著該膜向前移動，當(dāng)移動至固定有抗體的區(qū)域時，樣本中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合，若用免疫膠體金或免疫酶染色可使該區(qū)域顯示一定的顏色，從而實現(xiàn)特異性的免疫診斷。免疫層析試紙條具有精確、快速和操作簡單等優(yōu)點。膠體金免疫層析技術(shù)已經(jīng)在臨床檢驗中得到了廣泛應(yīng)用，其基本原理是通過膠體金標(biāo)記物與分析物及包被抗體或抗原反應(yīng)形成膠體金本身的顏色(紅色)，可通過肉眼觀察檢測結(jié)果。但是對于某些抗原或抗體含量極低的樣本，膠體金的顏色很淺且很難用肉眼來判斷結(jié)果，靈敏度低。也有根據(jù)檢測帶結(jié)合的膠體金的數(shù)量不同，其所對應(yīng)的吸光度不一致，而進行定量檢測，如中國專禾U 201010132561. 9,200910090040. 9,200910090041. 3 等基于膠體金分別對HCG、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌腸毒素B等進行了定量檢測；中國專利 03137101. 9描述了膠體金免疫層析定量檢測裝置及定量方法。美國專利US60/576327和 60/592202，及其在中國申請的專利200580025931. 6都對免疫層析定量檢測進行了論述。 但相比于熒光檢測，吸光度檢測具有靈敏度低、線性范圍窄等缺陷。量子點(QDs)又叫半導(dǎo)體納米晶，通常是由II VI族或III V族元素組成的穩(wěn)定的、尺寸介于1 20nm之間的納米微晶體，是20世紀(jì)90年代發(fā)展的一種具有優(yōu)良光譜特性和光化學(xué)穩(wěn)定性的生物熒光標(biāo)記物。其具有許多優(yōu)良的光學(xué)特性(1)量子點的熒光發(fā)射光譜窄而對稱，熒光發(fā)射波長可調(diào)，且覆蓋范圍可從紫外到近紅外區(qū)。( 量子點的吸收光譜寬且連續(xù)，可實現(xiàn)一元激發(fā)，多元發(fā)射，適合于多色標(biāo)記。(3)量子點具有較強的光學(xué)穩(wěn)定性。Cdk/ZnS量子點的光穩(wěn)定性是羅丹明6G的100倍以上。(4)量子點摩爾吸光系數(shù)可以高達IO6L/(mol · cm)，且熒光量子產(chǎn)率高(50 80% )，因而可產(chǎn)生較強熒光信號。
(5)量子點斯托克斯位移較大，熒光壽命長OO 50ns)，使得信號可以顯著區(qū)分于背景和其它熒光基團。量子點是一種理想的應(yīng)用于超靈敏和多組分生物化學(xué)分析的熒光探針，在熒光免疫分析和多組分檢測、免疫示蹤分子定位、納米生物傳感器、實時檢測、細胞成像、體內(nèi)成像、疾病診斷等方面具有獨特的作用和廣泛應(yīng)用前景。根據(jù)文獻報道，量子點作為新一代生物熒光標(biāo)記物，具有取代傳統(tǒng)有機染料的潛力。針對膠體金試紙條的不足和缺陷，量子點熒光定量檢測方法利用量子點多波長激發(fā)、高強度熒光強度、發(fā)射峰窄、峰形對稱、發(fā)光穩(wěn)定性好的熒光特性，可提供一種量子點標(biāo)記快速免疫層析試紙條的檢測方法，對分析物進行熒光定量檢測。本方法只需改變量子點的粒徑或種類，就可得到不同波長的熒光，用不同類型的量子點標(biāo)記不同的抗體，可產(chǎn)生多色熒光，實現(xiàn)多組分的檢測，方法簡單快速，靈敏度高。中國專禾Ij 200810041133. 8,200810186010. 3,200810227473. X，200810204008. 4， 200810123521. 0，201010234498. X，201010033615. 6，201010206479. 6 等對量子點用于試紙
條進行了描述，但出發(fā)點主要在利用基于量子點的基本熒光特性，利用特定抗原抗體對特定物質(zhì)進行檢測，但均未考慮量子點及試紙條各組件對檢測的影響，且未闡述熒光定量檢測概念及具體方法。而現(xiàn)有定性及定量試紙條多對熒光檢測有較大的影響。故現(xiàn)有定量試紙條主要存在如下缺點1)膠體金定量試紙條靈敏度低，線性范圍窄。2)常用試紙條組件(如層析膜、底板、扣卡等)均有較強熒光背景，對量子點熒光信號的檢測有很大的干擾。3)常用試紙條組件在550nm以下有較明顯的熒光噪聲，故處于此范圍的量子點較難與背景噪聲區(qū)分，很難達到很低的檢測下限。4)量子點免疫層析檢測，大多依據(jù)檢測帶(T線)信號定性判定陰陽性，而未能準(zhǔn)確定量分析物濃度，且沒有把質(zhì)控帶當(dāng)做內(nèi)質(zhì)控信號，對檢測帶進行校正。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題為針對現(xiàn)有免疫層析技術(shù)中背景與信號難區(qū)分、靈敏度低、熒光定量方法不明確的問題，提供一種量子點熒光免疫層析方法，從而實現(xiàn)對樣本中分析物的高靈敏半定量與定量檢測。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為步驟1)合成熒光發(fā)射波長范圍為550 1300nm的量子點納米顆粒；步驟2、用化學(xué)交聯(lián)或生物分子間特異性作用將分析物對應(yīng)的配體和質(zhì)控分子連接到量子點表面，得到配體修飾的量子點和質(zhì)控分子修飾的量子點；步驟幻將步驟2~)得到的兩種量子點標(biāo)記物固定在標(biāo)記墊，在層析膜上設(shè)有定量帶和質(zhì)控帶，其中質(zhì)控帶固定有能與質(zhì)控分子特異性結(jié)合的生物分子，定量帶固定有能與分析物結(jié)合或與步驟幻所述配體競爭結(jié)合分析物的配體；步驟4)以樣品墊、標(biāo)記墊、層析膜、吸水墊、底板和扣卡構(gòu)建成熒光免疫層析試紙條，其中層析膜為弱熒光層析膜，底板和扣卡具有低熒光特性；步驟幻試紙條免疫層析，樣本流經(jīng)定量帶和質(zhì)控帶后，檢測定量帶和質(zhì)控帶熒光信號強度，并以質(zhì)控帶熒光信號強度校正定量帶熒光信號強度，進而實現(xiàn)分析物的定量檢測。本發(fā)明提供的量子點熒光免疫層析高靈敏定量檢測的方法是一種以量子點為熒光信號的、在免疫層析試紙條上實現(xiàn)分析物快速靈敏檢測的新方法。這種方法是將分析物的配體(如抗原、抗體等)修飾量子點，分析物的另一配體固定在層析膜上，利用配體作用，如雙抗體夾心法原理結(jié)合量子點的熒光性質(zhì)檢測樣本中是否含有分析物。本發(fā)明層析試紙條用于定量樣本中的至少一種分析物。分析物包括小分子(藥物和毒品)、抗原、抗體、激素、抗生素、細菌和病毒及其他生化標(biāo)志物。其中小分子包含。其中其他生化標(biāo)志物包括心血管標(biāo)志物、腫瘤標(biāo)志物和自身免疫性疾病標(biāo)志物。本發(fā)明量子點熒光免疫層析高靈敏定量檢測的方法能夠解決現(xiàn)有技術(shù)中背景與信號難區(qū)分、靈敏度低、熒光定量方法不準(zhǔn)確的不足和缺陷，可實現(xiàn)對微量樣本的檢測。由于量子點熒光受激發(fā)光干擾很小，靈敏度大大提高，其靈敏度是用傳統(tǒng)染料和有色標(biāo)記物檢測方法的10 1000倍。為了提高信號與背景的區(qū)分度，本發(fā)明選用發(fā)射光波長為550 1300nm的量子點。因為在紫外照射下，層析膜、底板和扣卡的熒光強度在550nm以下遠強于550nm以上， 從而對低濃度分析物檢測時產(chǎn)生一定的影響，故可優(yōu)選發(fā)射波長大于^Onm的量子點。另外層析膜、底板和扣卡在近紅外區(qū)域(750 1300nm)熒光強度極弱，并結(jié)合量子點合成技術(shù)，優(yōu)選近紅外波長的量子點(750 1300nm)可進一步提高靈敏度。本發(fā)明所用量子點包含單一化合物形成的量子點或是幾種化合物組裝成的復(fù)合物量子點，且量子點具有較強的光穩(wěn)定性。形成量子點的化合物是從aiS、CdS、HgS、MgS、 CdSe, MgSe, ZnSe, PbSe、PbSe, CdTe, MgTe, ZnTe, HgTe, InAs, InP 組成的組中選擇的，且可摻雜Cu、Mn和Hg。生物領(lǐng)域應(yīng)用的量子點主要有水相和有機相兩種合成方法，本發(fā)明一個實施例采用水相法合成，一般方法為采用巰基化合物(如巰基乙酸、巰基甘油等)作為量子點的穩(wěn)定劑，巰基通過和量子點表面原子配位來控制量子點生長，同時提供穩(wěn)定的電荷層保證分散體系的穩(wěn)定性。該方法雖合成簡單，無需進一步表面親水修飾即可應(yīng)用，但量子點的生長速率、結(jié)晶性、發(fā)光效率都遠不及有機相合成的量子點。作為優(yōu)選，在本發(fā)明的一個實施例中，使用水相方法合成700nm和800nm的CdTe/ CdSe量子點。本發(fā)明中另一個實施例中，量子點采用有機相合成，一般為主要是以Cd、ai的氧化物或鹽等為原料，采用長鏈脂肪酸、脂肪胺和其他種類的磷酸氧化物等充當(dāng)配體。以十八烯、三辛基氧化磷等高熔點有機化合物為溶劑，在高溫條件下生長得到高質(zhì)量的熒光量子點。有機相合成由于反應(yīng)溫度較高，所得量子點熒光量子產(chǎn)率較高，熒光半峰寬較窄，因此更加得到人們的青睞。作為優(yōu)選，在本發(fā)明實施例中，使用有機相方法合成630nmCcKe/ZnS量子點，并把量子點由脂溶性轉(zhuǎn)為水溶性，此過程中量子點熒光無明顯變化。質(zhì)控分子修飾的量子點與配體修飾的量子點可選用相同發(fā)射波長的量子點。在本發(fā)明的一個實施例中，標(biāo)記墊中β亞基絨毛膜促性腺激素(β-HCG)的抗體修飾的量子點和質(zhì)控分子修飾的量子點的發(fā)射波長均為630nm。為了減弱質(zhì)控分子修飾的量子點對定量帶及背景信號的影響，采用雙色標(biāo)記技術(shù)，即選用兩種發(fā)射波長不同的量子點分別標(biāo)記質(zhì)控分子和抗體。在本發(fā)明的另一個實施例中，標(biāo)記墊中有機磷的抗體修飾的量子點發(fā)射波長為800nm，質(zhì)控分子修飾的量子點發(fā)射波長為700nm。本發(fā)明采用化學(xué)交聯(lián)或生物分子間特異性作用將分析物的配體連接到量子點表面，得到配體修飾的量子點，其中配體能與分析物特異性結(jié)合。本發(fā)明中的化學(xué)交聯(lián)為當(dāng)量子點表面有活性基團，可與配體或質(zhì)控分子直接反應(yīng)時，不需用化學(xué)交聯(lián)劑，反之用化學(xué)交聯(lián)劑把配體修飾到量子點表面。在本發(fā)明的實施例中采用化學(xué)交聯(lián)法對量子點進行蛋白質(zhì)分子修飾的方法為利用1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺(EDC)/N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、戊二醛等交聯(lián)劑將量子點表面的官能團(如羧基、氨基)與蛋白質(zhì)分子(如抗原、抗體等)表面的官能團(如氨基、羧基、醛基等)連接。作為優(yōu)選，在本發(fā)明的一個實施例中，采用EDC/NHS交聯(lián)法對量子點進行修飾，一般步驟為將量子點溶液與EDC和NHS混合，然后加入一定量的蛋白質(zhì)，以緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)，培育4h，加入L-甘氨酸封閉，以色譜、層析柱或超濾離心等方式純化，從而得到蛋白質(zhì)修飾的量子點。生物分子間特異性作用包括生物素-親和素系統(tǒng)和抗原-抗體系統(tǒng)。作為優(yōu)選， 在本發(fā)明的另一個實施例中，采用生物素-親和素系統(tǒng)結(jié)合方式對分析物配體進行量子點修飾，該結(jié)合方式具有放大信號的作用，具體為以EDC將鏈霉親和素連接到量子點表面， 生物素連接到蛋白質(zhì)分子表面，通過親和素-生物素間的相互作用，把蛋白質(zhì)分子連接到量子點表面。為了降低對量子點熒光信號的影響，本發(fā)明采用弱熒光層析膜、低熒光底板和低熒光扣卡，從而保證獲得高熒光信背比，能良好區(qū)分信號與背景，進而提高檢測靈敏度。作為優(yōu)選，在本發(fā)明實施例中，底板(8)為黑色，表面附有不干膠，且層析膜G)、 扣卡、底板(8)和不干膠均不含有熒光劑。為區(qū)別于膠體金免疫層析試紙條的檢測帶，本發(fā)明中層析膜上固定分析物配體的區(qū)域稱為定量帶，用于準(zhǔn)確定量檢測分析物的濃度，并以質(zhì)控帶作內(nèi)質(zhì)控校正定量帶，以減弱樣本、環(huán)境因素等的影響。本發(fā)明的免疫層析試紙條可采取常規(guī)的層析方式，作為優(yōu)選，本發(fā)明采用預(yù)潤免疫層析進行分析物檢測。其中預(yù)潤免疫層析試紙條有直接和間接預(yù)潤兩種，在一個實施例中，直接預(yù)潤免疫層析試紙條由樣品墊(1)、過濾膜O)、標(biāo)記墊(3)、層析膜0)、吸水墊 (7)、底板⑶和扣卡組成，如圖1所示。在標(biāo)記墊(3)上固定有配體(α-hCG抗體)修飾的量子點，以及質(zhì)控分子修飾的量子點。在試紙條層析膜上分別設(shè)有兩條定量帶(6)和兩條質(zhì)控帶(5)，其中質(zhì)控帶(5)固定有能與質(zhì)控分子特異性結(jié)合的生物分子，定量帶(6)固定有能與分析物結(jié)合的配體(0_1^6抗體)。分析物(hCG抗原)能與量子點表面的配體 (a -hCG抗體)和定量帶上的配體(β -hCG抗體)形成雙抗體夾心結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的另一個實施例中，間接預(yù)潤免疫層析試紙條由樣品墊(1)、標(biāo)記墊(3)、 層析膜、潤濕墊(9)、連接墊(10)、吸水墊(7)、底板(8)和扣卡組成，如圖2所示。在標(biāo)記墊C3)上固定有配體(有機磷抗體)修飾的量子點，以及質(zhì)控分子修飾的量子點。在試紙條層析膜上分別設(shè)有定量帶(6)和質(zhì)控帶(5)，其中質(zhì)控帶(5)固定有能與質(zhì)控分子特異性結(jié)合的生物分子，定量帶(6)固定有能與分析物競爭的配體(有機磷半抗原)。分析物(有機磷)能與量子點表面的配體(有機磷抗體)結(jié)合，阻止量子點表面配體(有機磷抗體)與定量帶上的配體(有機磷半抗原)結(jié)合。本發(fā)明中層析膜(4)包含至少一條用于捕獲分析物的定量帶(6)，至少一條用于捕獲質(zhì)控分子的質(zhì)控帶(5)。如層析膜包含兩條質(zhì)控帶，且其中所示兩條質(zhì)控帶分別在定量帶兩側(cè)，并且以兩條質(zhì)控帶為參照分析定量帶熒光強度，有利于分析物的準(zhǔn)確定量。層析膜包含至少兩條定量帶時，兩條定量帶至少檢測一種分析物。且檢測同一分析物時通過增加定量帶的條數(shù)可擴大檢測范圍，避免HOOK效應(yīng)。作為優(yōu)選，本發(fā)明的一個實施例中采用兩條質(zhì)控帶(5)和兩條定量帶(6)，以實現(xiàn)分析物的準(zhǔn)確定量，減少相關(guān)因素的影響。本發(fā)明的一個實施例中所用樣本為尿樣，且樣本進一步包含血清、全血、血漿、唾液和糞便。當(dāng)樣本為全血時，熒光免疫層析試紙條還包括在樣品墊與層析膜之間設(shè)置的過濾膜O)，用于分離細胞或干擾物，該過濾膜( 可分別與樣品墊(1)和標(biāo)記墊C3)直接毛細作用接觸(如圖1)，也可與標(biāo)記墊(3)和層析膜(4)直接毛細作用接觸。本發(fā)明實施例采用預(yù)潤免疫層析方法對樣本中的分析物進行定量檢測。其中預(yù)潤免疫層析為加入一定體積的緩沖液到層析膜上，目的是預(yù)潤濕層析膜，封閉非特異性結(jié)合位點，以使量子點標(biāo)記物均勻通過層析膜，且減少在層析膜上的非特異性吸附，并減緩樣本流動速度，從而增加特異性結(jié)合。其中緩沖液體積一般為20 80μ 1，潤濕時間一般為10 秒 2分鐘，而樣本層析時間一般為8 25分鐘。本發(fā)明的預(yù)潤免疫層析可為將緩沖液直接或間接滴加于層析膜。而將緩沖液間接滴加于層析膜時，熒光免疫層析試紙條還包括潤濕墊和連接墊，其中潤濕墊分別與層析膜和連接墊以毛細作用接觸，連接墊分別與潤濕墊和吸水墊以毛細作用接觸。緩沖液通過潤濕墊到達層析膜。本發(fā)明采用的緩沖液為ρΗ 7. 2 11的堿性緩沖液，且該緩沖液可包含牛血清白蛋白、酪蛋白和表面活性劑。其中表面活性劑可包括吐溫20、吐溫80、曲拉通Χ-100、聚乙二醇和聚乙烯基吡咯烷酮等。作為優(yōu)選，本發(fā)明實施例中，使用緩沖液為包含牛血清白蛋白和吐溫20的pH9. 0 的磷酸緩沖液。本發(fā)明的熒光定量儀包含激發(fā)光源模塊、濾光模塊、光電轉(zhuǎn)換模塊、控制分析模塊和軟件系統(tǒng)。其中激發(fā)光源模塊包含光源和聚光裝置，該光源為發(fā)光二極管或激光二極管， 波長選擇300 400nm之間或500 600nm之間。濾光模塊包含濾光片輪，該濾光片輪包含不同種濾光片，以獲取相應(yīng)量子點的熒光信號。光電轉(zhuǎn)換模塊包含圖像傳感器或光電倍增管。層析結(jié)束后，在光源激發(fā)下，試紙條產(chǎn)生的熒光信號，經(jīng)過濾光模塊濾除雜散光及背景熒光，到達光電轉(zhuǎn)換模塊，轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號。其中所獲質(zhì)控帶與定量帶的熒光強度有一定相關(guān)性，主要影響因素有溫度、濕度、基質(zhì)等。本發(fā)明檢測結(jié)果的判定方法為如果質(zhì)控帶熒光信號強度值超過熒光定量儀內(nèi)部設(shè)定的可接受值，說明檢測結(jié)果無效；以雙抗體夾心法為例，在檢測結(jié)果有效的前提下，定量帶熒光強度與質(zhì)控帶比值越高，表示分析物濃度越高，反之越低；以競爭法為例，定量帶熒光強度與質(zhì)控帶比值越低，表示分析物濃度越高，反之越低。本發(fā)明采用熒光定量儀檢測一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中標(biāo)準(zhǔn)曲線為標(biāo)準(zhǔn)品系列濃度(c)與所對應(yīng)的校正熒光信號強度(F)的關(guān)系曲線，關(guān)系式為F = f(c)。校正熒光信號強度為F= aFg^/Fgi，其中α為校正系數(shù)，受溫度、濕度和基質(zhì)等影響。然后檢測樣本，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣本中分析物濃度。本發(fā)明可廣泛應(yīng)用于病原體、重大疾病(如腫瘤、心血管疾病等)、違禁藥品、毒品檢測、食品安全等多種分析物的定量檢測。本發(fā)明的主要優(yōu)點如下1)本發(fā)明采用量子點作為特異性抗體的標(biāo)記物，與有機熒光染料相比，具有發(fā)光強度高、激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄、熒光壽命長、表面修飾多功能化及穩(wěn)定性好等優(yōu)勢。并優(yōu)選了 550 1300nm的量子點，以提高與背景的區(qū)分度。2)本發(fā)明試劑盒的組成部件中的扣卡、底板以及層析膜在大于550nm時均具有低的熒光特性，以減少對量子點熒光信號獲取的影響，從而保證獲得高的熒光信背比，進而達到提高靈敏度的目的。3)本發(fā)明采用熒光定量儀檢測定量帶和質(zhì)控帶熒光信號強度，并以質(zhì)控帶校正定量帶熒光信號強度，進而依據(jù)熒光定量儀獲取的標(biāo)準(zhǔn)曲線實現(xiàn)分析物的定量檢測。其中標(biāo)準(zhǔn)曲線為標(biāo)準(zhǔn)品系列濃度(c)與所對應(yīng)的校正熒光信號強度(F)的關(guān)系曲線，關(guān)系式為F = f(c)。校正熒光信號強度為F= aFg^/Fgi，其中α為校正系數(shù)，受溫度、濕度和基質(zhì)等影響。然后檢測樣本，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣本中分析物濃度。4)本發(fā)明只需改變量子點的粒徑或種類，就可得到不同波長的熒光，用不同類型的量子點標(biāo)記不同的抗體，可產(chǎn)生多色熒光標(biāo)記，實現(xiàn)多組分的檢測；利用量子點多色標(biāo)記技術(shù)，減少質(zhì)控分子對分析物檢測的影響，也可減少分析物間的交叉干擾，方法簡單快速， 靈敏度高，有利于高靈敏定量檢測。5)本發(fā)明可利用預(yù)潤免疫層析技術(shù)，增強特異性結(jié)合，減少非特異性吸附，增強試劑盒的檢測靈敏度，有利于樣品中分析物含量極低時的準(zhǔn)確定量。6)本發(fā)明方法簡單、快速、準(zhǔn)確、成本低，且靈敏很高。與常規(guī)膠體金免疫層析方法相比，本發(fā)明具有標(biāo)記穩(wěn)定性好、非特異性低、靈敏度高、線性范圍寬以及定量準(zhǔn)確等優(yōu)勢。


圖1為直接預(yù)潤免疫層析試紙條的組裝示意圖，其中1為樣品墊，2為過濾膜，3為標(biāo)記墊，4為層析膜，5為質(zhì)控帶，6為定量帶，7為吸水墊，8為底板。圖2為間接預(yù)潤免疫層析試紙條的組裝示意圖，其中1為樣品墊，3為標(biāo)記墊，4為層析膜，5為質(zhì)控帶，6為定量帶，7為吸水墊，底板，8為底板，9為潤濕墊，10為連接墊。
具體實施例方式本發(fā)明公開了一種量子點熒光免疫層析高靈敏定量檢測的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明所提供的技術(shù)方案為步驟1)合成熒光發(fā)射波長范圍為550 1300nm的量子點納米顆粒；步驟2、用化學(xué)交聯(lián)或生物分子間特異性作用將分析物對應(yīng)的配體和質(zhì)控分子連接到量子點表面，得到配體修飾的量子點和質(zhì)控分子修飾的量子點；步驟幻將步驟2~)得到的兩種量子點標(biāo)記物固定在標(biāo)記墊，在層析膜上設(shè)有定量帶和質(zhì)控帶，其中質(zhì)控帶固定有能與所述質(zhì)控分子特異性結(jié)合的生物分子，定量帶固定有能與分析物結(jié)合或與步驟幻所述配體競爭結(jié)合分析物的配體；步驟4)以樣品墊、標(biāo)記墊、層析膜、吸水墊、底板和扣卡構(gòu)建成熒光免疫層析試紙條，其中所述層析膜為弱熒光層析膜，底板和扣卡具有低熒光特性；步驟幻試紙條免疫層析，樣本流經(jīng)定量帶和質(zhì)控帶后，檢測定量帶和質(zhì)控帶熒光信號強度，并以質(zhì)控帶熒光信號強度校正定量帶熒光信號強度，進而實現(xiàn)分析物的定量檢測。為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。實施例1 雙抗體夾心測定人絨毛膜促性腺激素(hCG)(一 )量子點合成及修飾取0. 2375g硒粉、2. 60mL十八烯和1. 57mL三正辛基膦，依次加入25ml小試劑瓶中，加熱瓶中混合液體并反復(fù)振蕩直至硒粉全部溶解，即得硒前體。另取0. 0368g氧化鎘、 0. 342g硬脂酸和3. 8ml十八烯，依次加入三頸燒瓶中，氮氣保護下加熱至氧化鎘全部溶解。 降溫使溶液冷卻至凝固。取2. 25g十八胺和0. 95g三辛基氧化膦，加入三頸燒瓶，并加熱使固體融解，繼續(xù)加熱至280°C，注入4. 2mL硒前體，升溫至240°C，使Cdk量子點熒光發(fā)射波長增加到所需波長。并以甲醇純化量子點。取IOmL十八烯、0. IlOg硫粉，依次加入三頸燒瓶中，在氮氣保護下加熱至硫粉溶解，即得硫前體。另取0. 8375g氧化鋅、9mL油酸和2mL十八烯，依次加入三頸燒瓶中，在氮氣保護下加熱至鋅粉溶解，即得鋅前體。取anl Cdk量子點溶液，加入三頸燒瓶中，抽真空去除氯仿，取以上合成的硫前體和鋅前體，以及5mL十八烯和1. 4g十八胺，依次加入三頸燒瓶中，加熱使固體融解，在氮氣保護下加熱使量子點生長至所需波長，并以甲醇純化。表征量子點熒光特征，CdSe/ZnS量子點熒光發(fā)射波長為630nm，量子產(chǎn)率大于50%。取0. 5 1. Og四甲基氫氧化銨五水合物，加入0. 1 Iml巰基丙酸和IOml氯仿， 搖均，靜置30分鐘后，去除上層液體，然后加入100μ lCdSe/ZnS量子點溶液。溶液中有紅色沉淀析出，48小時后取出紅色懸浮物，以氯仿純化后，溶于水溶液中，得到表面官能團為羧基的量子點。量子點相轉(zhuǎn)移前后熒光特性無明顯變化。向磷酸緩沖液中加入60pmol量子點、10 μ g EDC和15 μ g NHS溶液和10 30 μ g 抗β亞基絨毛膜促性腺激素(β-hCG)的單抗溶液，混合均勻并于室溫下反應(yīng)4h，加入Img 甘氨酸封閉。用色譜柱或?qū)游鲋蛛x純化，得到β _hCG抗體修飾的量子點。同理得到羊抗兔抗體修飾的量子點。( 二)試紙條組裝以摩爾比1 1的比例混合均勻上述兩種量子點標(biāo)記物，其中混合液中含有1 15%蔗糖、0.01 2%牛血清白蛋白(BSA)和吐溫20、吐溫80、曲拉通X-100等表面活性劑， 其中表面活性劑含量在0.01 2%之間，然后均勻噴涂在標(biāo)記墊上，37°C干燥后密封，4°C 下保存。以劃膜儀在弱熒光層析膜上劃四條平行條帶，條帶間隔5mm，條帶寬都約為1mm。 其中兩側(cè)的兩條為質(zhì)控帶，中間為兩條定量帶。質(zhì)控帶上噴涂兔免疫球蛋白(IgG)，濃度分別為0. ;3mg/ml和lmg/ml。定量帶噴涂抗a亞基絨毛膜促性腺激素(a_hCG)的多抗，濃度為1 ;3mg/ml。37 °C干燥后密封，4°C下保存。在黑色底板上，依次粘貼樣品墊(長30cm，寬16mm)、過濾膜(長30cm，寬IOmm)、 標(biāo)記墊(長30cm，寬8mm)、層析膜(長30cm，寬2. 5cm)和吸水墊(長30cm，寬16mm)。膜與膜之間都要緊密相連，制成免疫層析試紙大板。示意圖如圖1所示。用切條機將粘貼好的析試紙大板縱向切成4mm寬的試紙條，放入低熒光扣卡中，干燥后密封，4°C避光保存。(三)樣本檢測用正常人尿液作稀釋液，將hCG抗原標(biāo)準(zhǔn)品配制系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液如下0mIU/ mL、25mIU/mL、100mIU/mL、300mIU/mL、500mIU/mL、800mIU/mL、1000mIU/mL、3000mIU/mL、 5000mIU/mL、8000mIU/mL、10000mIU/mL和 15000mIU/mL。將 100 μ 1 標(biāo)準(zhǔn)品滴加到上樣孔上，
13分鐘后，以熒光定量儀檢測(每個樣本分別用3個試紙條測定3次，取平均值)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中質(zhì)控帶用于試紙條有效性判斷，并對定量帶信號作相應(yīng)的校正。將100 μ 1尿液樣本滴加到上樣孔上，13分鐘后以熒光定量儀檢測試紙條，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣本中hCG的濃度。。免疫層析的原理為當(dāng)樣本滴入試紙條樣品墊后，樣本先與標(biāo)記墊中的量子點標(biāo)記物相混合，并沿著層析膜向吸水墊方向毛細運動，分別流經(jīng)層析膜上的定量帶和質(zhì)控帶。 當(dāng)樣本中含有hCG，則與量子點表面的β -hCG單抗相結(jié)合，當(dāng)層析至定量帶時，會被預(yù)先包被于該條帶的a-hCG抗體捕獲，從而構(gòu)成雙抗體夾心復(fù)合物，使量子點停留在定量帶。光源激發(fā)下，采用熒光定量儀獲取定量帶和質(zhì)控帶的熒光信號強度，依據(jù)熒光定量儀獲取的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進而分析樣本中hCG濃度。樣本中hCG含量越高，則結(jié)合到定量帶的量子點越多， 定量帶熒光強度越強。結(jié)果表明，其最低檢測限為5mIU/mL，最低定量限為10mIU/mL，在定量檢測范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R2 > 0. 99，未出現(xiàn)HOOK效應(yīng)，且批內(nèi)與批間重復(fù)性均較好，可為早早孕診斷提
供參考。實施例2 競爭法測定有機磷(一 )量子點合成及修飾CdTe量子點的合成，按體積比2 1的比例依次向盛有適量的Te粉和硼氫化鈉的反應(yīng)器中加人無水乙醇和一次水，通氮氣在60°C水浴中反應(yīng)直至黑色Te粉完全消失。加人稍過量0. 5mol/L H2SO4,產(chǎn)生H2Te并被NaOH溶液吸收，得到NaHTe水溶液。在氮氣下將CdCl2 ·2. 5 H2O溶解到IOOmL超純水中，然后加人巰基丙酸，在攪拌作用下滴加0. 5mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液的pH為11. 2，最后注入0. Immol NaHTe溶液，其中 Cd Te 巰基丙酸的比值為1.0 0.5 2.4。所得混合溶液在氮氣下100°C加熱回流， 得到CdTe量子點，并以異丙醇純化。取適量CdTe量子點(濃度為lmmol/L)，之后加入巰基丙酸(52. 4mg)和 Cd2+(0. 2mmol/L)的混合溶液。k和Naiffi4反應(yīng)產(chǎn)生NaHSe，加人0. 5mmol/L硫酸后產(chǎn)生Hje 氣體，緩慢通入混合溶液中，在90°C水浴加熱回流下得到羧基化CdTe/Cdk量子點，熒光發(fā)射波長為700nm和800nm。根據(jù)實施例1的方法，制備鏈霉親和素修飾的量子點(熒光發(fā)射波長為SOOnm)。將有機磷單抗用0. lmol/L碳酸氫鈉緩沖液(pH 8. 0)稀釋到lmg/ml，用Iml 二甲亞砜(DMSO)溶解Img N-羥基琥珀酰亞胺生物素(NHSB)，取Iml有機磷單抗溶液加入20 120 μ 1 NHSB溶液，室溫下反應(yīng)4小時。加入lmol/L NH4Cl,在室溫下攪拌10分鐘。以超濾離心純化，以除去游離的生物素，得到生物素化的有機磷單抗。以1 3 1 12的比例混合鏈霉親和素修飾的量子點和生物素化的有機磷單抗，得到有機磷抗體修飾的量子點(熒光發(fā)射波長為SOOnm)。同理得到羊抗兔抗體修飾的量子點(熒光發(fā)射波長為700nm)。( 二)試紙條組裝根據(jù)實施例1的方法把量子點標(biāo)記物噴涂于標(biāo)記墊。根據(jù)實施例1的方法把抗體和質(zhì)控分子分別噴涂于層析膜的定量帶(一條)和質(zhì)控帶(兩條)。其中以有機磷抗體修飾的量子點噴涂于標(biāo)記墊上；以有機磷包被抗原(半抗原)作為包被抗原包被于試紙條定量帶，劃線濃度為0. 2 1. 5mg/ml ；以兔IgG包被于質(zhì)控帶。在黑色底板上，依次粘貼樣品墊(長30cm，寬16mm)、標(biāo)記墊(長30cm，寬8mm)、層析膜(長30cm，寬2. 5cm)、連接墊(長30cm，寬IOmm)、潤濕墊(長30cm，寬IOmm)和吸水墊 (長30cm，寬16mm)。膜與膜之間都要緊密相連，制成免疫層析試紙大板。示意圖如圖2所示。用切條機將粘貼好的析試紙大板縱向切成4mm寬的試紙條，放入低熒光扣卡中，干燥后密封，4°C避光保存。(三)樣本檢測用磷酸緩沖液作稀釋液，將甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)品配制系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液如下0mg/L、 0. 05mg/L、0. Img/L、0. 3mg/L、0. 5mg/L、lmg/L、3mg/L、5mg/L、8mg/L、10mg/Lo用磷酸緩沖液作稀釋液，將敵敵畏標(biāo)準(zhǔn)品配制系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液如下0μ g/ LU μ g/L、5y g/L、10y g/L、30y g/L、50y g/L、100y g/L、300y g/L、500y g/L、800y g/L、 ΙΟΟΟμ g/L。將100 μ 1緩沖液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液滴加到上樣孔中，13分鐘后，以熒光定量儀檢測 (每個樣本分別用3個試紙條測定3次，取平均值)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中質(zhì)控帶用于對定量帶信號受環(huán)境影響，而作相應(yīng)的校正。將100 μ 1樣本滴加到上樣孔中，13分鐘后，以熒光定量儀檢測，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣本中有機磷的濃度。免疫層析的原理為當(dāng)樣本滴入試紙條樣品墊后，樣本先與標(biāo)記墊中的量子點標(biāo)記物相混合，并沿著層析膜向吸水墊方向毛細運動，分別流經(jīng)層析膜上的定量帶和質(zhì)控帶。 當(dāng)樣本中含有有機磷時，有機磷與量子點表面有機磷抗體結(jié)合，流經(jīng)定量帶時，包被抗原將和有機磷競爭結(jié)合量子點表面的有機磷抗體上有限的抗原結(jié)合位點，樣本中有機磷含量越高，競爭力越強，則定量帶上的包被抗原和量子點表面的有機磷抗體結(jié)合將越少，定量帶熒光強度越弱。無論樣本中是否含有有機磷，量子點修飾的羊抗兔抗體均會與包被的兔IgG 結(jié)合，顯現(xiàn)強熒光的質(zhì)控帶。質(zhì)控帶強度與定量帶有一定相關(guān)性，主要影響因素有環(huán)境溫度、濕度和基質(zhì)等。結(jié)果表明，甲胺磷最低檢測限為0. lmg/L，最低定量限為0. ^iig/L，在定量檢測范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R2 >0. 99，未出現(xiàn)HOOK效應(yīng)，且批內(nèi)與批間重復(fù)性均較好，可用于農(nóng)藥殘留檢測。敵敵畏最低檢測限為1 μ g/L,最低定量限為5 μ g/L,在定量檢測范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R2 > 0. 99，未出現(xiàn)HOOK效應(yīng)，且批內(nèi)與批間重復(fù)性均較好，可用于農(nóng)藥殘留檢測。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種量子點熒光免疫層析高靈敏定量檢測的方法，其特征在于，包括以下步驟步驟1)合成熒光發(fā)射波長范圍為550 1300nm的量子點納米顆粒；步驟幻用化學(xué)交聯(lián)或生物分子間特異性作用將分析物對應(yīng)的配體和質(zhì)控分子連接到量子點表面，得到配體修飾的量子點和質(zhì)控分子修飾的量子點；步驟幻將步驟幻得到的兩種量子點標(biāo)記物固定在標(biāo)記墊，在層析膜上設(shè)有定量帶和質(zhì)控帶，其中質(zhì)控帶固定有能與所述質(zhì)控分子特異性結(jié)合的生物分子，定量帶固定有能與分析物結(jié)合或與步驟幻所述配體競爭結(jié)合分析物的配體；步驟4)以樣品墊、標(biāo)記墊、層析膜、吸水墊、底板和扣卡構(gòu)建成熒光免疫層析試紙條， 其中所述層析膜為弱熒光層析膜，底板和扣卡具有低熒光特性；步驟幻試紙條免疫層析，樣本流經(jīng)定量帶和質(zhì)控帶后，檢測定量帶和質(zhì)控帶熒光信號強度，并以質(zhì)控帶熒光信號強度校正定量帶熒光信號強度，進而實現(xiàn)分析物的定量檢測。
2.如權(quán)利要求1所述的量子點熒光免疫層析高靈敏定量檢測的方法，其特征在于，步驟1)所述量子點為單一化合物形成的量子點或是幾種化合物組裝成的復(fù)合物量子點。
3.如權(quán)利要求2所述的量子點熒光免疫層析高靈敏定量檢測的方法，其特征在于，所述化合物是從 ZnS、CdS、HgS、MgS、CdSe、MgSe、ZnSe、PbSe、PbSe、CdTe、MgTe、ZnTe、HgTe、 InAs, InP組成的組中選擇，且可摻雜Cu、Mn和Hg。
4.如權(quán)利要求1所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，步驟幻所述配體修飾的量子點與質(zhì)控分子修飾的量子點的熒光發(fā)射波長均為630nm。
5.如權(quán)利要求1所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，步驟幻所述配體修飾的量子點的熒光發(fā)射波長為800nm，質(zhì)控分子修飾的量子點的熒光發(fā)射波長為700nm。
6.如權(quán)利要求1所述的量子點熒光免疫層析高靈敏定量檢測的方法，其特征在于，步驟2)所述配體包含抗原、半抗原、單克隆抗體、多克隆抗體和激素受體。
7.如權(quán)利要求1所述的量子點熒光免疫層析高靈敏定量檢測的方法，其特征在于，步驟3)所述層析膜包含至少一條質(zhì)控帶，至少一條定量帶。
8.如權(quán)利要求1所述的量子點熒光免疫層析高靈敏定量檢測的方法，其特征在于，步驟3)所述層析膜包含至少兩條定量帶，且兩條定量帶至少檢測一種分析物。
9.如權(quán)利要求1所述的量子點熒光免疫層析高靈敏定量檢測的方法，其特征在于，步驟4)所述層析膜在大于550nm時熒光很弱或不含熒光劑。
10.如權(quán)利要求1所述的量子點熒光免疫層析高靈敏定量檢測的方法，其特征在于，步驟4)所述底板為黑色，表面附有不干膠，且兩者均不含熒光劑。
11.如權(quán)利要求1所述的量子點熒光免疫層析高靈敏定量檢測的方法，其特征在于，步驟4)所述扣卡具有低熒光特性或不含熒光劑。
12.如權(quán)利要求1所述的量子點熒光免疫層析高靈敏定量檢測的方法，其特征在于，步驟4)所述層析試紙條還包含能使細胞或干擾物與樣本中液體分離的過濾膜。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，步驟幻所述免疫層析為預(yù)潤免疫層析，其中預(yù)潤免疫層析為先以緩沖液預(yù)潤層析膜，再加入樣本到樣品墊中，樣本流經(jīng)定量帶和質(zhì)控帶后，進行熒光定量檢測。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，所述預(yù)潤層析膜為將緩沖液直接滴加于層析膜。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，當(dāng)所述預(yù)潤層析膜為將緩沖液間接滴加于層析膜時，步驟4)所述熒光免疫層析試紙條還包括潤濕墊和連接墊，其中潤濕墊分別與層析膜和連接墊以毛細作用接觸，連接墊分別與潤濕墊和吸水墊以毛細作用接觸。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，所述緩沖液為pH7. 2 11的堿性緩沖液。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，所述堿性緩沖液為包含牛血清白蛋白、酪蛋白和表面活性劑的堿性緩沖液。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，所述堿性緩沖液為包含牛血清白蛋白和吐溫20的pH9. 0的磷酸緩沖液。
19.如權(quán)利要求1所述的量子點熒光免疫層析高靈敏定量檢測的方法，其特征在于，步驟5)所述分析物包括小分子、抗原、抗體、激素、抗生素、細菌或病毒及其他生化標(biāo)志物。
20.如權(quán)利要求19所述的量子點熒光免疫層析高靈敏定量檢測的方法，其特征在于， 所述小分子包含藥物或毒品。
21.如權(quán)利要求19所述的量子點熒光免疫層析高靈敏定量檢測的方法，其特征在于， 所述其他生化標(biāo)志物包括心血管標(biāo)志物、腫瘤標(biāo)志物或自身免疫性疾病標(biāo)志物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種量子點熒光免疫層析高靈敏定量檢測的方法，本發(fā)明的方法利用量子點優(yōu)良的熒光特性，結(jié)合量子點熒光標(biāo)記技術(shù)和免疫層析技術(shù)，在優(yōu)化試紙條結(jié)構(gòu)和各組成部件的基礎(chǔ)上，構(gòu)建熒光免疫層析試紙條，試紙條免疫層析后，采用熒光定量儀檢測定量帶和質(zhì)控帶熒光信號強度，并以質(zhì)控帶校正定量帶熒光強度，進而依據(jù)熒光定量儀獲取的標(biāo)準(zhǔn)曲線實現(xiàn)分析物的定量檢測。本發(fā)明方法簡單、快速、準(zhǔn)確、成本低，且靈敏很高。與常規(guī)膠體金免疫層析方法相比，本發(fā)明具有標(biāo)記穩(wěn)定性好、非特異性低、靈敏度高、線性范圍寬以及定量準(zhǔn)確的優(yōu)勢。本發(fā)明適用于血樣、尿樣、唾液、糞便等樣本，可應(yīng)用于重大疾病、毒品檢測、食品安全等檢測。
文檔編號G01N33/558GK102520165SQ201110452439
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日
發(fā)明者王東 申請人:北京康美天鴻生物科技有限公司