專利名稱：一種定量檢測肌酸激酶同工酶的熒光免疫層析方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，特別涉及一種定量檢測急性心肌梗塞標(biāo)志物肌酸激酶同工酶的熒光免疫層析方法及其試劑盒。
背景技術(shù)：
當(dāng)前，心血管疾病在世界范圍內(nèi)已成為成年人最大的潛在殺手，僅在美國就有超過7000萬人患有心臟病，每年大約有600萬人因胸痛而進(jìn)急診室，每年急性心肌梗死(AMI) 的死亡人數(shù)超過了 50萬，在我國，心血管疾病的患病率、發(fā)病率及其危險(xiǎn)因素水平均呈不斷上升趨勢。近年來統(tǒng)計(jì)，心血管病的死亡率在人口死亡中占40%，已高于歐美國家，屬心血管病高發(fā)國。因此，只有做到早預(yù)防、早發(fā)現(xiàn)及早救治，才能最大限度的防止致殘、致死后果，最大限度的改善心血管患者的預(yù)后和生活質(zhì)量。對心血管疾病，常用的檢測指標(biāo)為心肌酶譜系列。心肌酶是指心肌細(xì)胞內(nèi)的酶類物質(zhì)，具有催化心肌細(xì)胞代謝和調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞電活動的作用。心肌酶譜包括天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同功酶MB (CK-MB)等。如果心肌細(xì)胞發(fā)生壞死、破裂，這些酶類就會釋放人血液當(dāng)中，使之升高。因此，心肌酶譜的升高程度可以間接衡量心肌細(xì)胞的損害程度。其中CK和CK-MB是靈敏度較高的指標(biāo)，能在發(fā)病早期心肌尚未大面積壞死時(shí)，在患者血液中檢測出來，第一時(shí)間為臨床提供可靠資料。CK是由兩種不同亞基(M和B)組成的二聚體，這樣正常人體組織主要含3種同工酶，即CK-MM、CK-BB, CK-MB。CK-MM主要存在于肌肉細(xì)胞中，CK-BB主要存在于腦細(xì)胞中， CK-MB主要存在于心肌細(xì)胞中。CK-MB是目前常用的心肌損傷標(biāo)志物，曾一度被視為診斷AMI的“金標(biāo)準(zhǔn)”。CK-MB 在急性心肌梗死發(fā)病后4 8h內(nèi)增高，24h達(dá)峰值，兩三天恢復(fù)正常。CK-MB因其具有重要的生理功能和臨床應(yīng)用價(jià)值已引起人們廣泛的重視和深入的研究。傳統(tǒng)上多用酶聯(lián)免疫吸附法、化學(xué)發(fā)光法及膠體金免疫層析法等測定血清中的 CK-MB。但酶聯(lián)免疫吸附法操作復(fù)雜，檢測耗時(shí)長；化學(xué)發(fā)光法對技術(shù)要求高，不易在臨床實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行常規(guī)開展。膠體金免疫層析法雖然具有標(biāo)本用量少，簡便快速，便宜的優(yōu)勢，然而當(dāng)遇到某些樣本中抗原或抗體含量極低時(shí)，膠體金的顏色將很淺，很難用肉眼來判斷結(jié)果，容易出現(xiàn)誤判，靈敏度較低。中國專利申請?zhí)朇N200610114997. 9公布了一種血清中肌酸激酶同工酶的化學(xué)發(fā)光測定方法。該申請?zhí)枌＠饕眉∷峒っ复呋姿峒∷崤c二磷酸腺苷反應(yīng)生成三磷酸腺苷和肌酸，再用甘油激酶催化三磷酸腺苷和甘油生成3-磷酸甘油，3-磷酸甘油被磷酸甘油氧化酶氧化并產(chǎn)生過氧化氫，再經(jīng)過氧化物酶作用，過氧化氫使魯米諾氧化而發(fā)光。中國專利申請?zhí)?00520041211. 6披露了一種心血管疾病診斷和預(yù)測多指標(biāo)蛋白芯片檢測試劑盒，該試劑盒采用化學(xué)發(fā)光法(如辣根過氧化氫酶和魯米諾)檢測，并能同時(shí)檢測C反應(yīng)蛋白、肌紅蛋白、心肌肌鈣蛋白I、肌酸激酶同工酶等八種抗體。雖然化學(xué)發(fā)光法靈敏度較高，但重復(fù)性和穩(wěn)定性均較差，且儀器復(fù)雜、昂貴，不能單人份檢測，限制了他們的廣泛應(yīng)用。美國專利US60/576327和60/592202，及其在中國申請的專利200580025931. 6都對膠體金免疫層析檢測進(jìn)行了論述。但相比于熒光檢測，吸光度檢測具有靈敏度低、線性范圍窄等缺陷。量子點(diǎn)(quantum dots, QDs)又稱半導(dǎo)體納米晶，通常是由II VI族或III V族元素組成的穩(wěn)定的、尺寸介于1 20nm之間的納米微晶體。其具有許多優(yōu)良的光學(xué)特性(1)量子點(diǎn)的熒光發(fā)射光譜窄而對稱，熒光發(fā)射波長可調(diào)，且覆蓋范圍可從紫外到近紅外區(qū)。(2)量子點(diǎn)的吸收光譜寬且連續(xù)，可實(shí)現(xiàn)一元激發(fā)，多元發(fā)射，適合于多色標(biāo)記。(3) 量子點(diǎn)具有較強(qiáng)的光學(xué)穩(wěn)定性。Cdk/ZnS量子點(diǎn)的光穩(wěn)定性是羅丹明6G的100倍以上。 (4)量子點(diǎn)摩爾吸光系數(shù)可以高達(dá)106L/(mol ^m)，且熒光量子產(chǎn)率高(50 80% )，因而可產(chǎn)生較強(qiáng)熒光信號。( 量子點(diǎn)斯托克斯位移較大，熒光壽命長(20 50ns)，使得信號可以顯著區(qū)分于背景和其它熒光基團(tuán)。量子點(diǎn)是一種理想的應(yīng)用于超靈敏和多組分生物化學(xué)分析的熒光探針。將量子點(diǎn)與抗體結(jié)合可應(yīng)用于熒光免疫分析和檢測。針對現(xiàn)有CK-MB檢測方法靈敏度低、檢測范圍窄和定量不準(zhǔn)確等不足，量子點(diǎn)熒光定量檢測方法利用量子點(diǎn)多波長激發(fā)、高強(qiáng)度熒光強(qiáng)度、發(fā)射峰窄、峰形對稱、發(fā)光穩(wěn)定性好的熒光特性，可提供一種量子點(diǎn)標(biāo)記快速免疫層析試紙條的檢測方法，對CK-MB進(jìn)行定量檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題為針對現(xiàn)有技術(shù)中檢測肌酸激酶同工酶靈敏度低、線性范圍窄和儀器昂貴等缺點(diǎn)，提供了一種定量檢測CK-MB的熒光免疫層析方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為一種定量檢測肌酸激酶同工酶CK-MB的熒光免疫層析方法，包括以下步驟步驟1)用化學(xué)交聯(lián)或生物分子間特異性作用將肌酸激酶同工酶CK-MB的特異性抗體連接到量子點(diǎn)表面，得到抗體修飾的量子點(diǎn)，所述抗體修飾的量子點(diǎn)的發(fā)射波長范圍為 550 1300nm ；步驟2)將步驟1)得到的抗體修飾的量子點(diǎn)固定在標(biāo)記墊上，且標(biāo)記墊上同時(shí)固定有質(zhì)控分子修飾的量子點(diǎn)，所述質(zhì)控分子修飾的量子點(diǎn)的發(fā)射波長與步驟1)得到的抗體修飾的量子點(diǎn)的發(fā)射波長不同，且波長范圍為550 1300·，在層析膜上分別設(shè)有定量帶和兩條質(zhì)控帶，其中質(zhì)控帶固定有能與所述質(zhì)控分子特異性結(jié)合的生物分子，定量帶固定有對應(yīng)CK-MB的與步驟1)所述特異性抗體不同抗原決定簇的特異性抗體；步驟幻以樣品墊、標(biāo)記墊、層析膜、吸水墊和底板構(gòu)建成熒光免疫層析試紙條，其中所述層析膜為弱熒光層析膜，底板具低熒光特性；步驟4)試紙條免疫層析后，檢測定量帶和質(zhì)控帶熒光信號強(qiáng)度，并以質(zhì)控帶熒光信號強(qiáng)度校正定量帶熒光信號強(qiáng)度，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)CK-MB的定量檢測。本發(fā)明提供的一種定量檢測CK-MB的熒光免疫層析的方法，是一種以量子點(diǎn)為熒光信號的，采用雙色標(biāo)記技術(shù)，在免疫層析試紙條上實(shí)現(xiàn)CK-MB快速靈敏檢測的方法。本發(fā)明定量檢測CK-MB的熒光免疫層析方法能夠解決現(xiàn)有熒光免疫層析技術(shù)中背景與信號難區(qū)分、靈敏度低、熒光定量方法不明確的不足和缺陷，可實(shí)現(xiàn)對微量樣本的檢測。由于量子點(diǎn)熒光受激發(fā)光干擾很小，靈敏度大大提高，其靈敏度是用傳統(tǒng)染料和有色標(biāo)記物檢測方法的10 1000倍。本發(fā)明采用化學(xué)交聯(lián)或生物分子間特異性作用將CK-MB的特異性抗體連接到量子點(diǎn)表面，得到抗體修飾的量子點(diǎn)，其中特異性抗體為對應(yīng)CK-MB的一個(gè)或多個(gè)抗原表位的抗體。本發(fā)明中的化學(xué)交聯(lián)為當(dāng)量子點(diǎn)表面有活性基團(tuán)，可與抗體或質(zhì)控分子直接反應(yīng)時(shí)，不需用化學(xué)交聯(lián)劑，反之用化學(xué)交聯(lián)劑把抗體修飾到量子點(diǎn)表面。在本發(fā)明的實(shí)施例中采用化學(xué)交聯(lián)法對量子點(diǎn)進(jìn)行蛋白質(zhì)分子修飾的方法為利用1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺(EDC)/N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、戊二醛等交聯(lián)劑將量子點(diǎn)表面的官能團(tuán)(如羧基、氨基)與蛋白質(zhì)分子(如抗原、抗體等)表面的官能團(tuán)(如氨基、羧基、醛基等)連接。作為優(yōu)選，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，采用EDC/NHS交聯(lián)法對量子點(diǎn)進(jìn)行修飾。其中EDC/NHS交聯(lián)法對量子點(diǎn)進(jìn)行蛋白質(zhì)分子修飾的一般步驟為將量子點(diǎn)溶液與EDC和 NHS混合，然后加入一定量的蛋白質(zhì)，以緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)，培育4h，加入L-甘氨酸封閉，以色譜、層析柱或超濾離心等方式純化，從而得到蛋白質(zhì)修飾的量子點(diǎn)。生物分子間特異性作用包括生物素-親和素系統(tǒng)和抗原-抗體系統(tǒng)。作為優(yōu)選， 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，采用生物素-親和素系統(tǒng)的結(jié)合方式對蛋白質(zhì)進(jìn)行量子點(diǎn)修飾，該結(jié)合方式具有放大信號的作用。具體為以EDC將鏈霉親和素連接到量子點(diǎn)表面，生物素連接到蛋白質(zhì)分子表面，通過親和素-生物素間的相互作用，把蛋白質(zhì)分子連接到量子點(diǎn)表面。為了提高與背景的區(qū)分度，本發(fā)明選用發(fā)射光波長為550 1300nm的量子點(diǎn)。因?yàn)樵谧贤庹丈湎拢瑢游瞿?、底板和扣卡的熒光?qiáng)度在^Onm以下遠(yuǎn)強(qiáng)于550nm以上，從而對低濃度CK-MB檢測時(shí)產(chǎn)生一定的影響，故可優(yōu)選發(fā)射波長大于550nm的量子點(diǎn)。另外層析膜、底板和扣卡在近紅外區(qū)域(750 1300nm)熒光強(qiáng)度極弱，并結(jié)合量子點(diǎn)合成技術(shù)，優(yōu)選近紅外波長的量子點(diǎn)(750 1300nm)可進(jìn)一步提高靈敏度。本發(fā)明所用量子點(diǎn)包含單一化合物形成的量子點(diǎn)或是幾種化合物組裝成的復(fù)合物量子點(diǎn)，且量子點(diǎn)具有較強(qiáng)的光穩(wěn)定性。形成量子點(diǎn)的化合物是從aiS、CdS、HgS、MgS、 CdSe, MgSe, ZnSe, PbSe、PbSe, CdTe, MgTe, ZnTe, HgTe, InAs, InP 組成的組中選擇的，且可摻雜Cu、Mn和Hg。質(zhì)控分子修飾的量子點(diǎn)與CK-MB抗體修飾的量子點(diǎn)可選用相同發(fā)射波長的量子點(diǎn)。但在本發(fā)明中，為了減弱質(zhì)控分子修飾的量子點(diǎn)對定量帶及背景信號的影響，采用雙色標(biāo)記技術(shù)，即選用兩種發(fā)射波長不同的量子點(diǎn)分別標(biāo)記質(zhì)控分子和抗體。作為優(yōu)選，在本發(fā)明的實(shí)施例中，使用有機(jī)相方法合成570nm、600nm和650nm的 CdSe/aiS，并把量子點(diǎn)由脂溶性轉(zhuǎn)為水溶性，此過程中量子點(diǎn)熒光無明顯變化；使用水相方法合成900nm的hAs。作為優(yōu)選，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，標(biāo)記墊中CK-MB的抗體修飾的量子點(diǎn)發(fā)射波長為650nm，質(zhì)控分子修飾的量子點(diǎn)發(fā)射波長為570nm。作為優(yōu)選，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，標(biāo)記墊中CK-MB的抗體修飾的量子點(diǎn)發(fā)射波長為900nm，質(zhì)控分子修飾的量子點(diǎn)發(fā)射波長為600nm。
為了降低對量子點(diǎn)熒光信號的影響，本發(fā)明采用弱熒光層析膜、低熒光底板和低熒光扣卡，從而保證獲得高熒光信背比，能良好區(qū)分信號與背景，進(jìn)而提高檢測靈敏度。作為優(yōu)選，在本發(fā)明實(shí)施例中，底板(8)為黑色，表面附有不干膠，且層析膜G)、 扣卡(11)、底板(8)和不干膠均不含有熒光劑。如扣卡含有潤濕孔(1 時(shí)，則潤濕孔可在層析膜的近樣品墊一端或在近吸水墊一端。為區(qū)別于膠體金免疫層析試紙條的檢測帶，本發(fā)明中層析膜上固定CK-MB抗體的區(qū)域稱為定量帶，用于準(zhǔn)確定量檢測CK-MB的濃度，并以質(zhì)控帶作內(nèi)質(zhì)控校正定量帶，以減弱樣本、環(huán)境因素等的影響。本發(fā)明的免疫層析試紙條可采取常規(guī)的層析方式，作為優(yōu)選，本發(fā)明采用預(yù)潤免疫層析進(jìn)行CK-MB檢測。其中預(yù)潤免疫層析試紙條有直接和間接預(yù)潤兩種，在一個(gè)實(shí)施例中，直接預(yù)潤免疫層析試紙條由樣品墊(1)、過濾膜( 、標(biāo)記墊C3)、層析膜(4)、吸水墊(7) 和底板(8)組成，如圖1所示。在標(biāo)記墊上固定有CK-MB的特異性抗體修飾的量子點(diǎn)，以及質(zhì)控分子修飾的量子點(diǎn)。在試紙條層析膜上分別設(shè)有兩條定量帶和兩條質(zhì)控帶，其中質(zhì)控帶固定有能與質(zhì)控分子特異性結(jié)合的生物分子，定量帶固定有對應(yīng)CK-MB的與上述標(biāo)記墊中特異性抗體不同抗原決定簇的特異性抗體。CK-MB能與量子點(diǎn)表面的抗體和定量帶上的抗體形成雙抗體夾心結(jié)構(gòu)。并且通過增加定量帶的條數(shù)可擴(kuò)大檢測范圍，避免HOOK效應(yīng)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，間接預(yù)潤免疫層析試紙條由樣品墊(1)、標(biāo)記墊 (3)、層析膜(4)、潤濕墊(9)、連接墊(10)、吸水墊(7)和底板(8)組成，如圖2所示。本發(fā)明實(shí)施例中，發(fā)明人分別選用的樣本為全血和血清，且樣本進(jìn)一步包含血漿。 當(dāng)樣本為全血時(shí)，熒光免疫層析試紙條還包括在樣品墊與層析膜之間設(shè)置的過濾膜，用于凝固、過濾細(xì)胞(主要為紅細(xì)胞)，該過濾膜可分別與樣品墊和標(biāo)記墊直接毛細(xì)作用接觸， 如圖1所示，也可與標(biāo)記墊和層析膜直接毛細(xì)作用接觸。本發(fā)明實(shí)施例采用預(yù)潤免疫層析方法對樣本中的CK-MB進(jìn)行定量檢測。其中預(yù)潤免疫層析為加入一定體積的緩沖液到層析膜上，潤濕一定時(shí)間后，把樣本加入樣品墊中， 樣本沿層析膜向吸水墊方向流動。預(yù)潤的目的是預(yù)潤濕層析膜，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，以使量子點(diǎn)標(biāo)記物均勻通過層析膜，且減少在層析膜上的非特異性吸附，并減緩樣本流動速度，從而增加特異性結(jié)合。其中緩沖液體積一般為20 80 μ 1，潤濕時(shí)間一般為30秒 2 分鐘，而樣本層析時(shí)間一般為8 25分鐘。本發(fā)明的預(yù)潤免疫層析可為將緩沖液直接或間接滴加于層析膜。而將緩沖液間接滴加于層析膜時(shí)，熒光免疫層析試紙條還包括潤濕墊和連接墊，其中潤濕墊分別與層析膜和連接墊以毛細(xì)作用接觸，連接墊分別與潤濕墊和吸水墊以毛細(xì)作用接觸。緩沖液通過潤濕墊到達(dá)層析膜。本發(fā)明采用的緩沖液為ρΗ 7. 2 11的堿性緩沖液，且該緩沖液可包含牛血清白蛋白、酪蛋白和表面活性劑。其中表面活性劑可包括吐溫20、吐溫80、曲拉通Χ-100、聚乙二醇和聚乙烯基吡咯烷酮等。作為優(yōu)選，本發(fā)明實(shí)施例中，使用緩沖液為包含牛血清白蛋白和吐溫20的pH9. 0 的磷酸緩沖液。 本發(fā)明的檢測用熒光定量儀包含激發(fā)光源模塊、濾光模塊、光電轉(zhuǎn)換模塊、控制分析模塊和軟件系統(tǒng)。其中激發(fā)光源模塊包含光源和聚光裝置，該光源為發(fā)光二極管或激光二極管，波長選擇300 400nm之間或500 600nm之間。濾光模塊包含濾光片輪，該濾光片輪包含不同種濾光片，以獲取相應(yīng)量子點(diǎn)的熒光信號。光電轉(zhuǎn)換模塊包含圖像傳感器或光電倍增管。層析結(jié)束后，在光源激發(fā)下，試紙條產(chǎn)生的熒光信號，經(jīng)過濾光模塊濾除雜散光及背景熒光，到達(dá)光電轉(zhuǎn)換模塊，轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號。其中所獲質(zhì)控帶與定量帶的熒光強(qiáng)度有一定相關(guān)性，主要影響因素有溫度、濕度、基質(zhì)等。本發(fā)明檢測結(jié)果的判定方法為如果質(zhì)控帶熒光信號強(qiáng)度值超過熒光定量儀內(nèi)部設(shè)定的可接受值，說明檢測結(jié)果無效；在檢測結(jié)果有效的前提下，定量帶熒光強(qiáng)度與質(zhì)控帶比值越高，表示CK-MB濃度越高，反之越低。本發(fā)明采用熒光定量儀檢測一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中標(biāo)準(zhǔn)曲線為標(biāo)準(zhǔn)品系列濃度(c)與所對應(yīng)的校正熒光信號強(qiáng)度(F)的關(guān)系曲線，關(guān)系式為F = f(c)。校正熒光信號強(qiáng)度為F= aFg^/Fgi，其中α為校正系數(shù)，受溫度、濕度和基質(zhì)等影響。然后檢測樣本，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣本中CK-MB濃度。本發(fā)明還提供了一種定量檢測肌酸激酶同工酶的熒光免疫層析試劑盒，包括緩沖液、扣卡(11)和熒光免疫層析試紙條，如圖3所示。該試劑盒采用間接預(yù)潤免疫層析方法?？劭?11)為熒光免疫層析試紙條的外部殼結(jié)構(gòu)，包括上樣孔(12)、視窗(14)和潤濕孔 (13)，且具低熒光特性，優(yōu)選為不含熒光劑。熒光免疫層析試紙條結(jié)構(gòu)如圖2所示，其包含樣品墊(1)、標(biāo)記墊(3)、層析膜0)、 潤濕墊(9)、連接墊(10)、吸水墊(7)和底板(8)。層析膜(4)包含質(zhì)控帶( 和定量帶 (6)。其中樣品墊(1)、標(biāo)記墊(3)、層析膜(4)、潤濕墊(9)、連接墊(10)和吸水墊(7)搭載于底板(8)之上，樣品墊(1)連接于標(biāo)記墊(3)，且位于上樣孔(12)的下方，標(biāo)記墊(3)連接于層析膜G)，層析膜(4)上固定有兩條質(zhì)控帶( 和兩條定量帶(6)，且質(zhì)控帶(5)位于定量帶(6)的兩側(cè)，層析膜(4)位于視窗(14)的下方，層析膜(4)連接于潤濕墊(9)，且潤濕墊(9)位于潤濕孔(13)的下方，潤濕墊(9)連接于連接墊(10)，連接墊(10)連接于吸水墊(7)。進(jìn)行全血樣本層析時(shí)，試紙條還包括過濾膜O)，具體結(jié)構(gòu)如圖1所示，其中試紙條包含樣品墊⑴、標(biāo)記墊⑶、層析膜⑷、吸水墊(7)、底板⑶和過濾膜(2)。過濾膜(2) 與樣品墊(1)和層析膜(4)毛細(xì)作用接觸，即過濾膜可連接于樣品墊(1)與標(biāo)記墊(3)之間，也可連接于標(biāo)記墊(3)與層析膜G)。本發(fā)明構(gòu)建的預(yù)潤免疫層析試紙條，其特征是，增加潤濕墊(9)和連接墊(10)，其中潤濕墊分別與層析膜(4)和連接墊(10)毛細(xì)作用接觸，用于減小滴加緩沖液時(shí)，緩沖液對層析膜的沖擊，以潤濕層析膜(4)，并減少非特異性吸附。而連接墊(10)分別與潤濕墊(9)和吸水墊(7)毛細(xì)作用接觸，具有緩慢的吸水速度，以減少潤濕時(shí)的吸水量，促使緩沖液充分潤濕層析膜G)，當(dāng)加樣本層析時(shí)，吸水墊(7) 可通過連接墊(10)吸水，促使樣本層析。試紙條的層析膜(4)具有弱熒光特性，優(yōu)選不含熒光劑，其熒光噪聲在大于550nm 時(shí)很弱，以減少對低濃度目標(biāo)物檢測的影響。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)如下1)本發(fā)明定量檢測CK-MB的熒光免疫層析方法采用量子點(diǎn)作為特異性抗體的標(biāo)記物，與有機(jī)熒光染料相比，具有發(fā)光強(qiáng)度高、激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄、熒光壽命長、表面修飾多功能化及穩(wěn)定性好等優(yōu)勢。并優(yōu)選了 550 1300nm的量子點(diǎn)，以提高與背景的區(qū)分度。2)本發(fā)明試劑盒的組成部件中的扣卡、底板以及層析膜在大于550nm時(shí)均具有低的熒光特性，以減少對量子點(diǎn)熒光信號獲取的影響，從而保證獲得高的熒光信背比，進(jìn)而達(dá)到提高靈敏度的目的。3)本發(fā)明采用熒光定量儀檢測定量帶和質(zhì)控帶熒光信號強(qiáng)度，并以質(zhì)控帶校正定量帶熒光信號強(qiáng)度，進(jìn)而依據(jù)熒光定量儀獲取的標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)CK-MB的定量檢測。其中標(biāo)準(zhǔn)曲線為標(biāo)準(zhǔn)品系列濃度(c)與所對應(yīng)的校正熒光信號強(qiáng)度(F)的關(guān)系曲線，關(guān)系式為F = f(c)。校正熒光信號強(qiáng)度為F= aFg^/Fgi，其中α為校正系數(shù)，受溫度、濕度和基質(zhì)等影響。然后檢測樣本，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣本中CK-MB濃度。4)本發(fā)明利用量子點(diǎn)雙色標(biāo)記技術(shù)，減少質(zhì)控分子對CK-MB檢測的影響，也可減少質(zhì)控分子修飾的量子點(diǎn)對定量帶和層析膜背景的影響，方法簡單快速，靈敏度高，有利于高靈敏定量檢測。5)本發(fā)明可利用預(yù)潤免疫層析技術(shù)，增強(qiáng)特異性結(jié)合，減少非特異性吸附，增強(qiáng)試劑盒的檢測靈敏度，有利于樣品中CK-MB含量極低時(shí)的準(zhǔn)確定量。6)本發(fā)明方法簡單、快速、準(zhǔn)確、成本低，且靈敏很高。與傳統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光法和酶聯(lián)免疫法檢測肌酸激酶同工酶相比，具有操作簡便、快速、不需昂貴的檢測設(shè)備，適合單人份或小批量檢測等優(yōu)點(diǎn)；與常規(guī)膠體金免疫層析方法相比，本發(fā)明具有標(biāo)記穩(wěn)定性好、非特異性低、靈敏度高、線性范圍寬以及定量準(zhǔn)確等優(yōu)勢。


圖1為直接預(yù)潤免疫層析試紙條的組裝示意圖，其中1為樣品墊，2為過濾膜，3為標(biāo)記墊，4為層析膜，5為質(zhì)控帶，6為定量帶，7為吸水墊，8為底板；圖2為間接預(yù)潤免疫層析試紙條的組裝示意圖，其中1為樣品墊，3為標(biāo)記墊，4為層析膜，5為質(zhì)控帶，6為定量帶，7為吸水墊，8為底板，9為潤濕墊，10為連接墊；圖3為熒光免疫層析試劑盒示意圖，其中11為扣卡，12為上樣孔，13為潤濕孔，14 為視窗，5為質(zhì)控帶，6為定量帶。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開了一種定量檢測肌酸激酶同工酶CK-MB的熒光免疫層析方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及試劑盒已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和試劑盒進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明提供的技術(shù)方案為步驟1)用化學(xué)交聯(lián)或生物分子間特異性作用將肌酸激酶同工酶CK-MB的特異性抗體連接到量子點(diǎn)表面，得到抗體修飾的量子點(diǎn)，所述抗體修飾的量子點(diǎn)的發(fā)射波長范圍為 550 1300nm ；步驟2)將步驟1)得到的抗體修飾的量子點(diǎn)固定在標(biāo)記墊上，且標(biāo)記墊上同時(shí)固定有質(zhì)控分子修飾的量子點(diǎn)，所述質(zhì)控分子修飾的量子點(diǎn)的發(fā)射波長與步驟1)得到的抗體修飾的量子點(diǎn)的發(fā)射波長不同，且波長范圍為550 1300·，在層析膜上分別設(shè)有定量帶和兩條質(zhì)控帶，其中質(zhì)控帶固定有能與所述質(zhì)控分子特異性結(jié)合的生物分子，定量帶固定有對應(yīng)CK-MB的與步驟1)所述特異性抗體不同抗原決定簇的特異性抗體；步驟幻以樣品墊、標(biāo)記墊、層析膜、吸水墊和底板構(gòu)建成熒光免疫層析試紙條，其中所述層析膜為弱熒光層析膜，底板具低熒光特性；步驟4)試紙條免疫層析后，檢測定量帶和質(zhì)控帶熒光信號強(qiáng)度，并以質(zhì)控帶熒光信號強(qiáng)度校正定量帶熒光信號強(qiáng)度，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)CK-MB的定量檢測。本發(fā)明熒光免疫層析的原理和檢測方法為采用熒光免疫層析技術(shù)及雙抗體夾心法原理定量檢測人樣本(全血、血清或血漿)中的肌酸激酶同工酶(CK-MB)的含量。檢測時(shí)，首先向潤濕孔中滴加緩沖液，然后將樣本滴加到上樣孔中，樣本先與標(biāo)記墊中的量子點(diǎn)標(biāo)記物相混合，并沿著層析膜向吸水墊方向毛細(xì)運(yùn)動，分別流經(jīng)層析膜上的定量帶和質(zhì)控帶。若樣本中含有CK-MB，則與量子點(diǎn)表面的CK-MB抗體相結(jié)合，當(dāng)層析至定量帶時(shí)，會被預(yù)先包被于該條帶的抗體捕獲，從而構(gòu)成雙抗體夾心復(fù)合物，量子點(diǎn)停留于定量帶。光源激發(fā)下，采用熒光定量儀獲取定量帶和質(zhì)控帶的熒光信號強(qiáng)度，依據(jù)熒光定量儀獲取的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而分析樣本中CK-MB濃度。為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實(shí)施例1 以化學(xué)交聯(lián)法將抗體修飾于量子點(diǎn)并采用直接預(yù)潤免疫層析對CK-MB 的定量檢測(一 )量子點(diǎn)與抗體的修飾分別以人CK-MM和CK-BB為抗原，可免疫得到羊抗人CK-MM抗體和CK-BB抗體。由于CK-MB有M和B兩個(gè)亞基，則CK-MM抗體和CK-BB抗體可分別與CK-MB的M和B亞基結(jié)合，形成雙抗體夾心結(jié)構(gòu)。，向pH 7.4磷酸緩沖液中加入60 11101發(fā)射波長為65011111的量子點(diǎn)、101^ EDC和 15 μ g NHS溶液和10 30 μ g羊抗人CK-BB抗體溶液，混合均勻并于室溫下反應(yīng)4h，加入 Img甘氨酸封閉。用色譜柱或?qū)游鲋蛛x純化，得到CK-BB抗體修飾的量子點(diǎn)。同理得到羊抗兔抗體修飾的量子點(diǎn)。其中CK-BB抗體修飾的量子點(diǎn)的熒光發(fā)射波長為650nm，羊抗兔抗體修飾的量子點(diǎn)的熒光發(fā)射波長為570nm。( 二)試劑盒的構(gòu)建以摩爾比1 1的比例混合均勻上述兩種量子點(diǎn)標(biāo)記物，其中混合液中含有1 15 %蔗糖、0. 01 2 %牛血清白蛋白(BSA)和吐溫20、吐溫80、曲拉通X-100等表面活性劑， 其中表面活性劑含量在0.01 2%之間，然后均勻噴涂在標(biāo)記墊上，37°C干燥后密封，4°C 下保存。以劃膜儀在弱熒光層析膜上劃四條平行條帶，條帶間隔5mm，條帶寬都約為1mm。 其中兩側(cè)的兩條為質(zhì)控帶，中間兩條為定量帶。質(zhì)控帶上噴涂兔免疫球蛋白(兔IgG)，濃度分別為0. 2 lmg/ml和1 ;3mg/ml ；定量帶上噴涂CK-MM多抗，濃度分別為0. 2 lmg/ml和0. 5 2mg/ml。37 °C干燥后密封，4°C下保存。在黑色底板上，依次粘貼層析膜(長30cm，寬2. 5cm)、標(biāo)記墊(長30cm，寬8mm)、 過濾膜(長3Ocm,寬l6mm)、樣品墊(長3Ocm,寬l6mm)、連接墊(長3Ocm,寬IOmm)、潤濕墊 (長30cm，寬IOmm)和吸水墊(長30cm，寬16mm)。膜與膜之間都要緊密相連，制成預(yù)潤熒光免疫層析試紙大板，示意圖如圖1所示。用切條機(jī)將粘貼好的試紙大板縱向切成4mm寬的試紙條，放入低熒光扣卡中組裝成不含緩沖液的免疫層析試劑盒，干燥后密封，與緩沖液共同構(gòu)建為熒光免疫層析試劑盒，4°C避光保存。(三)樣本檢測用正常人全血作稀釋液，將CK-MB標(biāo)準(zhǔn)品配制系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液如下 0. 125ng/mL、0. 25ng/mL、0. 5ng/mL>1. 0ng/mL、2. 0ng/mL、4. 0ng/mL、8. Ong/mL、16ng/mL、 32ng/mL、64ng/mL、128ng/mL 禾口 256ng/mL。緩沖液為含有0. 1 0. 5% BSA和0. 05 1 %吐溫20的pH9. O磷酸緩沖液。層析時(shí)先將50 μ 1緩沖液滴加到層析膜上，1分鐘后，將100 μ 1陰性全血或標(biāo)準(zhǔn)品溶液滴加到上樣孔中，13分鐘后，以熒光定量儀檢測(每個(gè)樣本分別用3個(gè)試紙條測定3次，取平均值)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將50 μ 1緩沖液滴加到層析膜上，1分鐘后，將100 μ 1全血樣本滴加到上樣孔中， 13分鐘后以熒光定量儀檢測，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣本中CK-MB的濃度。結(jié)果表明，其最低檢測限為0.5ng/mL，最低定量限為1. Ong/mL，在定量檢測范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R2>0. 99，未出現(xiàn)HOOK效應(yīng)，且批內(nèi)與批間重復(fù)性均較好，可為心血管疾病診斷提供參考。實(shí)施例2 以生物素-親和素法將抗體修飾于量子點(diǎn)并采用間接預(yù)潤免疫層析對 CK-MB的定量檢測(一 )量子點(diǎn)合成及修飾根據(jù)實(shí)施例1的方法，制備鏈霉親和素修飾的量子點(diǎn)。同理得到羊抗兔抗體修飾的量子點(diǎn)。將CK-BB單抗用0. lmol/L碳酸氫鈉緩沖液(pH 8. 0)稀釋到lmg/ml，用Iml 二甲亞砜(DMSO)溶解Img N-羥基琥珀酰亞胺生物素(NHSB)，取Iml單抗溶液加入20 120 μ 1 NHSB溶液，室溫下反應(yīng)4小時(shí)后，加入lmol/L NH4Cl,在室溫下攪拌10分鐘。以超濾離心純化，以除去游離的生物素，得到生物素化的單抗。以1 3 1 12的比例混合鏈霉親和素修飾的量子點(diǎn)和生物素化的單抗，得到 CK-BB單抗修飾的量子點(diǎn)。其中CK-BB抗體修飾的量子點(diǎn)的熒光發(fā)射波長為900nm，羊抗兔抗體修飾的量子點(diǎn)的熒光發(fā)射波長為600nm。( 二)試劑盒的構(gòu)建及樣本檢測根據(jù)實(shí)施例1的方法把量子點(diǎn)標(biāo)記物噴涂于標(biāo)記墊，把抗體和質(zhì)控分子噴涂于層析膜的定量帶和質(zhì)控帶。在黑色底板上，依次粘貼上層析膜(長30cm，寬2. 5cm)、標(biāo)記墊(長30cm，寬8mm)、 樣品墊(長3Ocm,寬l6mm)、連接墊(長3Ocm,寬10mm)、潤濕墊(長3Ocm,寬10mm)和吸水墊(長30cm，寬16mm)。膜與膜之間都要緊密相連，制成熒光免疫層析試紙大板，示意圖如圖2所示。用切條機(jī)將粘貼好的試紙大板縱向切成4mm寬的試紙條，放入低熒光扣卡中組裝成不含緩沖液的免疫層析試劑盒，如圖3所示，干燥后密封，與緩沖液共同構(gòu)建為熒光免疫層析試劑盒，4°C避光保存。(三)樣本檢測根據(jù)實(shí)施例1進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品配制。緩沖液為含有0. 05 0. 2% BSA和0. 05 1 % Tween-20的pH9. 0磷酸緩沖液。 層析時(shí)先將50 μ 1緩沖液滴加到潤濕孔中，1分鐘后，將100 μ 1陰性血清或標(biāo)準(zhǔn)品溶液滴加到上樣孔中，13分鐘后以熒光定量儀檢測(每個(gè)樣本分別用3個(gè)試紙條測定3次，取平均值)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將50 μ 1緩沖液滴加到潤濕孔中，1分鐘后，將100 μ 1血清樣本滴加到上樣孔中， 13分鐘后以熒光定量儀檢測，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣本中CK-MB的濃度。結(jié)果表明，其最低檢測限為0. Ing/mL，最低定量限為0. 25ng/mL，在定量檢測范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R2 > 0. 99，未出現(xiàn)HOOK效應(yīng)，且批內(nèi)與批間重復(fù)性均較好，可為心血管疾病診斷提供參考。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種定量檢測肌酸激酶同工酶CK-MB的熒光免疫層析方法，其特征在于，包括以下步驟步驟1)用化學(xué)交聯(lián)或生物分子間特異性作用將肌酸激酶同工酶CK-MB的特異性抗體連接到量子點(diǎn)表面，得到抗體修飾的量子點(diǎn)，所述抗體修飾的量子點(diǎn)的發(fā)射波長范圍為 550 1300nm ；步驟幻將步驟1)得到的抗體修飾的量子點(diǎn)固定在標(biāo)記墊上，且標(biāo)記墊上同時(shí)固定有質(zhì)控分子修飾的量子點(diǎn)，所述質(zhì)控分子修飾的量子點(diǎn)的發(fā)射波長與步驟1)得到的抗體修飾的量子點(diǎn)的發(fā)射波長不同，且波長范圍為550 1300·，在層析膜上分別設(shè)有定量帶和質(zhì)控帶，其中質(zhì)控帶固定有能與所述質(zhì)控分子特異性結(jié)合的生物分子，定量帶固定有對應(yīng) CK-MB的與步驟1)所述特異性抗體不同抗原決定簇的特異性抗體；步驟幻以樣品墊、標(biāo)記墊、層析膜、吸水墊和底板構(gòu)建成熒光免疫層析試紙條，其中所述層析膜為弱熒光層析膜，底板具低熒光特性；步驟4)試紙條免疫層析后，檢測定量帶和質(zhì)控帶熒光信號強(qiáng)度，并以質(zhì)控帶熒光信號強(qiáng)度校正定量帶熒光信號強(qiáng)度，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)CK-MB的定量檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，步驟1)所述抗體修飾的量子點(diǎn)的發(fā)射波長為650nm，步驟2、所述質(zhì)控分子修飾的量子點(diǎn)的發(fā)射波長為570nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，步驟1)所述抗體修飾的量子點(diǎn)的發(fā)射波長為900nm，步驟2、所述質(zhì)控分子修飾的量子點(diǎn)的發(fā)射波長為600nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，步驟1)所述量子點(diǎn)為單一化合物形成的量子點(diǎn)或幾種化合物組成的復(fù)合量子點(diǎn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，所述化合物為選自aiS、 CdS、HgS、MgS、CdSe、MgSe、ZnSe, PbSe、PbSe, CdTe、MgTe、ZnTe、HgTe、InAs、InP 中的任意一種或幾種，且可摻雜Cu、Mn和Hg。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，步驟幻所述層析膜在大于 550nm時(shí)熒光很弱或不含熒光劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，步驟幻所述底板為黑色，表面附有不干膠，且兩者均不含熒光劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，步驟幻所述熒光免疫層析試紙條還包括能使樣本中液體與細(xì)胞分離的過濾膜。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，步驟4)所述免疫層析為預(yù)潤免疫層析，其中預(yù)潤免疫層析為先以緩沖液預(yù)潤層析膜，再加入樣本到樣品墊中，樣本流經(jīng)定量帶和質(zhì)控帶后，進(jìn)行熒光定量檢測。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，所述預(yù)潤層析膜為將緩沖液直接滴加于層析膜。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，當(dāng)所述預(yù)潤層析膜為將緩沖液間接滴加于層析膜時(shí)，步驟幻所述熒光免疫層析試紙條還包括潤濕墊和連接墊，其中潤濕墊分別與層析膜和連接墊以毛細(xì)作用接觸，連接墊分別與潤濕墊和吸水墊以毛細(xì)作用接觸。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，所述緩沖液為pH7. 2 11的堿性緩沖液。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，所述堿性緩沖液為包含牛血清白蛋白、酪蛋白和表面活性劑的堿性緩沖液。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，所述堿性緩沖液為包含牛血清白蛋白和吐溫20的pH9. 0的磷酸緩沖液。
15.一種定量檢測肌酸激酶同工酶CK-MB的熒光免疫層析試劑盒，包括緩沖液、扣卡 (11)和熒光免疫層析試紙條，其特征在于，所述扣卡(U)為熒光免疫層析試紙條的外部殼結(jié)構(gòu)，包括上樣孔(12)、視窗(14)和潤濕孔(1 ；所述熒光免疫層析試紙條包括樣品墊 (1)、標(biāo)記墊(3)、層析膜(4)、潤濕墊(9)、連接墊(10)、吸水墊(7)和底板(8)，其中樣品墊 (1)、標(biāo)記墊(3)、層析膜(4)、潤濕墊(9)、連接墊(10)和吸水墊(7)搭載于底板(8)之上， 樣品墊(1)連接于標(biāo)記墊(3)，且位于上樣孔(12)的下方，標(biāo)記墊(3)連接于層析膜0)， 層析膜(4)上固定有兩條質(zhì)控帶( 和兩條定量帶(6)，且質(zhì)控帶( 位于定量帶(6)的兩側(cè)，層析膜(4)位于視窗(14)的下方，層析膜(4)連接于潤濕墊(9)，且潤濕墊(9)位于潤濕孔(13)的下方，潤濕墊(9)連接于連接墊(10)，連接墊(10)連接于吸水墊(7)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的熒光免疫層析試劑盒，其特征在于，所述熒光免疫層析試紙條還包括過濾膜O)，其中所述過濾膜( 分別與樣品墊(1)或?qū)游瞿?4)毛細(xì)作用接觸。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的熒光免疫層析試劑盒，其特征在于，所述扣卡(11)具有低熒光特性或不含熒光劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種定量檢測急性心肌梗塞標(biāo)志物肌酸激酶同工酶CK-MB的熒光免疫層析方法及其試劑盒。本發(fā)明的定量檢測肌酸激酶同工酶的熒光免疫層析方法利用量子點(diǎn)優(yōu)良的熒光特性，結(jié)合雙色標(biāo)記技術(shù)和免疫層析技術(shù)，在優(yōu)化試紙條各組成部件的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)的熒光定量檢測。與常規(guī)膠體金免疫層析方法相比，本發(fā)明具有標(biāo)記穩(wěn)定性好、非特異性低、靈敏度高、線性范圍寬以及定量準(zhǔn)確的優(yōu)勢。本發(fā)明試劑盒對CK-MB進(jìn)行定量檢測，適用于全血、血清和血漿樣本的檢測，可為心腦血管疾病診斷提供參考，廣泛用于基層醫(yī)院和診所。
文檔編號G01N33/573GK102520173SQ20111045381
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日
發(fā)明者王東 申請人:深圳康美生物科技股份有限公司