專利名稱：微量尿白蛋白膠體金檢測試劑盒及其制備工藝的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及膠體金免疫層析領域，具體涉及一種微量尿白蛋白膠體金檢測試劑盒及其制備工藝。
背景技術(shù)：
微量白蛋白尿(又名微量尿白蛋白，Microalbuminuria, MAU)是指在尿中出現(xiàn)的微量白蛋白。白蛋白是一種血液中的正常蛋白質(zhì)，在正常生理條件下尿液中也會出現(xiàn)極少量白蛋白，排泄量一般在30mg/天(或20mg/L)之內(nèi)。人尿液中的白蛋白達到在30 300mg/ 天或20 200mg/L濃度間稱為微量白蛋白尿，白蛋白濃度大于300mg/天或200mg/L時稱為大量白蛋白尿。
微量尿白蛋白(MAU)的非正常出現(xiàn)，通常被認為是腎功能衰竭、糖尿病和心血管疾病并發(fā)癥等的重要臨床標志之一。因此，尿液中白蛋白存在水平的檢測對腎病、糖尿病和心血管疾病的早期診斷、早期治療和減小風險有重要的參考價值和臨床意義。
目前，臨床檢測微量蛋白質(zhì)診斷早期腎損害的方法有放射免疫分析法(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附實驗法(ELISA)等，這些檢查較為繁瑣、歷時較長、費用較高，不利于臨床醫(yī)生的及時診斷和療效觀察。
國內(nèi)現(xiàn)有的微量尿白蛋白檢測方法的相關(guān)專利有申請?zhí)?1U6895. 6，提供了一種快速檢測腎臟損害的尿蛋白芯片，但其未對芯片的制備工藝、檢測靈敏度、最低檢出量等重要特性給予闡述，限制了其應用的可靠性。本發(fā)明的目的在于提供一種檢測試劑盒是利用膠體金層析技術(shù)，以抗原抗體免疫反應法，來檢測人尿液中出現(xiàn)的微量白蛋白，該試劑盒具有等優(yōu)點。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，從提高檢測靈敏度出發(fā)，提供一種檢測靈敏度高、特異性強、檢測快速的微量尿白蛋白膠體金檢測試劑盒。
本發(fā)明一方面公開了一種微量尿白蛋白膠體金檢測試劑盒，包括試劑條，所述試劑條包括襯底、濾樣紙、免疫膠體金紙片、免疫硝酸纖維素膜和吸水紙，濾樣紙、免疫膠體金紙片、免疫硝酸纖維素膜和吸水紙依次首尾銜接并固定于襯底上；所述免疫膠體金紙片上包被有膠體金標記的抗人白蛋白單克隆抗體I，所述免疫硝酸纖維素膜上設有包被有抗人白蛋白單克隆抗體II的檢測線和包被有羊抗鼠IgG的質(zhì)控線。
較優(yōu)的，所述膠體金的顆粒大小為39 42nm，所述膠體金是由兩步還原法制備獲得。
更優(yōu)的，所述兩步還原法的步驟為
a)第一次還原氯金酸溶液制備濃度為0. 0004-0. 0005mol/L的HAuCl4水溶液，加熱煮沸20-30分鐘，之后邊攪拌邊加入檸檬酸三鈉水溶液，HAuCl4與檸檬酸三鈉的摩爾比為 1 8 9，超聲振蕩2-3分鐘后冷卻至室溫，即制得14 16nm粒徑的膠體金原溶液；
b)第二次還原氯金酸溶液將第一步制得的膠體金原溶液放置4. 0°C水浴中保持溫度恒定，隨后按膠體金原溶液與HAuCl4水溶液體積比1 1. 9 2. 0加入4. 0°C的 0. 003-0. 004mol/LHAuCl4水溶液，隨后立即邊攪拌邊滴加4. 0°C的抗壞血酸與PVP的混合水溶液，加入的抗壞血酸與本步驟加入的HAuCl4的摩爾比為25 沈1，加入的PVP與本步驟加入的HAuCl4的重量比為1 2.0 2.1，反應中保持溫度恒定，攪拌至反應完全，溶液呈透明的酒紅色，制得39-42nm粒徑的膠體金溶液；
兩步還原法中，配置各種水溶液均采用雙蒸水。
最優(yōu)的，步驟a)中，加入檸檬酸三鈉水溶液的濃度為0. 01-0. 02mol/L。
最優(yōu)的，步驟a)中，超聲震蕩的頻率為20-30KHZ。
最優(yōu)的，步驟b)中，抗壞血酸與PVP的混合水溶液的滴加速度為1-2滴/S。
最優(yōu)的，步驟b)中，所述抗壞血酸與PVP的混合水溶液中，抗壞血酸的濃度為 0. 017-0. 019mol/L, PVP 的濃度為 0. 137-0. 139g/L。
步驟b)中，攪拌反應約為50-70分鐘。
采用上述方法制得的膠體金清亮透明，粒徑尺寸均一，無凝集顆粒，基本未發(fā)現(xiàn)非球形粒子。
較優(yōu)的，所述免疫膠體金紙片是經(jīng)過預處理的玻璃纖維紙，所述預處理的預處理液包括0.5 0. 8v% Tween-20，12 18w/v%蔗糖，溶劑為水。
更優(yōu)的，所述預處理的預處理液包括0. 7% Tween-20,16W/V%蔗糖，溶劑為水。
本發(fā)明的另一方面，提供了一種微量尿白蛋白膠體金檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟
1)兩步還原法制備膠體金溶液；
2)用步驟1)制備的膠體金標記抗人白蛋白單克隆抗體I，獲得膠體金標記的抗人白蛋白單克隆抗體I ；
3)免疫膠體金紙片的制備預處理玻璃纖維紙；稀釋步驟幻制備的膠體金標記的抗人白蛋白單克隆抗體I，得到免疫膠體金溶液；用所述免疫膠體金溶液包被預處理過的玻璃纖維紙，獲得免疫膠體金紙片；
4)將抗人白蛋白單克隆抗體II和羊抗鼠抗體分別噴在硝酸纖維素膜檢測線和質(zhì)控線的位置上，烘干備用，制得免疫硝酸纖維素膜；
5)將濾樣紙、免疫膠體金紙片、免疫硝酸纖維素膜、吸水紙依次粘貼在膠板上，切裁制得試劑條；
6)將試劑條裝入塑料盒制得檢測試劑盒，獲得微量尿白蛋白膠體金檢測試劑盒。 較優(yōu)的，所述膠體金的顆粒大小為39 42nm，所述膠體金是由兩步還原法制備獲得。更優(yōu)的，所述兩步還原法的步驟為
a)第一次還原氯金酸溶液制備濃度為0. 0004-0. 0005mol/L的HAuCl4水溶液，加熱煮沸20-30分鐘，之后邊攪拌邊加入檸檬酸三鈉水溶液，HAuCl4與檸檬酸三鈉的摩爾比為 1 8 9，超聲振蕩2-3分鐘后冷卻至室溫，即制得14 16nm粒徑的膠體金原溶液。
b)第二次還原氯金酸溶液將第一步制得的膠體金原溶液放置4. 0°C水浴中保持溫度恒定，隨后按膠體金原溶液與HAuCl4水溶液體積比1 1. 9 2. 0加入4. 0°C的 0. 003-0. 004mol/LHAuCl4水溶液，隨后立即邊攪拌邊滴加4. 0°C的抗壞血酸與PVP(聚乙烯吡咯烷酮)的混合水溶液，加入的抗壞血酸與本步驟加入的HAuCl4的摩爾比為25 26 1，加入的PVP與本步驟加入的HAuCl4的重量比為1 2. 0 2. 1，反應中保持溫度恒定，攪拌至反應完全，溶液呈透明的酒紅色，制得39-42nm粒徑的膠體金溶液。
兩步還原法中，配置各種水溶液均采用雙蒸水。
最優(yōu)的，步驟a)中，加入檸檬酸三鈉水溶液的濃度為0. 01-0. 02mol/L。
最優(yōu)的，步驟a)中，超聲震蕩的頻率為20-30KHZ。
最優(yōu)的，步驟b)中，抗壞血酸與PVP (聚乙烯吡咯烷酮)的混合水溶液的滴加速度為1-2滴/s。
最優(yōu)的，步驟b)中，所述抗壞血酸與PVP的混合水溶液中，抗壞血酸的濃度為 0. 017-0. 019mol/L, PVP 的濃度為 0. 137-0. 139g/L。
步驟b)中，攪拌反應約為50-70分鐘。
較優(yōu)的，步驟2)中，膠體金標記抗人白蛋白單克隆抗體I的比例為向膠體金中按照6μ g抗體/(ml膠體金)的比例加入抗人白蛋白單克隆抗體I，制備得到免疫膠體金。
較優(yōu)的，所述步驟幻免疫膠體金紙片的制備為
A.用噴金緩沖液稀釋膠體金標記的抗人白蛋白單克隆抗體I，獲得OD54tl值為1.6 的免疫膠體金溶液；
B.用預處理液浸泡玻璃纖維紙，干燥后，再用免疫膠體金溶液噴涂預處理后的玻璃纖維紙，干燥，制得免疫膠體金紙片。
本發(fā)明中，指體積百分比；w/v%指重量體積百分比，如即為IOOml溶液中含lg。
更優(yōu)的，所述步驟A中的噴金緩沖液配方如下8 12v% 1.0M Tris液，0.2 0. 4界八％聚乙二醇20000,0. 15 0. 25w/v %牛血清白蛋白，0. 1 0. 3w/v%脫脂牛奶， 0. 25 0. 35w/v %酪蛋白，和0. 02 0. 08w/v%疊氮化鈉，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. 0 士0. 1，余量為水。
最優(yōu)的，所述步驟A中的噴金緩沖液配方如下10v% 1.0M 1Tris液、0. 3 八％聚乙二醇20000,0. 2W/V%牛血清白蛋白，0. 2w/v%脫脂牛奶、0. 3w/v%酪蛋白，和0. 05w/v% 疊氮化鈉，用鹽酸調(diào)節(jié)PH至8.0 士0. 1，余量為水。
更優(yōu)的，所述步驟B中的預處理液包括0. 5 0. 8v% Tween-20，12 18 八％蔗糖，溶劑為水。
最優(yōu)的，所述步驟B中的預處理液包括0.7v% TWeen-20，16W/V%蔗糖，溶劑為水。
更優(yōu)的，步驟B中，每30ml預處理液浸泡玻璃纖維紙^lmmX 220mm，干燥后，再用免疫膠體金溶液噴涂玻璃纖維紙，每26ImmX 220mm玻璃纖維紙上噴涂25ml免疫膠體金溶液，干燥，制得免疫膠體金紙片。
較優(yōu)的，步驟4)中，噴在硝酸纖維素膜質(zhì)控線(C線)上的羊抗鼠IgG的濃度為 0. 15 0. 3mg/ml，噴在硝酸纖維素膜檢測線(T線)上的抗人白蛋白單克隆抗體II濃度為 0. 2 ~ 0. 4mg/ml。
較優(yōu)的，每Im長硝酸纖維素膜分別包被有Iml的羊抗鼠IgG和抗人白蛋白單克隆抗體II溶液，檢測線和質(zhì)控線的間距為4. 0 6. 0mm。
本發(fā)明的關(guān)鍵在于(1)兩步還原法制備分子大小均一的膠體金顆粒，( 疫膠體金紙片制備工藝的改進，其余步驟均可采用常規(guī)制備膠體金檢測試劑條的條件進行。本發(fā)明的微量尿白蛋白膠體金檢測試劑盒的工作原理，即是利用高度特異的抗體-抗原特異結(jié)合反應及免疫膜層析技術(shù)來定性檢測人尿液中出現(xiàn)的白蛋白。檢測時，(一)如果尿液中沒有人白蛋白尿液中的其他成分不與免疫膠體金紙片上的抗人白蛋白單克隆抗體I-膠體金結(jié)合，尿液經(jīng)毛細作用在硝酸纖維素膜上層析，依次通過T線和C線，在樣品混合物通過T線時，不會被包被在T線的抗人白蛋白單克隆抗體II 結(jié)合，T線捕捉不到膠體金因而不顯色，只在C線出現(xiàn)一條紅色線條。(二)如果尿液中含有人白蛋白尿液中人白蛋白便首先與免疫膠體金紙片上的抗人白蛋白單克隆抗體I-膠體金結(jié)合，形成“人白蛋白-抗人白蛋白單克隆抗體I-膠體金”；樣品混合物繼續(xù)在硝酸纖維素膜上層析，依次通過T線和C線，在樣品混合物通過T線時，包被在T線的抗人白蛋白單克隆抗體II與尿樣中的人白蛋白結(jié)合形成“抗人白蛋白單克隆抗體II-人白蛋白-抗人白蛋白單克隆抗體I-膠體金”復合物，T線捕捉到膠體金顆粒因而顯色；尿液中人白蛋白濃度的越高，T線的顏色越深。(三)包被在質(zhì)控線(C線)上的羊抗鼠IgG為多克隆抗體，其總是能捕獲鼠源性的單克隆抗體，所以總能與抗人白蛋白單克隆抗體I-膠體金形成“羊抗鼠IgG-抗人白蛋白單克隆抗體I-膠體金”復合物；因此，在C線處總是形成一定深度的紅線，C線的出現(xiàn)和尿液中有無人白蛋白無關(guān)，它的出現(xiàn)表明檢測操作正確、試劑盒反應系統(tǒng)工作正常；同時，C線也是判斷T線強度的參照線。本發(fā)明試劑盒的使用方法為1.將試劑盒放置在水平臺面上。2.用加樣吸管吸取尿樣，然后滴3滴(約120 μ 1)尿樣到試劑盒的加樣孔中。每檢測一份不同的樣品注意要使用不同的吸管。3.觀察結(jié)果在滴加樣品后10-15分鐘判讀結(jié)果。檢測結(jié)果的判斷方法陽性在結(jié)果觀察窗口內(nèi)出現(xiàn)兩條色帶，即檢測線(Τ線)和質(zhì)控線(C線)位置各出現(xiàn)一條紅色線條，表示樣品中有尿白蛋白的存在。陰性只在結(jié)果觀察窗口的質(zhì)控線(C線)位置出現(xiàn)一條紅色線條，檢測線(Τ線) 未出現(xiàn)任何線條，表示樣品中無尿白蛋白的存在。無效質(zhì)控線(C線)不出現(xiàn)。任何情況下，C線均應形成，表示加樣和操作正確。 C線未出現(xiàn)表明測試結(jié)果是不確定的，應重做。本發(fā)明的有益效果(1)采用了兩步還原法制備膠體金分子，使得到的膠體金分子呈大小均一的40nm 的球形顆粒；由于膠體金顆粒大小適中、整體均一，使其與單克隆抗體的結(jié)合效率更高、效果更穩(wěn)定。(2)免疫膠體金紙片制備步驟中，通過采用合理配方對玻璃纖維膜進行預處理及采用較好的噴金緩沖液，在保障膠體金釋放完全的基礎上可有效減慢檢測時免疫膠體金的釋放層析，有利于抗原抗體充分反應結(jié)合，有效的提高了反應的靈敏度，同樣的閾值下，還可降低免疫膠體金的用量，節(jié)約成本。(3)本發(fā)明制備的微量尿白蛋白膠體金檢測試劑盒操作簡單，檢測結(jié)果肉眼可見，無需特殊實驗儀器和專業(yè)技術(shù)人員；檢測快速，10-15分鐘內(nèi)可顯示檢測結(jié)果；特異性強， 與牛奶、人血紅蛋白、PBS緩沖液反應結(jié)果均為陰性；而且檢測結(jié)果費用低廉，儲存和運輸方便等優(yōu)點。


圖1 微量尿白蛋白膠體金檢測試劑盒試劑條示意圖(1.濾樣紙2.免疫膠體金紙 3.免疫硝酸纖維素膜4.吸水紙5.檢測線6 質(zhì)控線)圖2:微量白蛋白尿膠體金檢測試劑盒示意圖(5.檢測線6.質(zhì)控線7.加樣口 8.盒座)圖3 膠體金透射電鏡圖
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。實施例1微量尿白蛋白膠體金檢測試劑盒的制備一、試劑來源抗人白蛋白單克隆抗體I、抗人白蛋白單克隆抗體II、羊抗鼠IgG多克隆抗體(購自美國美迪生物技術(shù)有限公司MAXMED LABORATORIES INC.)硝酸纖維素薄膜、玻璃纖維紙(購自德國賽多利斯公司SART0RIUS)二、制備步驟方法1 1、膠體金的制備a)第一次還原氯金酸溶液將6ml 0. 0164mol/L的HAuCl4水溶液加入200ml雙蒸水中，加熱煮沸30分鐘，之后緩慢攪動并準確加入50ml 0. 016mol/L檸檬酸三鈉水溶液。超聲振蕩2分鐘后冷卻至室溫，超聲震蕩的頻率為25KHZ，制得約15nm粒徑的膠體金原溶液。b)第二次還原氯金酸溶液取第一步制得的膠體金原核溶液^ml,并放置于4°C 水浴鍋中穩(wěn)定溫度，隨后加入50ml預冷為4. O0C的0. 0035mol/L HAuCl4水溶液并立即緩慢滴加250ml預冷為4. O0C的含0. 018mol/L的抗壞血酸與0. 138g/L PVP的混合水溶液，滴加速度為1-2滴/s，攪拌反應1小時，溶液呈透明的酒紅色，制得40nm粒徑的膠體金溶液。制備好的膠體金顆粒通過透射電鏡觀察，結(jié)果見圖3，所制備的膠體金顆粒分散性好，粒徑大小均一，為40nm左右。2.免疫膠體金制備a)將抗人白蛋白單克隆抗體I用0. IM pH 7. 9的磷酸鹽緩沖液稀釋至濃度為 1. Omg/ml的抗體溶液。b)取IOOOml的膠體金溶液，往里加入1/10倍膠體金體積的0. IM pH7. 9磷酸鹽緩沖液混合3分鐘。在快速攪拌下，再緩緩將稀釋的抗人白蛋白單克隆抗體I溶液6ml加入其中，室溫反應5分鐘并不時緩緩攪拌。c)反應結(jié)束后，在上述反應液中快速加入25ml的10%的牛血清白蛋白(BSA)溶液。室溫反應5分鐘并不時緩緩攪拌。
d)將制備好的免疫膠體金8000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，保留沉淀，并收集上清 10000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，棄上清。收集兩次離心沉淀用含有0. 1 % BSA的硼酸緩沖液復溶到OD54tl為14。3.免疫膠體金紙片的制備1)預處理液的制備準確稱取7ml Tween-20，160g蔗糖，加純化水定容至 IOOOml ；2)噴金緩沖液的制備取800ml純化水，往里加入IOOml 1. OM Tris液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. 0。準確稱取3. Og聚乙二醇20000、2. Og牛血清白蛋白，2. Og脫脂牛奶，3. Og酪蛋白溶液和0. 5g疊氮化鈉加入純化水中，充分溶解，混合均勻，用純化水定容至1000ml。3)用噴金緩沖液稀釋免疫膠體金，至溶液OD54tl值為1. 6，獲得免疫膠體金溶液。4)用第一步獲得的預處理液浸泡玻璃纖維紙，每30ml預處理液浸泡玻璃纖維紙 261mmX 220mm，干燥后，再用免疫膠體金溶液噴涂玻璃纖維紙，每^lmmX 220mm玻璃纖維紙上噴涂25ml免疫膠體金溶液，干燥，制得免疫膠體金紙片。4、免疫硝酸纖維素膜的制備1)將羊抗鼠IgG用磷酸鹽緩沖液稀釋成0. 2mg/ml，制得質(zhì)控線(C線)溶液。2)將抗人白蛋白單克隆抗體II用磷酸鹽緩沖液稀釋至蛋白濃度為0. 3mg/ml制得檢測線(T線)溶液。3)用點膜機噴點C、T線溶液，制得免疫硝酸纖維素膜。每Im長硝酸纖維素膜各包被有Iml的C線和T線溶液，檢測線和質(zhì)控線的間距為5. 0mm。5、將濾樣紙、免疫膠體金紙片、免疫硝酸纖維素膜、吸水紙依次粘貼在膠板上，切裁成寬度為4mm的試劑條(如圖1所示)。6、將檢測試劑條裝入塑料盒內(nèi)即得微量尿白蛋白膠體金檢測試劑盒。方法2 1、膠體金的制備參考本實施例方法1的步驟。2、抗體的制備參考本實施例方法1的步驟。3、免疫膠體金紙片的制備1)預處理液的制備準確稱取8ml Tween-20,120g蔗糖，加純化水定容至 IOOOml ；2)噴金緩沖液的制備取800ml純化水，往里加入80ml 1. OM Tris液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. 0。準確稱取4. Og聚乙二醇20000、1. 5g牛血清白蛋白，3. Og脫脂牛奶，2. 5g酪蛋白溶液和0. 2g疊氮化鈉加入純化水中，充分溶解，混合均勻，用純化水定容至1000ml。3)用噴金緩沖液稀釋免疫膠體金，至溶液OD54tl值為1. 6。4)用第一步獲得的預處理液浸泡玻璃纖維紙，每30ml預處理液浸泡玻璃纖維紙 261mmX 220mm,干燥后，再用免疫膠體金溶液噴涂玻璃纖維紙，每^lmmX 220mm玻璃纖維紙上噴涂25ml免疫膠體金溶液，干燥，制得免疫膠體金紙片。4、免疫硝酸纖維素膜的制備1)將羊抗鼠IgG用磷酸鹽緩沖液稀釋成0. 3mg/ml，制得質(zhì)控線(C線)溶液。2)將抗人白蛋白單克隆抗體II用磷酸鹽緩沖液稀釋至蛋白濃度為0. 2mg/ml制得檢測線(T線)溶液。
3)用點膜機噴點C、T線溶液，制得免疫硝酸纖維素膜。每Im長硝酸纖維素膜各包被有Iml的C線和T線溶液，檢測線和質(zhì)控線的間距為4. 0mm。5、將濾樣紙、免疫膠體金紙片、免疫硝酸纖維素膜、吸水紙依次粘貼在膠板上，切裁成寬度為4mm的試劑條。6、將檢測試劑條裝入塑料盒內(nèi)即得檢測試劑盒。方法3:1、膠體金的制備參考本實施例方法1的步驟。2、抗體的制備參考本實施例方法1的步驟。3、免疫膠體金紙片的制備1)預處理液的制備準確稱取5ml Tween-20,180g蔗糖，加純化水定容至 IOOOml ；2)噴金緩沖液的制備取800ml純化水，往里加入120ml 1. OM Tris液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. 0。準確稱取2. Og聚乙二醇20000、2. 5g牛血清白蛋白，1. Og脫脂牛奶，3. 5g酪蛋白溶液和0. 8g疊氮化鈉加入純化水中，充分溶解，混合均勻，用純化水定容至1000ml。3)用噴金緩沖液稀釋免疫膠體金，至溶液OD54tl值為1.6。4)用第一步獲得的預處理液浸泡玻璃纖維紙，每30ml預處理液浸泡玻璃纖維紙 261mmX 220mm,干燥后，再用免疫膠體金溶液噴涂玻璃纖維紙，每^lmmX 220mm玻璃纖維紙上噴涂25ml免疫膠體金溶液，干燥，制得免疫膠體金紙片。4、免疫硝酸纖維素膜的制備1)將羊抗鼠IgG用磷酸鹽緩沖液稀釋成0. 15mg/ml，制得質(zhì)控線(C線)溶液。2)將抗人白蛋白單克隆抗體11用磷酸鹽緩沖液稀釋至蛋白濃度為0. 4mg/ml制得檢測線(T線)溶液。3)用點膜機噴點C、T線溶液，制得免疫硝酸纖維素膜。每Im長硝酸纖維素膜各包被有Iml的C線和T線溶液，檢測線和質(zhì)控線的間距為6. 0mm。5、將濾樣紙、免疫膠體金紙片、免疫硝酸纖維素膜、吸水紙依次粘貼在膠板上，切裁成寬度為4mm的試劑條。6、將檢測試劑條裝入塑料盒內(nèi)即得檢測試劑盒。實施例2微量尿白蛋白膠體金檢測試劑盒的靈敏度實驗檢測方法1、取實施例1制得的微量尿白蛋白膠體金檢測試劑盒，將試劑盒放置在水平臺面上。2、用加樣吸管吸取待測尿樣，然后滴2-3滴(約100 μ 1)樣品到試劑盒的加樣孔中，每檢測一份不同的樣品使用不同的吸管。3、觀察結(jié)果在滴加樣品后10-15分鐘判讀結(jié)果。檢測樣品配置人白蛋白濃度為7. 5 μ g/mlUO μ g/ml、15 μ g/ml、30 μ g/ml的質(zhì)控參考品作為標準品。檢測結(jié)果表1試劑盒靈敏度結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種微量尿白蛋白膠體金檢測試劑盒，包括試劑條，所述試劑條包括襯底、濾樣紙、 免疫膠體金紙片、免疫硝酸纖維素膜和吸水紙，所述濾樣紙、免疫膠體金紙片、免疫硝酸纖維素膜和吸水紙依次首尾銜接并固定于所述襯底上，其特征在于，所述免疫膠體金紙片上包被有膠體金標記的抗人白蛋白單克隆抗體I，免疫硝酸纖維素膜上設有包被了抗人白蛋白單克隆抗體II的檢測線和包被了羊抗鼠IgG的質(zhì)控線。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述膠體金的顆粒大小為39 42nm，所述膠體金是由兩步還原法制備獲得。
3.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述免疫膠體金紙片是經(jīng)過預處理的玻璃纖維紙，所述預處理的預處理液包括0. 5 0. 8v% Tween-20,12 18w/v%蔗糖，溶劑為水。
4.權(quán)利要求1-3任一權(quán)利要求所述的微量尿白蛋白膠體金檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟1)兩步還原法制備膠體金溶液；2)用步驟1)制備的膠體金標記抗人白蛋白單克隆抗體I，獲得膠體金標記的抗人白蛋白單克隆抗體I ；3)免疫膠體金紙片的制備預處理玻璃纖維紙；稀釋步驟幻制備的膠體金標記的抗人白蛋白單克隆抗體I，得到免疫膠體金溶液；用所述免疫膠體金溶液包被預處理過的玻璃纖維紙，獲得免疫膠體金紙片；4)將抗人白蛋白單克隆抗體II和羊抗鼠抗體分別噴在硝酸纖維素膜檢測線和質(zhì)控線的位置上，烘干備用，制得免疫硝酸纖維素膜；5)將濾樣紙、免疫膠體金紙片、免疫硝酸纖維素膜、吸水紙依次粘貼在膠板上，切裁制得試劑條；6)將試劑條裝入塑料盒，獲得微量尿白蛋白膠體金檢測試劑盒。
5.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述兩步還原法的步驟為a.第一次還原氯金酸溶液制備濃度為0.0004-0. 0005mol/L的HAuCl4水溶液，加熱煮沸20-30分鐘，之后邊攪拌邊加入檸檬酸三鈉水溶液，HAuCl4與檸檬酸三鈉的摩爾比為 1 8 9，超聲振蕩2-3分鐘后冷卻至室溫，即制得14 16nm粒徑的膠體金原溶液；b.第二次還原氯金酸溶液將第一步制得的膠體金原溶液放置于4.0°C水浴中保持溫度恒定，隨后按膠體金原溶液與HAuCl4水溶液體積比1 1. 9 2. 0加入4. 0°C的 0. 003-0. 004mol/L HAuCl4水溶液，隨后立即邊攪拌邊滴加4. 0°C的抗壞血酸與PVP的混合水溶液，加入的抗壞血酸與本步驟加入的HAuCl4的摩爾比為25 沈1，加入的PVP與本步驟加入的HAuCl4的重量比為1 2.0 2.1，反應中保持溫度恒定，攪拌至反應完全，溶液呈透明的酒紅色，制得39-42nm粒徑的膠體金溶液；兩步還原法中，配置各種水溶液均采用雙蒸水。
6.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟a中，加入的檸檬酸三鈉水溶液的濃度為0. 01-0. 02mol/L，超聲震蕩的頻率為20-30KHZ。
7.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟b中，所述抗壞血酸與PVP的混合水溶液中，抗壞血酸的濃度為0. 017-0. 019mol/L, PVP的濃度為0. 137-0. 139g/L。
8.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟3)免疫膠體金紙片的制備為A.用噴金緩沖液稀釋膠體金標記的抗人白蛋白單克隆抗體I，獲得OD54tl值為1.6的免疫膠體金溶液；B.用預處理液浸泡玻璃纖維紙，干燥后，再用免疫膠體金溶液噴涂預處理后的玻璃纖維紙，干燥，制得免疫膠體金紙片。
9.如權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述步驟A中的噴金緩沖液配方如下 8 12v% 1. OM Tris液，0. 2 0. 4界八％聚乙二醇20000,0. 15 0. 25w/v%牛血清白蛋白，0. 1 0. 3w/v%脫脂牛奶，0. 25 0. 35w/v%酪蛋白，和0. 02 0. 08w/v%疊氮化鈉，用鹽酸調(diào)節(jié)PH至8.0 士0. 1，余量為水。
10.如權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述步驟B中的預處理液包括0.5 0. 8v% Tween-20,12 18w/v%蔗糖，溶劑為水。
11.權(quán)利要求1-3任一權(quán)利要求所述的試劑盒在制備微量尿白蛋白檢測試劑中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及膠體金免疫層析領域，公開了一種微量尿白蛋白膠體金檢測試劑盒，包括試劑條，所述試劑條包括襯底、濾樣紙、免疫膠體金紙片、免疫硝酸纖維素膜和吸水紙，所述濾樣紙、免疫膠體金紙片、免疫硝酸纖維素膜和吸水紙依次首尾銜接并固定于所述襯底上，所述免疫膠體金紙片上包被有膠體金標記的抗人白蛋白單克隆抗體Ι，免疫硝酸纖維素膜上設有包被了抗人白蛋白單克隆抗體Ⅱ的檢測線和包被了羊抗鼠IgG的質(zhì)控線。本發(fā)明的微量尿白蛋白膠體金檢測試劑盒反應靈敏，檢測方便、檢測結(jié)果穩(wěn)定，節(jié)約成本。
文檔編號G01N33/531GK102539786SQ201110458518
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月31日
發(fā)明者張國華 申請人:上海凱創(chuàng)生物技術(shù)有限公司