專利名稱：一種基于光譜校正的毛細(xì)管陣列電泳檢測裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種毛細(xì)管陣列電泳檢測裝置，屬于高通量微量分析技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
DNA測序是現(xiàn)代分子生物研究中的重要技術(shù)，而電泳技術(shù)是DNA測序中必不可少的技術(shù)手段。由于毛細(xì)管具有良好的散熱效能，允許在毛細(xì)管兩端加上高至30kV的電壓， 分離毛細(xì)管的縱向電場強度可達(dá)到400V/cm以上，因而分離操作可以在很短的時間內(nèi)完成，達(dá)到非常高的分離效率(理論塔板數(shù)達(dá)到400000/m以上，最高達(dá)107/m數(shù)量級)。因為毛細(xì)管的內(nèi)徑很小(一般< 100 μ m)，對內(nèi)徑50 μ m,長度為50cm的毛細(xì)管，其容積不足 1 μ L，進樣體積在nL級，樣品濃度可低于10 4mol/L。毛細(xì)管電泳技術(shù)達(dá)到了儀器分析所要求的高效，快速，樣品用量少等最基本和最優(yōu)異的特點。此外，毛細(xì)管電泳技術(shù)還有容易自動化，操作簡便，容劑消耗少，環(huán)境污染小等優(yōu)點。毛細(xì)管電泳技術(shù)應(yīng)用首先集中在氨基酸，糖類，核酸和蛋白質(zhì)等生物分子的分離分析上，隨著此項技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，其應(yīng)用已逐漸的向醫(yī)藥衛(wèi)生，食品化工，環(huán)境等領(lǐng)域滲透。毛細(xì)管電泳技術(shù)還應(yīng)用于DNA的高速測序，蛋白質(zhì)的高效分離，糖類分析，細(xì)胞分析，手性拆分，物理化學(xué)常數(shù)的測定，生產(chǎn)工程控制等。為了提高毛細(xì)管檢測的通量，毛細(xì)管陣列作為高通量電泳分析手段被廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)分析中。在醫(yī)療、化學(xué)化工、生物制藥、法醫(yī)分析等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用毛細(xì)管陣列進行微量試劑的定性和定量分析。毛細(xì)管陣列可以同時實現(xiàn)批量試劑的分析。但對于單個毛細(xì)管中多色熒光染料的同時檢測，由于熒光標(biāo)記物的熒光譜帶比較寬，造成不同熒光光譜之間的很大重疊，通過普通的分光很難將它們很好的區(qū)分開，這也造成了毛細(xì)管電泳分析的很大誤差。目前尚沒有消除這些誤差的成熟技術(shù)。

實用新型內(nèi)容有鑒于此，為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本實用新型提供一種能夠準(zhǔn)確識別各熒光標(biāo)記物特異性的毛細(xì)管陣列電泳檢測裝置，極大提高毛細(xì)管檢測的精確度。本實用新型提供的一種基于光譜校正的毛細(xì)管陣列電泳檢測裝置，所述裝置包括激光器、毛細(xì)管陣列、光柵、電荷耦合元件CCD及光學(xué)系統(tǒng)，激光器所發(fā)出的激光經(jīng)光學(xué)系統(tǒng)照射到毛細(xì)管中的熒光染料產(chǎn)生熒光，經(jīng)光柵分光再經(jīng)光學(xué)系統(tǒng)在電荷耦合元件CCD 上成像形成熒光譜圖，所述光學(xué)系統(tǒng)包括聚焦鏡和濾光鏡。進一步，所述激光器發(fā)射的激光通過聚焦鏡照射毛細(xì)管中熒光染料，從毛細(xì)管中射出的激光和熒光束通過聚焦鏡和濾光鏡，激光被濾掉，熒光進入光柵，分光后的熒光束通過聚焦鏡在CXD上成像，形成光譜圖。本實用新型裝置通過激光激發(fā)熒光染料產(chǎn)生光譜、通過光譜校正實現(xiàn)對每根毛細(xì)管中的多色熒光染料進行解譜。為實現(xiàn)對檢測信號的特異性分析，必需進行校正處理，最通用的技術(shù)方法是建立顏料組合熒光信號矩陣，用于數(shù)據(jù)分析時信號強度的校正。對熒光的光強信息沒有太苛刻的要求，只要得到熒光準(zhǔn)確的位置和時間信號就可以獲得所期望的實驗結(jié)果。但是一般熒光標(biāo)記物的熒光譜帶比較寬，這造成不同熒光光譜之間的重疊成分很大，通過普通的分光很難將它們很好的區(qū)分開。如果采用把光譜展得很寬以獲得較高的分辨能力的方法，會使熒光強度嚴(yán)重下降，探測靈敏度和信噪比就成為了難題。針對這類探測方法的特殊性，我們在進行熒光探測前要對所使用的已知熒光標(biāo)記進行光譜校正，即要得到激光激發(fā)的每種所用標(biāo)記熒光光譜在CCD上單獨成像，根據(jù)成像得到熒光光譜的分布矩陣，對矩陣歸一后就可以用歸一矩陣對探測的熒光譜進行解譜以得到所要的熒光譜圖。熒光光譜帶較寬且強度很弱，用面陣CCD很難讓熒光成像很好的區(qū)分開，如果把光譜展得很寬以獲得較高分辨能力，熒光的強度會嚴(yán)重減弱，信號的靈敏度和信噪比會下降。如果光譜展開的比較窄，熒光比較強，則熒光光譜重疊就會加劇，甚至無法判讀光譜峰位，解譜成為難題。為了兼顧以上兩個方面，一般儀器都采用了光電倍增管來代替CCD。這就要同時采用多個光電倍增管，使得分光系統(tǒng)變得很復(fù)雜。針對熒光信號靈敏度和光譜解譜兩個相互制約的難題，本實用新型采用激光激發(fā)熒光光譜，并對熒光光譜進行光譜校正的方法進行CCD信號處理。采用該方法無需太多關(guān)注光譜的展寬程度，只要所用熒光光譜形狀不完全重合，強度分布不同，就可以通過光譜校正得到各種熒光的相對強度，同時把CCD 上所有的感光信號都有效利用起來，從而增加CCD的靈敏度，提高熒光信號的信噪比。用光譜校正對面陣CCD上熒光信號進行解譜的步驟如下。首先我們要知道所用熒光標(biāo)記物有幾種，設(shè)定為η種。我們讓η種標(biāo)記熒光分別在面陣C⑶上成像，得到這η種熒光在C⑶上的光譜分布。面陣CXD象素為mXp。把每種熒光落在C⑶每個象素上的熒光強記錄下來，得到一個mXn的矩陣P。由于每種標(biāo)記物被激發(fā)的熒光強度差別很大，為了后期進行信號處理的方便，對矩陣P進行歸一得到矩陣Q =
(Qij) mXn0通過Q矩陣我們就可以對所用熒光在CXD上的成像組合進行光譜解譜了。如某時刻從CCD各個象素上采的熒光光強分布為一 mX 1矩陣B，每種熒光的相對強度是一個ηX 1 矩陣X，貝IJ :QX = B。進行矩陣變換得到X= (QtQ)^1(QtB)0從上式可以得知，當(dāng)我們得到了光譜校正矩陣Q后，只要得到任意時刻熒光落在面陣CCD上各個象素的強度分布矩陣B，就可以通過光譜校正得到各種熒光的相對強度分布，從而得到所用熒光的光譜信息。在下面的實驗中可以看出，即使CCD上的熒光光譜重疊非常嚴(yán)重，甚至無法判讀出峰位，也可以通過這種方法得到很好的熒光譜圖。進行DNA片斷分析時，對獲得CCD上的每一幀光譜數(shù)據(jù)，對每一根毛細(xì)管中的光譜數(shù)據(jù)，通過光譜校正矩陣解譜得到每種染料的光譜數(shù)據(jù)。對連續(xù)多幀光譜數(shù)據(jù)進行處理獲得DNA片斷信息。本實用新型的有益效果如下(1)采用激光激發(fā)熒光染料獲得熒光染料組合矩陣實現(xiàn)單個毛細(xì)管中多色熒光染料的同時檢測；(2)可以回收熒光染料分散在線陣CCD上所有象素上的有效光，光譜利用率高；(3)可以采用象素組合的方式提高分布矩陣的穩(wěn)定性，減少計算量，提高檢測的穩(wěn)定性；
4[0018](4)可以應(yīng)用與線陣C⑶檢測實現(xiàn)單根毛細(xì)管的熒光檢測，也可以應(yīng)用于面C⑶上實現(xiàn)毛細(xì)管陣列的熒光分光處理；(5)實現(xiàn)裝置結(jié)構(gòu)簡單，易操作。

圖1是本實用新型一種基于光譜校正的毛細(xì)管陣列電泳檢測裝置結(jié)構(gòu)示意圖； 圖2是光譜校正方法實現(xiàn)示意圖。其中1-激光器、2-聚焦鏡I、3-毛細(xì)管、4-激光和熒光束、5_聚焦鏡II和濾光鏡、6-光柵、7-熒光束、8-聚焦鏡III、9-CCD、10-光譜圖、11-熒光染料
具體實施方式
現(xiàn)結(jié)合附圖及實施例對本實用新型裝置作進一步詳細(xì)說明。本實用新型的一種基于光譜校正的毛細(xì)管陣列電泳檢測裝置，包括激光器1、毛細(xì)管陣列3、光柵6、電荷耦合元件CCD9及光學(xué)系統(tǒng)，激光器所發(fā)出的激光經(jīng)光學(xué)系統(tǒng)照射到毛細(xì)管3中的熒光染料11經(jīng)光柵6分光再經(jīng)光學(xué)系統(tǒng)在電荷耦合元件CCD9上成像形成熒光譜圖10，所述光學(xué)系統(tǒng)包括聚焦鏡II和濾光鏡5。參考圖1激光器1發(fā)射的激光通過聚焦鏡I 2照射毛細(xì)管3中熒光染料11，從毛細(xì)管3中射出的激光和熒光束4通過聚焦鏡II和濾光鏡5，激光被濾掉，熒光進入光柵6， 分光后的熒光束7通過聚焦鏡III 8在CXD上成顯光譜圖10。”參考圖2，當(dāng)熒光染料11通過毛細(xì)管3的檢測窗口時被激光束1激發(fā)，熒光光譜經(jīng)過成像裝置成像在線陣(XD9上。用光譜校正對面陣CCD上熒光信號進行解譜的步驟如下。首先我們要知道所用熒光標(biāo)記物有幾種，設(shè)定為η種。我們讓η種標(biāo)記熒光分別在面陣CXD上成像，得到這η種熒光在CXD上的光譜分布。為了數(shù)據(jù)處理方便，我們把整個面陣CCD分成若干個小塊(如每14象素X 3象素為一塊)，標(biāo)記為bin，假定總共用到m個 bin, 一般m >如。這里解釋一下為什么要把CXD上的象素做bin處理如果用光譜校正對面陣CCD上熒光信號進行解譜的步驟如下。首先我們要知道所用熒光標(biāo)記物有幾種，設(shè)定為η種。我們讓η種標(biāo)記熒光分別在面陣CXD上成像，得到這η種熒光在CXD上的光譜分布。為了數(shù)據(jù)處理方便，我們把整個面陣CCD分成若干個小塊(如每14象素X 3象素為一塊)，標(biāo)記為bin，假定總共用到m個 bin, 一般m >如。這里解釋一下為什么要把CXD上的象素做bin處理如果以CCD上的象素為測量單位，建立起來的矩陣會穩(wěn)定性很差，抗干擾能力弱，微小的擾動就可能帶來不可預(yù)知的結(jié)果；當(dāng)然如果bin選擇的太大，矩陣的穩(wěn)定性會很好，但是分光效果會比較差。故一般選擇在20bin左右，并通過轉(zhuǎn)換矩陣的條件數(shù)來衡量矩陣的抗干擾能力。把每種熒光落在CXD每個bin上的熒光強記錄下來，得到一個mXn的矩陣P。 由于每種標(biāo)記物被激發(fā)的熒光強度差別很大，為了后期進行信號處理的方便，對矩陣P進行歸一得到矩陣Q= (Qij)mxn0通過Q矩陣我們就可以對所用熒光在CXD上的成像組合進行光譜解譜了。如某時刻從CXD各個bin上采的熒光光強分布為一 mX 1矩陣B，每種熒光的相對強度是一個nX 1矩陣X，貝|J:QX = B。進行矩陣變換得到X= (QtQ)^1(QtB)0從上式可以得知，當(dāng)我們得到了光譜校正矩陣Q后，只要得到任意時刻熒光落在面陣CCD上各個bin的強度分布矩陣B，就可以通過光譜校正得到各種熒光的相對強度分布，從而得到所用熒光的光譜信息。在下面的實驗中可以看出，即使CCD上的熒光光譜重疊非常嚴(yán)重，甚至無法判讀出峰位，也可以通過這種方法得到很好的熒光譜圖。進行DNA片斷分析時，對每一根毛細(xì)管中的光譜數(shù)據(jù)，通過光譜校正矩陣解譜得到每種染料的光譜數(shù)據(jù)。原來分布雜散的光譜分光后得到每種熒光獨立的位置分布，分布位置對應(yīng)光譜波長。對連續(xù)多幀光譜數(shù)據(jù)進行處理獲得DNA片斷信息。盡管通過參照實用新型的某些優(yōu)選實施例，已經(jīng)對實用新型進行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本實用新型的精神和范圍。
權(quán)利要求1.一種基于光譜校正的毛細(xì)管陣列電泳檢測裝置，其特征在于，所述裝置包括激光器、毛細(xì)管陣列、光柵、電荷耦合元件CCD及光學(xué)系統(tǒng)，激光器所發(fā)出的激光經(jīng)光學(xué)系統(tǒng)照射到毛細(xì)管中的熒光染料，經(jīng)光柵分光，再經(jīng)光學(xué)系統(tǒng)在電荷耦合元件CCD上成像形成熒光譜圖，所述光學(xué)系統(tǒng)包括聚焦鏡和濾光鏡。
2.按照權(quán)利要求1所述的基于光譜校正的毛細(xì)管陣列電泳檢測裝置，其特征在于，所述激光器發(fā)射的激光通過聚焦鏡照射毛細(xì)管中熒光染料，從毛細(xì)管中射出的激光和熒光束通過聚焦鏡和濾光鏡，激光被濾掉，熒光進入光柵，分光后的熒光束通過聚焦鏡在CCD上成像，形成光譜圖。
專利摘要本實用新型提供一種基于光譜校正的毛細(xì)管陣列電泳檢測裝置，所述裝置包括激光器、毛細(xì)管陣列、光柵、電荷耦合元件CCD及光學(xué)系統(tǒng)，激光器所發(fā)出的激光經(jīng)光學(xué)系統(tǒng)照射到毛細(xì)管中的熒光染料，經(jīng)光柵分光，再經(jīng)光學(xué)系統(tǒng)在電荷耦合元件CCD上成像形成熒光譜圖，所述光學(xué)系統(tǒng)包括聚焦鏡和濾光鏡。本實用新型采用激光激發(fā)熒光染料，獲得熒光染料組合矩陣實現(xiàn)單個毛細(xì)管中多色熒光染料的同時檢測；既可應(yīng)用于線陣CCD檢測實現(xiàn)單根毛細(xì)管的熒光檢測，也可以應(yīng)用于面CCD上實現(xiàn)毛細(xì)管陣列的熒光分光處理；實現(xiàn)裝置結(jié)構(gòu)簡單，易操作。
文檔編號G01N21/64GK202196015SQ20112020126
公開日2012年4月18日 申請日期2011年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月15日
發(fā)明者張濤, 李彬, 賈二惠, 趙怡鶴, 陳學(xué)亮 申請人:公安部第一研究所, 北京中盾安民分析技術(shù)有限公司