專利名稱：微型高效克倫特羅免疫親和層析柱制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物分離和富集技術(shù)，尤其是一種微型高效克倫特羅免疫親和層析柱制備技術(shù)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鹽酸克倫特羅是一種β-興奮劑，可以提高瘦肉率，減少脂肪沉積和促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，被養(yǎng)殖戶或養(yǎng)殖企業(yè)作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑大量使用，導(dǎo)致畜產(chǎn)品中鹽酸克倫特羅大量殘留。 人食用這類畜產(chǎn)品后，可引發(fā)肌肉震顫、心悸、神經(jīng)過(guò)敏、頭痛、目眩、惡心、嘔吐、發(fā)燒、戰(zhàn)栗等癥狀，嚴(yán)重危害消費(fèi)者的健康。因此，許多國(guó)家(包括我國(guó))現(xiàn)已被明令禁止在飼料中添加克倫特羅來(lái)增加動(dòng)物的瘦肉率，畜產(chǎn)品中禁止克倫特羅含量超標(biāo)。因此，對(duì)動(dòng)物來(lái)源的食品中鹽酸克倫特羅殘留進(jìn)行嚴(yán)格地檢測(cè)是非常重要。目前檢測(cè)克倫特羅的方法主要有高效液相色譜法(HPLC-UV)、氣-質(zhì)聯(lián)機(jī)法 (GC-UV)、酶聯(lián)免疫法、膠體金快速試紙條檢測(cè)法等，由于生物樣本成分復(fù)雜，待測(cè)物濃度低，大多數(shù)取樣量少，而我國(guó)明確規(guī)定禁止克倫特羅及其衍生物在動(dòng)物的飼養(yǎng)過(guò)程中使用。 這就對(duì)分析方法的靈敏度、準(zhǔn)確度有更高的要求。使用免疫親和色譜純化富集樣品中的克倫特羅，可以很大程度的提高分析結(jié)果的可靠性和分析的極限。所以發(fā)明高效可行的克倫特羅免疫親和柱很有必要?，F(xiàn)有的克倫特羅免疫親和色譜樣品處理柱的技術(shù)與工藝存在的缺陷目前關(guān)于純化克倫特羅親和色譜柱的專利和學(xué)術(shù)報(bào)告，僅僅是停留在實(shí)驗(yàn)室水平，即僅僅實(shí)現(xiàn)了可能性而無(wú)法在生產(chǎn)上應(yīng)用的可行性。原因分析如下1)親和柱重要的原料之一一活化填料。采用商業(yè)提供溴化氫(Cyanogen bromide)活化瓊脂糖(Agarose).該種活化已知的缺陷是化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，化學(xué)反應(yīng)殘余有離子交換性質(zhì)。這樣會(huì)導(dǎo)致填料所結(jié)合的抗體定期性脫落，使結(jié)果不準(zhǔn)確性和不可靠。從而限制了該填料的用途。2)親和柱重要的原料之二——抗體。采用的抗體不是抗原特異親和純化的高質(zhì)量抗體，會(huì)導(dǎo)致特異性抗體在填料的偶聯(lián)比率低從而導(dǎo)致親和柱的效率低下。即使使用單克隆抗體為原料的親和柱專利，抗體生產(chǎn)成本高，很難實(shí)現(xiàn)實(shí)用性。3)抗體偶聯(lián)技術(shù)。采用的是溴化氰(Cyanogen bromide)活化偶聯(lián)技術(shù)。該技術(shù)已知缺陷是化學(xué)鍵不穩(wěn)定，會(huì)定期脫落，造成偶聯(lián)的抗體固定不穩(wěn)定，偶聯(lián)抗體后的填料依然具有離子交換特點(diǎn)從而影響效率和分析結(jié)果的可靠性。。非特異親和純化抗體制備和不穩(wěn)定的偶聯(lián)技術(shù)，導(dǎo)致填料的抗原(克倫特羅)結(jié)合效率極低。無(wú)法用于制備微型化親和柱。填料的裝柱容量多在1毫升左右，與25微升微型柱的水平差異是50倍。4)沒(méi)有微型化親和柱?？贵w填料的技術(shù)和低質(zhì)量抗體使單位體積的親和填料與分析物抗原的結(jié)合效率低，所以無(wú)法微型化。沒(méi)有微型化，需要填料體積大，導(dǎo)致待測(cè)抗原洗脫的體積同樣過(guò)大，直接影響了分析抗原的富集效應(yīng)。同時(shí)，由于抗體抗原反應(yīng)是動(dòng)力學(xué)過(guò)程，填料中抗體的質(zhì)量差，直接影響了抗體抗原反應(yīng)的速率，也影響了富集的效率。富集效率直接影響到抗原分析物的檢測(cè)極限。這是現(xiàn)有克倫特羅免疫親和色譜柱最大的缺陷。上述幾方面的原因造成制備出來(lái)的親和色譜柱對(duì)待測(cè)樣品中的克倫特羅富集的效率和純化的能力差，引起檢測(cè)靈敏度差、準(zhǔn)確率低、可靠性低等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種制備高效、準(zhǔn)確、可靠的工具和方法的技術(shù)。這樣的工具 (產(chǎn)品)可以把待檢樣品中克倫特羅的定量定性的分離純化和富集起來(lái)，以便進(jìn)一步的分析。要達(dá)到這個(gè)目的，需要解決的問(wèn)題是1)高度化學(xué)穩(wěn)定和高效化學(xué)偶聯(lián)的固相活化填料的制備技術(shù)。只有化學(xué)穩(wěn)定的固相填料，才能保證所固定的富集物特異抗體的穩(wěn)定不脫落，才不至于影響和干擾分析的結(jié)果和富集的效率，才有實(shí)用推廣和商業(yè)化的價(jià)值。2)大量廉價(jià)的高質(zhì)量克倫特羅特異抗體的制備技術(shù)。只有高純度、高度特異的抗體才可能達(dá)到單位體積最大的抗原分析物的富集效果和實(shí)現(xiàn)親和柱微型化的目的。3)高密度抗體固定技術(shù)。只有高密度地將抗體固定于填料，才可能達(dá)到單位體積最大的抗原分析物的富集效果和實(shí)現(xiàn)親和柱微型化的目的。本發(fā)明的原理克倫特羅親和純化和富集技術(shù)的基本原理是把克倫特羅特異抗體通過(guò)化學(xué)方法固定倒固體瓊脂糖小球(Agarose Beads)上。在流體樣品中的抗原分析物克倫特羅(Ag)與固相填料中的克倫特羅特異抗體(Ab)產(chǎn)生特異性反應(yīng)，在固相生成抗原抗體復(fù)合物。即
Ag + Ab (固相)0 Ag-Ab (固相)目標(biāo)微量的克倫特羅流經(jīng)固相的分析物特異抗體，被抗體俘獲而積累富集，同時(shí)流體樣品的雜質(zhì)可以從固相中自由流出而被清洗干凈而使得克倫特羅得到純化?？乖?抗體反應(yīng)是可逆的反應(yīng)。當(dāng)樣品中的克倫特羅在固相積累富集和純化后， 可以被流體的克倫特羅洗脫液洗脫出來(lái)。分析樣品中的克倫特羅收集在洗脫液中，可以用于儀器分析(如HPLC-MQ，或其他是免疫學(xué)檢測(cè)方法(ELISA，膠體金測(cè)試條)進(jìn)一步定性定量分析。微型高效克倫特羅(Clenbuterol)免疫親和層析柱工藝流程將鹽酸克倫特羅半抗原制成具有強(qiáng)免疫原性的全抗原，免疫動(dòng)物，產(chǎn)生具有抗克倫特羅的特異性抗血清，同時(shí)將克倫特羅半抗原偶聯(lián)于瓊脂糖填料，制成偶聯(lián)半抗原的免疫親和色譜柱，再用這種色譜柱提取血清中的抗體，將所得抗體進(jìn)行脫鹽、濃縮。另取瓊脂糖填料基質(zhì)用過(guò)碘酸鈉活化，與濃縮的克倫特羅特異性抗體反應(yīng)，從而偶聯(lián)于這種活化后的填料，得到高效免疫親和填料，此填料可用于特異性提取待測(cè)樣品中的克倫特羅，將此填料裝入特制的微型柱子里，即得微型高效的克倫特羅免疫親和層析柱。具體技術(shù)如下高質(zhì)量抗體的制備技術(shù)1)采用新的免疫原制備技術(shù)鹽酸克倫特羅與溴乙酰氯(BrCH2C0Cl)反應(yīng)，生成穩(wěn)定的克倫特羅鹵代乙酰酯?？藗愄亓_溴乙酰酯的溴代烷烴(BrCH2_)基團(tuán)可以迅速與游離巰基(-SH)反應(yīng)，生成穩(wěn)定的硫醚鍵?？藗愄亓_溴乙酰衍生物采用反向型高效液相色譜儀(HPLC)純化出主要溴乙酰克倫特羅衍生物主峰的單一成分(見(jiàn)圖1)，將收集的活化組份凍干用于與含游離巰基的蛋白質(zhì)和填料反應(yīng)。采用新產(chǎn)生的巰基衍生強(qiáng)免疫原性的血藍(lán)蛋白(KLH)等常用載體蛋白與克倫特羅溴乙酰酯反應(yīng)，生成克倫特羅-KLH復(fù)合免疫原。利用這種免疫原注射山羊和兔子， 可產(chǎn)生產(chǎn)生高滴度，高親和力的多克隆克倫特羅特異性抗血清。這種技術(shù)和現(xiàn)有的采用 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)縮合或NHS-戊二酸克倫特羅活性脂與免疫原性蛋白結(jié)合的制備方法完全不同。2)采用抗原特異性免疫親和層析，工業(yè)化水平純化克倫特羅特異性抗體。我們制備高效抗原特異性免疫親和色譜來(lái)大容量(克級(jí))分離純化克倫特羅-特異性多克隆抗體的技術(shù)，與現(xiàn)有的非克倫特羅-特異的蛋白A色譜分離純化技術(shù)完全不同。無(wú)論是抗體的質(zhì)量和產(chǎn)量，前者的克倫特羅特異分離純化技術(shù)比后者高幾個(gè)數(shù)量級(jí)。采用新的抗克倫特羅抗體免疫親和填料制備技術(shù)。1)采用過(guò)碘酸鈉活化瓊脂糖(Agarose)，制備高穩(wěn)定性的親和色譜填料利用活化填料的反應(yīng)基團(tuán)醛基與抗體蛋白表面所存在的一級(jí)氨基反應(yīng)，通過(guò)還原后形成高度穩(wěn)定的填料-克倫特羅特異抗體的高效免疫親和填料。2)采用經(jīng)抗原特異免疫親和層析純化的高質(zhì)量抗體制備親和填料?？藗愄亓_抗體是利用克倫特羅瓊脂糖Agarose親和柱從抗血清中純化出來(lái)的抗體。使高密度抗體化學(xué)固定，高抗原結(jié)合效率的免疫親和填料成為可能，可行。3)利用上述方法所制備的克倫特羅抗體免疫親和填料化學(xué)穩(wěn)定性強(qiáng)，抗體固定特異性好，密度高，保存過(guò)程中抗體脫落不明顯，所以不會(huì)干擾分析結(jié)果的問(wèn)題。能與傳統(tǒng)的儀器分析，酶聯(lián)免疫法(ELISA)及膠體金快速檢測(cè)方法聯(lián)用，從而改善了檢測(cè)的敏感度、準(zhǔn)確性和可靠性。微型高效克倫特羅親和層析柱裝柱體積251，能達(dá)到現(xiàn)有親和柱裝柱體積1000L 的容量和更敏感的富集效率。采用上述新技術(shù)制成的微型高效親和層析柱具有能濃縮待測(cè)樣品中克倫特羅濃度，提高檢測(cè)下限、排除雜質(zhì)干擾、提高檢測(cè)準(zhǔn)確性和可靠性、減少樣品過(guò)柱時(shí)間達(dá)到快速檢測(cè)的作用。本發(fā)明采取的技術(shù)方案一種微型高效克倫特羅免疫親和層析柱制備技術(shù)，其特征是(1)克倫特羅免疫親和層析填料是由固相載體瓊脂糖Agarose和與其偶聯(lián)的經(jīng)免疫親和提純的克倫特羅多克隆抗體組成；所述的經(jīng)免疫親和提純的克倫特羅多克隆抗體是以將克倫特羅衍生為半抗原再與載體蛋白偶聯(lián)為免疫原免疫動(dòng)物取得抗血清，將抗血清經(jīng)偶聯(lián)有克倫特羅半抗原的免疫親和柱純化得到的；(2)活化的溴乙?？藗愄亓_制備技術(shù)采用溴乙酰氯與克倫特羅反應(yīng)，生成溴乙?？藗愄亓_，并使用制備型高效液相色譜儀HPLC分離純化溴乙?？藗愄亓_；(3)克倫特羅免疫原、包被配對(duì)抗原制備技術(shù)采用二硫蘇糖醇DTT還原已用十二烷基磺酸鈉SDS變性了的血藍(lán)蛋白或牛血清蛋白，即KLH或BSA等常用載體蛋白，通過(guò)葡聚糖凝膠G25S印hadex脫鹽制備巰基化蛋白；將所述經(jīng)HPLC純化的溴乙酰克倫特羅與巰基化的KLH或BSA合成免疫原免疫動(dòng)物，制備抗血清；(4)制備巰基化瓊脂糖Agarose 用過(guò)碘酸鈉氧化Agarose，再與賴氨酸反應(yīng)后用硼氫化鈉還原，制備氨基化Agarose ；用N-羥基琥珀酰亞胺-碘乙酸活化酯 NHS-Iodoacetate 禾口氨基化 Agarose 反應(yīng)生成 NHS-Ioacetylated Agarose 然后與過(guò)量的 DTT反應(yīng)制備巰基化Agarose ；(5)偶聯(lián)溴乙酰克倫特羅的親和柱的制備將經(jīng)HPLC純化的溴乙?？藗愄亓_與巰基化Agarose反應(yīng)，形成溴乙?？藗愄亓_-Agarose的化學(xué)共價(jià)鍵復(fù)合體填料并用于制備偶聯(lián)溴乙?？藗愄亓_的親和柱；(6)克倫特羅特異性抗體的分離純化采用偶聯(lián)溴乙?？藗愄亓_填料并裝配抗原免疫親和柱，把溴乙?？藗愄亓_-KLH/BSA免疫動(dòng)物所得的抗血清中的克倫特羅特異性抗體分離并純化，得到高特異性、高親和力的克倫特羅多克隆抗體；(7)將所得的高特異性、高親和力的克倫特羅多克隆抗體高密度偶聯(lián)于用過(guò)碘酸氧化的Agarose上，得到高效克倫特羅免疫親和層析填料；(8)將所述高效克倫特羅免疫親和層析填料裝載入微型柱中，制成微型高效免疫親和層析柱。所述微型高效克倫特羅免疫親和層析柱與膠體金測(cè)試條聯(lián)用。利用親和色譜柱進(jìn)行分析樣品處理，提高檢測(cè)的可靠性，敏感性主要針對(duì)儀器分析而言。由于免疫親和色譜技術(shù)、膠體金快速檢測(cè)測(cè)試條的都采用分析物特異的抗體。傳統(tǒng)的免疫親和色譜技術(shù)和膠體金聯(lián)用，在一些條件下會(huì)產(chǎn)生相互作用，從而影響分析結(jié)果的可靠性及準(zhǔn)確性，特別是抗體從親和柱的脫落，所脫落的抗體和待檢分析物產(chǎn)生抗體抗原反應(yīng)，可以與膠體金測(cè)試條的標(biāo)記抗原或抗體產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)反映，會(huì)造成假陽(yáng)性或假陰性，因此直接影響到免疫親和柱在這些分析手段的準(zhǔn)確性/可靠性。本發(fā)明的克倫特羅親和柱制備技術(shù)，在與克倫特羅膠體金分析測(cè)試的應(yīng)用上不產(chǎn)生這類干擾反應(yīng)(見(jiàn)圖2，圖3結(jié)果)。 至今沒(méi)有發(fā)現(xiàn)克倫特羅親和柱與克倫特羅膠體金聯(lián)用的報(bào)道和專利。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)或積極效果經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)儀器(LC-MQ分析微型親和柱Q5L)的容量和效率> IOOng, > 90%的回收率。經(jīng)膠體金測(cè)試條分析膠體金對(duì)其他方法洗脫Agarose (瓊脂糖填料)上不穩(wěn)定的克倫特羅抗體(中和后)陽(yáng)性。說(shuō)明若不穩(wěn)定親和柱抗體脫落，不能在膠體金測(cè)試條上應(yīng)用。然而，膠體金測(cè)試條對(duì)含0，0. l，lng/mL原液樣品陰性，對(duì)lOng/mL原液樣品陽(yáng)性。說(shuō)明與膠體金測(cè)試條合乎產(chǎn)品特性。膠體金測(cè)試條對(duì)所有4種樣品濾液皆陰性。說(shuō)明微型親和柱能有效俘獲克倫特羅分子。膠體金測(cè)試條對(duì)Ong/mL樣品洗脫液陰性，對(duì)0. lng/ml, lng/ mL，10ng/mL樣品洗脫液陽(yáng)性，說(shuō)明1)微型柱上的抗體穩(wěn)定，沒(méi)有脫落，不造成因抗體不穩(wěn)定脫落所造成的假陽(yáng)性。2、微型柱能起富集作用，至少?gòu)牟荒軝z測(cè)的10毫升的0. Ing/mL 的樣品原液陰性(在膠體金的限度下)，經(jīng)過(guò)微型柱純化富集到150微升后，可以被撿膠體金測(cè)試條檢測(cè)出來(lái)。樣品中的雜質(zhì)影響膠體金測(cè)試造成假陽(yáng)性，經(jīng)過(guò)微型柱純化后，消除假陽(yáng)性。綜合上述，本發(fā)明的產(chǎn)品可以建立純化富集克倫特羅的微型親和柱05L)，并能實(shí)際應(yīng)用于臨床分析化學(xué)儀器檢測(cè)(LC-MS，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀)，膠體金測(cè)試條的快速測(cè)試等。采用上述新技術(shù)制成的高效微型親和色譜柱具有能濃縮待測(cè)樣品中克倫特羅濃度， 提高檢測(cè)下限、排除雜質(zhì)干擾、提高檢測(cè)準(zhǔn)確性和可靠性、減少樣品過(guò)柱時(shí)間達(dá)到快速檢測(cè)的作用。


圖1為經(jīng)制備型高效液相色譜分離純化的溴乙?？藗愄亓_色譜圖，及主要衍生組分收集峰。圖2為用本發(fā)明的微型高效親和柱提純的克倫特羅經(jīng)膠體金試紙條測(cè)試效果圖。 說(shuō)明1 陰性尿液(“)；2 0. lng/ml尿液㈠；3 =IOmlO. lng/ml尿液過(guò)柱后的洗脫液(+)； 4 =IOmlO. lng/ml尿液過(guò)柱后的濾過(guò)液(_)。圖3為用本發(fā)明的微型高效親和柱提純的克倫特羅經(jīng)膠體金試紙條測(cè)試效果圖。 說(shuō)明1 陰性尿液(“)；2 :10ng/ml尿液㈠；3 :10mll0ng/ml尿液過(guò)柱后的濾過(guò)液㈠；4 10mll0ng/ml尿液過(guò)柱后的洗脫液(+)。
具體實(shí)施例方式一、微型高效克倫特羅免疫親和層析柱制備一 )克倫特羅特異性抗體的制備1)克倫特羅溴乙酰脂的制備50毫克的鹽酸克倫特羅溶于500L的富馬酸二甲酯 (DMF)溶液中與50L的溴乙酰氯在60°C反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)后加入500L的50%甲醇。用制備型高效液相色譜儀(C-18HPLC)反向柱色譜分離純化。分別收集相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)克倫特羅峰后移的峰(見(jiàn)圖1)，具有克倫特羅紫外光(UV)吸收光譜特征的主要組分(大約20mg)，凍干現(xiàn)用。2)克倫特羅免疫原、包被配對(duì)抗原制備。取50mg血藍(lán)蛋白(KLH) IOmL)，加入1 % 的SDS加熱變性，然后加入15-30mg的過(guò)量二硫蘇糖醇(DTT)煮沸還原10分鐘。還原后的 KLH經(jīng)過(guò)G25 Sephadex脫鹽柱去掉后多余的DTT加入5毫克的經(jīng)HPLC純化的克倫特羅溴乙酰酯，調(diào)pH = 8. 5，室溫反應(yīng)60分鐘后，生成克倫特羅-KLH共價(jià)鍵復(fù)合體，經(jīng)G25S印hadex 脫鹽后得到的為免疫抗原。3)克倫特羅多克隆抗血清制備用新西蘭大白兔為免疫動(dòng)物，疫苗濃度為Img/ ml，首次免疫用0. 5ml疫苗加Iml完全佐劑混勻多點(diǎn)注射，加強(qiáng)免疫用0. 25ml疫苗加 0. 75ml磷酸緩沖液加Iml不完全佐劑混勻分2點(diǎn)注射，首次免疫后，每間隔2周加強(qiáng)免疫一次，35-40天采集血清檢測(cè)滴度，血清滴度達(dá)到1 6400后進(jìn)行生產(chǎn)性血清制備。4)溴乙酰克倫特羅Agarose親和柱制備。取20mL過(guò)碘酸鈉活化Agarose于50 毫克的過(guò)量賴氨酸反應(yīng)30分鐘。用20毫克硼氫化鈉還原30分鐘，把過(guò)量的賴氨酸清洗干凈，然后與20毫克的NHS-Iodoacetate室溫反應(yīng)30分鐘。清洗后加入40毫克過(guò)量的DTT 生成巰基化Agarose。清洗掉過(guò)量的DTT然后用磷酸緩沖液(PBS)懸浮，分別加入IOmg經(jīng) HPLC制備純化的克倫特羅溴乙酰酯，室溫反應(yīng)過(guò)夜。用0.05%吐溫磷酸鹽緩沖液(PBSt) 洗脫后裝柱，5)抗克倫特羅特異性抗體制備將500mL的免疫血清流過(guò)步驟4)所制的親和色譜填料柱。經(jīng)PBM清洗后，柱上的特異性抗克倫特羅抗體用2%乙酸洗脫。洗脫的抗體用透析袋透析去掉乙酸，凍干備用。二)高密度高純度克倫特羅特異性抗體Agarose填料制備。1)用0. IM碳酸鈉溶解Ig克倫羅特異性多克隆抗體，與40mL的已經(jīng)過(guò)碘酸鈉活化的瓊脂糖填料在室溫下反應(yīng)30分鐘。然后4°C冰箱靜置30分鐘后加入50mg硼氫化鈉還原穩(wěn)定，清洗后，檢測(cè)未結(jié)合抗體蛋白為150mg，實(shí)際偶聯(lián)抗體蛋白> 800mg，抗體密度> 20mg/mL。即得到高效克倫羅特異性抗體-agarose。三)微型克倫特羅免疫親和層析柱的制備。取25 μ L高效克倫羅特異性抗體-agarose裝入容量為ImL的親和層析塑料柱中， 填料兩頭分別加上1個(gè)孔徑為50 μ m的篩板，壓緊后即可得到微型高效克倫特羅免疫親和層析柱。該微型克倫特羅免疫親和層析柱的貯藏條件用含有0. 01%疊氮鈉和0. 1% BSA 的磷酸緩沖液，3-8°C下保存，不能冷凍。該產(chǎn)品的有效期為12個(gè)月。四)微型高效親和柱的克倫特羅結(jié)合效價(jià)測(cè)定定性測(cè)定分別裝10支25L微型高效克倫羅特異性抗體-agarose親和柱。隨機(jī)抽樣4支柱子分別過(guò)1毫升含0，0. l，l，10ng/mL含克倫羅特羅標(biāo)準(zhǔn)品的尿液樣品。用150L的2%乙酸洗脫液洗脫，用磷酸三鈉中和到PH = 7. 0-7. 5將樣品原液、樣品流出濾液、和親和柱洗脫液分別用克倫羅特羅膠體金測(cè)試條測(cè)試，膠體金試紙條敏感度5ng/mL，測(cè)試結(jié)果如圖二所示，說(shuō)明經(jīng)過(guò)本發(fā)明的微型高效免疫親和柱富集后，檢測(cè)下限可達(dá)0. lng/ml。定量測(cè)定分別裝10支25L微型高效克倫羅特異性抗體-agarose親和柱，隨機(jī)取4支柱子。 2支過(guò)12ml的lng/ml，另2支過(guò)12ml的lOng/ml的含克倫羅特羅標(biāo)準(zhǔn)品的尿液樣品。用 1. 2ml的2%乙酸20%甲醇洗脫液洗脫。樣品原液、樣品流出濾液和親和柱洗脫液分別用高效液相色譜分析。結(jié)果分析a)本專利技術(shù)的產(chǎn)品可以建立純化富集克倫特羅的微型親和柱(25L)，并能將微型親和柱應(yīng)用于臨床分析化學(xué)儀器檢測(cè)(LC-MS，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀)，膠體金測(cè)試條的快速測(cè)試。b)經(jīng)LC-MS (液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀)分析微型親和柱(25L)的容量和效率> IOOng, > 90%的回收率。c)經(jīng)膠體金測(cè)試條分析膠體金測(cè)試條對(duì)含0，0. 1，Ing/mL原液樣品陰性，對(duì) 10ng/mL原液樣品陽(yáng)性，說(shuō)明與膠體金測(cè)試條合乎產(chǎn)品特性。膠體金測(cè)試條對(duì)所有4種樣品過(guò)柱后的濾過(guò)液皆呈陰性。說(shuō)明微型親和柱能有效俘獲克倫特羅分子。膠體金測(cè)試條對(duì) Ong/mL樣品洗脫液陰性，對(duì)0. lng/ml、Ing/mL，lOng/mL樣品洗脫液陽(yáng)性，說(shuō)明1)微型柱上的抗體穩(wěn)定，沒(méi)有脫落，不造成因抗體不穩(wěn)定脫落的假陽(yáng)性。2、微型柱能起富集作用，10毫升的0. Ing/mL的樣品原液陰性(在膠體金的限度下)，經(jīng)過(guò)微型柱純化富集到150微升后， 可以被撿膠體金測(cè)試條檢測(cè)出來(lái)。
二、微型克倫特羅免疫親和層析柱的使用方法a)樣品的前處理動(dòng)物尿樣將樣品用PBS(磷酸緩沖液)稀釋至所需體積。動(dòng)物組織在樣品勻漿中，加入0. Olmol/ml鹽酸溶液，渦動(dòng)3分鐘，5000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，將得到上清液經(jīng) 0.2μπι的濾膜過(guò)濾后，用磷酸緩沖液(PBQ稀釋至所需體積，得到樣品溶液。b)將免疫親和層析柱從4°C冰箱移到室溫02 25°C )，平衡10分鐘后，取出上方塞子，并拔掉下方堵頭，用IOmL磷酸緩沖液(PBS)洗滌2次。c)將步驟a)所得的樣品溶液過(guò)柱。d)待液體完全排干后，用磷酸緩沖液(PBS)洗滌2次，每次10mL。e)待液體完全排干后，用洗脫液A (儀器分析用，洗脫后可直接用于HPLC (高效液相色譜分析)或洗脫液B (ELSIA測(cè)試盒和膠體金試紙條測(cè)試用，洗脫后用飽和碳酸鈉調(diào)節(jié) PH 7-8)進(jìn)行洗脫，得到純化的克倫特羅溶液。f)用洗脫液A洗脫得到的純化的克倫特羅溶液可直接用于HPLC (高效液相色譜) 分析，得出檢測(cè)結(jié)果。J)洗脫液B洗脫得到的純化的克倫特羅溶液，需要用飽和碳酸鈉調(diào)節(jié)PH到pH = 7-8后，用ELSIA測(cè)試盒或膠體金試紙條測(cè)試，得出檢測(cè)結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種微型高效克倫特羅免疫親和層析柱制備，其特征是(1)克倫特羅免疫親和層析填料是由固相載體瓊脂糖Agarose和與其偶聯(lián)的經(jīng)免疫親和提純的克倫特羅多克隆抗體組成；所述的經(jīng)免疫親和提純的克倫特羅多克隆抗體是以將克倫特羅衍生為半抗原再與載體蛋白偶聯(lián)為免疫原免疫動(dòng)物取得抗血清，將抗血清經(jīng)偶聯(lián)有克倫特羅半抗原的免疫親和柱純化得到的；(2)活化的溴乙酰克倫特羅制備技術(shù)采用溴乙酰氯與克倫特羅反應(yīng)，生成溴乙酰克倫特羅，并使用制備型高效液相色譜儀HPLC分離純化溴乙?？藗愄亓_；(3)克倫特羅免疫原、包被配對(duì)抗原制備技術(shù)采用二硫蘇糖醇DTT還原已用十二烷基磺酸鈉SDS變性了的血藍(lán)蛋白或牛血清蛋白，即KLH或BSA等常用載體蛋白，通過(guò)葡聚糖凝膠G25S印hadex脫鹽制備巰基化蛋白；將所述經(jīng)HPLC純化的溴乙?？藗愄亓_與巰基化的 KLH或BSA合成免疫原免疫動(dòng)物，制備抗血清；(4)制備巰基化瓊脂糖Agarose用過(guò)碘酸鈉氧化Agarose，再與賴氨酸反應(yīng)后用硼氫化鈉還原，制備氨基化Agarose ；用N-羥基琥珀酰亞胺-碘乙酸活化酯NHS-Iodoacetate和氨基化Agarose反應(yīng)生成NHS-Ioacetylated Agarose然后與過(guò)量的DTT反應(yīng)制備巰基化 Agarose ；(5)偶聯(lián)溴乙?？藗愄亓_的親和柱的制備將經(jīng)HPLC純化的溴乙?？藗愄亓_與巰基化 Agarose反應(yīng)，形成溴乙酰克倫特羅-Agarose的化學(xué)共價(jià)鍵復(fù)合體填料并用于制備偶聯(lián)溴乙?？藗愄亓_的親和柱；(6)克倫特羅特異性抗體的分離純化采用偶聯(lián)溴乙?？藗愄亓_填料并裝配抗原免疫親和柱，把溴乙?？藗愄亓_-KLH/BSA免疫動(dòng)物所得的含抗體血清中的克倫特羅特異性抗體分離并純化，得到高特異性、高親和力的克倫特羅多克隆抗體；(7)將所得的高特異性、高親和力的克倫特羅多克隆抗體高密度偶聯(lián)于用過(guò)碘酸氧化的Agarose上，得到高效克倫特羅免疫親和層析填料；(8)將所述高效克倫特羅免疫親和層析填料裝載入微型柱中，制成微型高效免疫親和層析柱。
2.所述微型高效克倫特羅免疫親和層析柱與膠體金測(cè)試條聯(lián)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微型高效克倫特羅免疫親和層析柱制備及應(yīng)用。技術(shù)方案是制備高質(zhì)量抗體，將高效制備液相色譜純化的溴乙酰氯克倫特羅與巰基化的血藍(lán)蛋白合成免疫原免疫動(dòng)物，得到抗血清；將純化的溴乙酰氯克倫特羅與巰基化的瓊脂糖反應(yīng)得到克倫特羅-瓊脂糖填料，裝載成抗原親和層析柱；用抗原親和層析柱提純抗血清中的克倫特羅特異性抗體?？藗愄亓_免疫親和層析柱的制備將高質(zhì)量抗體高密度偶聯(lián)到過(guò)碘酸氧化的瓊脂糖上制成抗體親和填料，取25μl填料裝入特制的小柱中制成微型免疫親和層析柱。本發(fā)明所提供的免疫親和層析柱可高效率、特異性富集待檢樣品中克倫特羅，與分析儀器、膠體金試紙條聯(lián)用能提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性、可靠性和敏感度。
文檔編號(hào)G01N1/40GK102553297SQ20111045961
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2011年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月31日
發(fā)明者寧歡歡, 張芬, 李芝蓉, 潘麗金, 蕭浩, 謝體三 申請(qǐng)人:南寧市藍(lán)光生物技術(shù)有限公司