專利名稱：一種快速檢測抗潮霉素hyg蛋白的金標(biāo)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及一種快速檢測植物材料中轉(zhuǎn)基因成分的免疫檢測試劑盒，尤其是快速、特異性檢測抗潮霉素HYG蛋白的金標(biāo)試劑盒。
背景技術(shù)：
在進(jìn)行研發(fā)、篩選和評價轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的過程中，往往需要對轉(zhuǎn)入的外源性基因進(jìn)行定性或半定量測定。抗潮霉素HYG蛋白編碼基因克隆自pCambia Vectorsl304質(zhì)粒，該質(zhì)粒選自植物基因轉(zhuǎn)化中常用的載體，具有高潮霉素耐受性。該基因編碼的蛋白經(jīng)分析屬于Class I類型，酶活測定顯示該蛋白具有高底物親和能力和低潮霉素親和力，因此能賦予宿主高潮霉素耐受力。目前，檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中抗潮霉素HYG蛋白的技術(shù)和儀器主要有酶標(biāo)儀、放免閃爍儀、離心機(jī)等。然而，它們對人員的技術(shù)水平、操作環(huán)境等要求較高，主要不足有成本高， 步驟繁瑣，不易操作，耗時長。其中，酶免檢測時間需20小時、放免檢測需30分鐘 1小時， 很難推廣應(yīng)用。因此，實踐中需要有一種不受使用環(huán)境、人員技術(shù)水平等條件限制，且成本低廉， 快速高效的檢測轉(zhuǎn)基因植物中抗潮霉素HYG蛋白，且操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠的裝置。
發(fā)明內(nèi)容本實用新型提供了一種快速檢測轉(zhuǎn)基因植株中抗潮霉素HYG蛋白的免疫檢測試劑盒，不僅操作簡便，而且結(jié)果準(zhǔn)確可靠。本實用新型解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是一種快速檢測抗潮霉素HYG蛋白的金標(biāo)試劑盒，包括盒體、置于盒體內(nèi)表面的測試帶和上蓋，盒體蓋入上蓋后組成試劑盒，其特征在于所述上蓋設(shè)置有兩個觀測窗和一個加樣孔。所述觀測窗的形狀選自正方形、矩形、圓形或菱形，兩個觀測窗分別是測試區(qū)和質(zhì)控區(qū)。所述盒體的深度不限，其內(nèi)表面設(shè)置一條可以嵌入所述測試帶的凹槽。在盒體的一端可設(shè)置有操作手持柄，以方便操作，并可防止進(jìn)行測試操作時手觸碰到觀測區(qū)及加樣區(qū)后帶入污染；操作手持柄的形狀不限。所述盒體或上蓋可具有卡槽，以保證盒體與上蓋扣緊。所述測試帶形狀為長方形片狀，用于檢測抗潮霉素HYG蛋白。所述測試帶是一種具有檢測系統(tǒng)主體膜反應(yīng)體系功能的檢測材料，由高分子纖維膜、塑料等多層材料制成。測試帶分為質(zhì)控區(qū)和檢測區(qū)，質(zhì)控區(qū)可包被羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG多克隆抗體；抗潮霉素 HYG蛋白測試帶的樣品檢測區(qū)包被特異功能性抗潮霉素HYG蛋白單克隆抗體或多克隆抗體。[0014]外源基因轉(zhuǎn)入植物表達(dá)后，將產(chǎn)生目的蛋白一抗潮霉素HYG蛋白，可通過免疫反應(yīng)檢測樣品中是否含有該蛋白來確定該基因是否存在。如果沒有檢測出抗潮霉素HYG蛋白，表明無此標(biāo)記外源基因轉(zhuǎn)入植物，或此基因在植物體內(nèi)不表達(dá)或表達(dá)量極低。本實用新型的目的是這樣實現(xiàn)的當(dāng)盒體蓋入上蓋后，觀測窗和加樣孔對應(yīng)測試帶，通過盒蓋上的加樣孔和觀測窗可進(jìn)行加樣和觀察檢測結(jié)果。檢測時，將送檢物品的提取液滴加在試劑盒的加樣孔中，5-10分鐘后，通過肉眼就可以通過上蓋的觀測窗直接觀察到準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。對于每個觀測窗來說，用以下方式判斷檢測結(jié)果1、陰性(-)反應(yīng)狀況觀測窗質(zhì)控區(qū)(3)出現(xiàn)一條藍(lán)色條帶。檢測結(jié)果待檢樣品中不含待檢基因或其含量在其閾值以下。2、陽性(+)反應(yīng)狀況觀測窗質(zhì)控區(qū)C3)出現(xiàn)一條藍(lán)色條帶，在測試區(qū)( 內(nèi)同時出現(xiàn)藍(lán)色條帶。檢測結(jié)果待檢基因含量在閾值以上。3、無效反應(yīng)狀況質(zhì)控區(qū)(3)未出現(xiàn)藍(lán)色條帶。檢測結(jié)果可能的原因為操作過程不正確、試劑盒已變質(zhì)損壞或出現(xiàn)質(zhì)量問題。本試劑盒可為快速檢測植物種子、葉片及加工產(chǎn)品中是否含有抗潮霉素HYG蛋白基因成份提供直接證據(jù)，不需其它任何附加儀器設(shè)備?？捎糜趯嶒炇摇⑻镩g、邊防、海關(guān)植物檢驗、檢驗檢疫局、食品安全檢測及種子經(jīng)營銷售等部門對可疑樣本現(xiàn)場、快速篩查。本試劑盒操作簡便、且可防止進(jìn)行測試操作時手觸碰到觀測區(qū)及加樣區(qū)后帶入污染。


以下結(jié)合附圖和實施例對本實用新型進(jìn)一步說明。圖1和圖2是本實用新型一個實施例的結(jié)構(gòu)示意圖，其中圖1是試劑盒盒體的俯視圖，圖2是試劑盒上蓋的俯視圖；圖中1是加樣孔；2是測試區(qū)觀測窗；3是質(zhì)控區(qū)觀測窗；4是測試帶；5是手持柄。
具體實施方式
實施例1試劑盒的制備一、制備測試帶抗潮霉素HYG蛋白單抗腹水的制備小鼠腹腔注射液體石蠟0. 5mL。1周后，將抗潮霉素HYG蛋白單抗雜交瘤細(xì)胞注射于以上預(yù)先處理過的BALB/C小鼠腹腔，每只小鼠注射雜交瘤細(xì)胞1 3X106。10天后收獲腹水，以上過程皆在無菌條件下完成。1.抗潮霉素HYG蛋白單克隆抗體的純化1)以DEAE離子交換層析及kphacryl S-300分子篩對單抗進(jìn)行純化；SDS-PAGE 平板電泳檢測純化單抗的純度；ELISA法測定單抗活性；2)純化過程取小鼠單抗腹水一3，000 Xg離心15分鐘一上清液加50%硫酸銨沉淀，過夜一3，000 X g離心20分鐘一沉淀溶于0. OlM磷酸鹽緩沖液(pH 7. 2) — S-300凝膠柱一DEAE Blue層析柱一0-800mM NaCl梯度洗脫一超濾離心，濃縮單抗；3)單抗純度測定常規(guī)SDS-PAGE電泳，上述方法所純化的單抗的純度皆在95%以上；4)蛋白濃度測定紫外分光光度計測定279nm處的OD值，按以下公式計算蛋白含量0D279/1.4 = mg/mL(純化單抗)。將單抗?jié)舛日{(diào)節(jié)為約lmg/mL ；5)單抗活性測定選用抗潮霉素HYG蛋白抗原包被ELISA板(lyg/孔)，及羊抗鼠IgG-小時P復(fù)合物，測定各單抗效價(大于1 5000)。2.羊抗DOAt高效價免疫抗血清的制備和純化1)純化好的上述單抗+完全佐劑一免疫山羊一加強(qiáng)免疫二次，每次間隔一月一第二次加強(qiáng)后10天左右取血一離心取血清一硫酸銨沉淀一DEAE離子交換層析純化；幻效價測定ELISA夾心法，抗體效價稀釋度應(yīng)大于1 256;3)蛋白濃度測定紫外分光法測定OD279，計算蛋白濃度。3.膠體金及金標(biāo)抗體制備1)膠體金的制備以檸檬酸鹽還原法制備40-60nm的膠體金。將0. 01 % HauCl4 加熱至沸，加入一定量的檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7 ·2Η20)，繼續(xù)加熱煮沸5分鐘，待膠體金溶液顏色由蘭一紫一紅，穩(wěn)定后，冷卻即可。膠體金溶液應(yīng)清亮透明，如需長期保存，可加入
0. 02% 腳3。2)將膠體金液500mL用0. IM NaOH調(diào)pH8. 4，磁力攪拌下緩慢加入單抗2mL，攪拌 20分鐘。5，500Xg離心30分鐘，除去上清液中未結(jié)合的蛋白質(zhì)。離心后吸取膠體金標(biāo)記抗體沉淀，沉淀溶于IOmL保存液中，用0. 45 μ m微孔濾膜過濾。取樣進(jìn)行檢定，其余置4°C 保存。4.膜反應(yīng)體系Ml的制備1)將抗潮霉素HYG蛋白抗體及純化的羊抗鼠IgGWO. IM磷酸鹽緩沖液稀釋，終濃度為約 0. 2-ang/mL。2)純化的羊抗鼠IgG溶于0. IM磷酸鹽緩沖液中，濃度為2. Omg/mL ；3)硝酸纖維素膜大小IOcmX 27cm，每張膜可噴長25cm的檢測及控制帶各4條；4)將以上兩種溶液分別加入Biodot XYZ3000噴涂機(jī)的二個噴頭儲存瓶中；5)設(shè)置噴速為2 μ L/cm, NC膜的移行速度為50mm/s。以單抗EPSPAD2 (2mg/mL)在 NC膜上包被反應(yīng)檢測線，以1. Omg/mL兔抗鼠IgG包被反應(yīng)對照線，對照線與檢測線的距離為 4-4. 5mm ；6)完成包被后，置37°C干燥箱M小時，用BB封閉液封閉處理半小時，用WB洗液抽洗一次；7) 37 °C干燥箱干燥備用；8)切制備好的硝酸纖維素膜1. 8cmX27cm/條，放入鋁薄袋中密封干燥保存。置
室溫保存?zhèn)溆谩?.膜反應(yīng)體系M2a、M2b及M3的制備將吸水纖維膜分別浸泡于M2a、M2b、M3溶液中，浸透后，取出晾干，裝入塑料袋中，
室溫保存。[0058]l)M2a制備將制好的玻璃纖維切27cmX 1. 2cm/條；2)M2b制備將制好的玻璃纖維切27cmX 1. 8cm/條；3)M3制備將制好的玻璃纖維切27cmX 1. 2cm/條。6.膜反應(yīng)體系M4的制備1)取膠體金-單抗復(fù)合物加稀釋液，混勻配成工作濃度；2)將溶液加入噴涂機(jī)Biodot的Airjet噴頭儲存瓶中；3)設(shè)定壓力為15PSI，玻璃纖維膜的移動速度為50mm/s ；4)噴制規(guī)格為0. 5-1. 5cmX 25cm/條，每條噴2遍；5)于37°C烘干12小時，放入鋁薄袋中，加入干燥劑，熱合封口，室溫保存。7.反應(yīng)體組裝1)在M6塑料基板上貼雙面膠帶M7 二條；2)在M7中間貼反應(yīng)膜Ml (18mm)，離M6上緣約22mm ；3)在M7上貼M5 (22mm)，與M6上緣對齊并與Ml上緣交；4)在M7上貼M2a(12mm)，與Ml下緣相接；5)在 M2 上貼 M4 (IOmm)，壓住 Ml 下緣 0. 5mm ；6)在 M7 上貼 M3 (12mm),上緣壓住 M4 約 2/3 ；7)在M7上貼M2b (18mm)，上緣壓住M4約2/3，下緣與M7的下緣對齊；8)在M4和M7上貼透明保護(hù)膠帶M8，上緣完全壓住M4，并壓住Ml約1. 5mm ；9)在M5上貼彩色標(biāo)記膠帶M9，與Ml上緣交1mm，另一端翻過M6上緣，貼于M6背10)將組裝成型的反應(yīng)體用全自動切條機(jī)切成3. 5mm規(guī)格。二、試劑盒裝配將上述制備好的檢測抗潮霉素HYG蛋白的測試帶4嵌入圖1盒體的凹槽中，然后將上蓋與盒體扣緊，即成檢測試劑盒。將檢測試劑盒、滴管和使用說明書一并裝入塑料袋內(nèi)封裝后，即可。 實施例2試劑盒使用過程1.檢測樣本處理及準(zhǔn)備植物種子、葉子、幼苗等待檢樣本在檢測前需充分研磨，并用蒸餾水進(jìn)行抽提和稀釋。為獲得最佳檢測效果，應(yīng)根據(jù)下表所述對不同樣品按比例進(jìn)行稀釋。在充分研磨和稀釋后，將樣本混合均勻，靜置后，抽取上清液作為檢測樣品。
權(quán)利要求1.一種快速檢測抗潮霉素HYG蛋白的金標(biāo)試劑盒，包括盒體、置于盒體內(nèi)表面的測試帶和上蓋，盒體蓋入上蓋后組成試劑盒，其特征在于所述上蓋設(shè)置有兩個觀測窗和一個加樣孔。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測抗潮霉素HYG蛋白的試劑盒，其特征在于所述觀測窗的形狀選自正方形、矩形、圓形或菱形。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測抗潮霉素HYG蛋白的試劑盒，其特征在于所述盒體的一端設(shè)置有操作手持柄。
專利摘要本實用新型涉及一種快速檢測抗潮霉素HYG蛋白的金標(biāo)試劑盒，包括盒體、置于盒體內(nèi)表面的測試帶和上蓋，盒體蓋入上蓋后組成試劑盒，其特征在于所述上蓋設(shè)置有兩個觀測窗和一個加樣孔。本試劑盒可為快速檢測植物種子、葉片及加工產(chǎn)品中是否含有抗潮霉素HYG蛋白基因成份提供直接證據(jù)，不需其它任何附加儀器設(shè)備。本試劑盒操作簡便、且可防止進(jìn)行測試操作時手觸碰到觀測區(qū)及加樣區(qū)后帶入污染。
文檔編號G01N33/68GK202018460SQ201120097560
公開日2011年10月26日 申請日期2011年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月6日
發(fā)明者劉奇, 程紅梅, 蘇曉峰, 鄭建, 郭惠明 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所