專利名稱：同時(shí)檢測對(duì)蝦白斑病毒和桃拉病毒的層析條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型屬于免疫學(xué)與病毒學(xué)交叉技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種能夠同時(shí)檢測對(duì)蝦白斑病毒(WSSV)和桃拉病毒(TSV)的層析條。
背景技術(shù)：
二十世紀(jì)80年代以來,世界沿海各國的對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)蓬勃發(fā)展，隨著對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的企業(yè)化發(fā)展，其病害也日益突出，特別是對(duì)蝦病毒性的疫病已成為阻礙這ー產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。對(duì)奸白斑綜合癥病毒(WSSV, White Spot Syndrome Virus)是一種沒有包涵體的新型桿狀病毒，毎年造成對(duì)蝦大量死亡，給生產(chǎn)帶來巨大損失，是迄今為止危害最為嚴(yán)重的一種對(duì)奸病毒。桃拉病毒(Taura syndrome virus, TSV)是一種無囊膜的單鏈正股RNA病毒,屬于雙反病毒科，但尚未確定屬。1992年對(duì)蝦桃拉病首次在厄瓜多爾海灣Taura河流域的養(yǎng)殖場爆發(fā)，死亡率高達(dá)60% -90%，此后在拉丁美洲大流行，給對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失， 2005年委內(nèi)瑞拉因爆發(fā)TSV而造成對(duì)蝦養(yǎng)殖損失高達(dá)10-13億美元。隨著對(duì)蝦養(yǎng)殖與貿(mào)易的全球化，桃拉病也傳人了中國。近年來的對(duì)蝦白斑綜合征病毒、桃拉綜合癥病毒等病毒性傳染病在世界范圍內(nèi)的傳播除給對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失之外，還對(duì)海洋資源的可持續(xù)發(fā)展造成巨大威脅， 因此對(duì)蝦病毒病的研究已成為當(dāng)前世界蝦病研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)之一。對(duì)蝦病毒的傳播途徑主要有兩種，一種是投喂被病毒污染餌料而經(jīng)ロ感染，包括鮮活餌料和水體，攝食病蝦尸體或病蝦排泄物等。另ー種是接觸感染，健康對(duì)蝦在水體中與病蝦接觸易感染。此外，垂直傳播在對(duì)蝦病毒傳播中也起重要的作用。目前對(duì)蝦病毒尚無有效的藥物治療，因此避免與病毒病原體的接觸是最有效的預(yù)防措施，因此借助早期診斷技術(shù)、及早預(yù)防，將有利于防止病毒的發(fā)生及傳播。目前，已經(jīng)有多種方法用來檢測診斷對(duì)蝦病毒，有顯微鏡觀察法、生物學(xué)方法、免疫測定法、細(xì)胞培養(yǎng)法、生化檢驗(yàn)法、分子生物學(xué)方法等。以上方法對(duì)于對(duì)蝦養(yǎng)殖者來講掌握難度大，難以推廣，從而這些技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展受到了限制。免疫膠體金技術(shù)是60年代繼三大標(biāo)記技術(shù)(熒光素、放射性同位素和酶)后發(fā)展起來的固相標(biāo)記免疫測定技木。膠體金免疫層析法是利用膠體金本身的顯色特點(diǎn)結(jié)合免疫層析技術(shù)診斷特異性的待測物。該方法最大特點(diǎn)是單份測定、簡單快速、特異敏感，不需任何儀器設(shè)備和試劑，幾分鐘就可用觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在應(yīng)用膠體金免疫層析法檢測對(duì)蝦病毒方面，杜華華等的專利“一種檢測對(duì)蝦白斑綜合癥病毒快速檢測試紙條及其制備方法(申請?zhí)?01010228584. X) ”，孟小林等的專利“檢測對(duì)蝦白斑綜合癥病毒的試紙條及其制備方法(200610124654. 0) ”，費(fèi)榮梅等的專利“對(duì)蝦桃拉綜合征病毒膠體金檢測試紙條(申請?zhí)?01010189767. 5) ”，以往利用膠體金免疫層析技術(shù)的專利以表達(dá)的P28蛋白制備多克隆抗體或單克隆抗體為原料，只能單純檢測ー種對(duì)蝦病毒，由于表達(dá)的p28単一蛋白制備多克隆抗體或單克隆抗體后出現(xiàn)假陽性的可性比較高。

實(shí)用新型內(nèi)容為了解決上述問題，本實(shí)用新型的目的在于提供ー種可快速、準(zhǔn)確、簡便、以及同時(shí)檢測出WSSV和TSV的層析條。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本實(shí)用新型所采用技術(shù)方案如下ー種同時(shí)檢測對(duì)蝦白斑病毒和桃拉病的層析條，包括一基板，在所述基板上從左至右依次粘貼有樣品墊、膠體金標(biāo)記墊、硝酸纖維素膜、以及吸收墊。所述同時(shí)檢測對(duì)蝦白斑病毒和桃拉病的層析條，所述樣品墊的長為2. 0厘米寬為
0.8厘米，所述膠體金標(biāo)記墊的長為0. 4厘米寬為0. 8厘米，所述硝酸纖維素膜的長為2. 2 厘米寬為0. 8厘米，所述吸收墊的長為2. 8厘米寬為0. 8厘米。本實(shí)用新型中的膠體金標(biāo)記墊，以膠體金來標(biāo)記抗WSSV抗體和抗TSV抗體，來同時(shí)檢測對(duì)蝦體內(nèi)的WSSV和TSV，此法方法方便、簡單、快速，適合現(xiàn)場檢測使用。本實(shí)用新型通過一次操作可同時(shí)檢測出WSSV和TSV，無需專門設(shè)施和操作技木，適于普通養(yǎng)殖戶池邊檢測。

[0013]此附圖說明所提供的圖片用來輔助對(duì)本實(shí)用新型的進(jìn)ー步理解，構(gòu)成本申請的ー部分，并不構(gòu)成對(duì)本實(shí)用新型的不當(dāng)限定，在附圖中[0014]圖I為本實(shí)用新型層析條的結(jié)構(gòu)示意圖；[0015]圖2為檢測結(jié)果中WSSV和TSV都呈陽性的示意圖；[0016]圖3為檢測結(jié)果中WSSV呈陽性的示意圖；[0017]圖4為檢測結(jié)果中TSV呈陽性的示意圖；[0018]圖5為檢測結(jié)果呈陰性的示意圖；[0019]圖6為檢測結(jié)果無效的示意圖。[0020]圖示[0021]I、樣品墊 2、膠體金標(biāo)記墊[0022]3、硝酸纖維素膜 4、吸收墊
具體實(shí)施方式
下面將結(jié)合附圖以及具體實(shí)施方法來詳細(xì)說明本實(shí)用新型，在本實(shí)用新型的示意性實(shí)施及說明用來解釋本實(shí)用新型，但并不作為對(duì)本實(shí)用新型的限定。實(shí)施例I :如圖I所示，本實(shí)用新型公開了ー種同時(shí)檢測對(duì)蝦白斑病毒和桃拉病的層析條， 包括一基板，在基板上從左至右依次粘貼有樣品墊I、膠體金標(biāo)記墊2、硝酸纖維素膜3、以及吸收墊4 ;其中，樣品墊I選用濾油紙樣品墊，其長為2. 0厘米寬為0. 8厘米；其中，膠體金標(biāo)記墊2的抗WSSV抗體(購買于abeam公司)和抗TSV抗體(購買于abeam公司)，其長為0. 4厘米寬為0. 8厘米；其中，硝酸纖維素膜3，依次包被WSSV、TSV和羊抗兔IgG(購買于武漢博士德)，其上檢測線成階梯狀交錯(cuò)分布，其長為2. 2厘米寬為0. 8厘米；其中，吸收墊4可選用棉漿板，其長為2. 8厘米寬為0. 8厘米，吸收墊4上有與硝酸纖維素膜3上的具體檢測線相對(duì)應(yīng)的標(biāo)識(shí)區(qū)。ニ、本實(shí)用新型層析條的制備方法(I)對(duì)蝦白斑綜合病病毒和桃拉綜合病病毒的制備采用蔗糖密度梯度超速離心法提取，步驟如下①分別收集感染白斑綜合病病毒和桃拉綜合病病毒的對(duì)蝦腮和血淋巴液，用玻璃勻漿器充分研磨后制成懸液，經(jīng)反復(fù)凍融3次后，置于_20°C冰箱中，備用。②先以5000g離心15min,取上清,然后再20000g高速離心30min后取上清過夜。 接著IOOOOOg超速離心2h，將沉淀用少量STE溶解。③先在超速離心管中加入5_8mL的第2步所獲取的含病毒樣品的溶解液，然后在離心管中依次加入30 %，45 %，60 %的蔗糖，加的時(shí)候是用長針頭從底部往上加的。I IOOOOg 離心2. 5h，發(fā)現(xiàn)在30%與45%以及與60%之間都有一條明亮的帶，用長針頭將兩條不同部位的帶都吸取出來，分別收集到不同的瓶內(nèi)。④去蔗糖用STE緩沖液適量稀釋純化的病毒，然后IlOOOOg離心3h，用少量STE 緩沖液把沉淀懸起，即最后獲得了純化的病毒。_20°C凍純，用時(shí)可用分光光度計(jì)測定其病毒含量。得到了 WSSV病毒TSV病毒。(2)膠體金的制備取0. 01%氯金酸溶液100ml，加熱煮沸，攪拌下快速加入I. Oml 的I %檸檬酸三鈉溶液，直到溶液顏色穩(wěn)定成酒紅色，用0. lmol/L的K2C03溶液將膠體金溶液調(diào)PH值至8. 5，即得到膠體金溶液。(3)金標(biāo)抗體制備攪拌下將抗WSSV抗體和抗TSV抗體5 U g/ml加入上述a步中膠體金溶液中混合，然后加入10%牛血清白蛋白(BSA)溶液10ml，將此標(biāo)記好的膠體金結(jié)合物10000-14000r/min離心30-60分鐘，棄上清，將沉淀用含I % BSA的磷酸鹽(PBS)緩沖液懸浮，恢復(fù)原體積后再離心，如此洗滌2-4次，最后將沉淀懸浮于1/10體積含I % BSA的 PBS緩沖液中。(4)載有金標(biāo)抗體的結(jié)合墊的制備將(3)中制備的膠體金結(jié)合物溶液均勻涂在玻璃纖維上，冷凍干燥，密封備用。(5)檢測反應(yīng)區(qū)取硝酸纖維素膜(NC膜)貼在基板中間，將純化的WSSV和TSV在 NC膜上依次劃線，為抗體檢測線T線，接著用羊抗兔IgG在NC膜下方劃質(zhì)控線(C線)，再用1%的牛血清白蛋白封閉硝酸纖維素膜，將已噴好的硝酸纖維素膜真空干燥2小時(shí)，密封備用。(6)組裝在底板上一端依次相互搭接地粘貼樣品吸收墊、膠體金標(biāo)記墊、硝酸纖維素膜，另一端貼附吸收墊。三、檢測方法首先取對(duì)蝦腮，加入適量純浄水充分搗碎制成待檢樣品。接著將試紙條的樣品墊浸入待檢樣品中，5分鐘后觀察結(jié)果。如圖2所示，WSSV與TSV陽性結(jié)果WSSV與TSV檢測線處與質(zhì)控線上下呈現(xiàn)三條紅色的檢測線，表示有WSSV與TSV感染。如圖3所示，WSSV陽性結(jié)果WSSV檢測線處與質(zhì)控線上下呈現(xiàn)兩條紅色的檢測線， 表示只有WSSV感染。[0041 ] 如圖4所示，TSV陽性結(jié)果TSV檢測線處與質(zhì)控線上下呈現(xiàn)兩條紅色的檢測線，表示只有TSV感染。如圖5所示，陰性結(jié)果只有質(zhì)控線呈現(xiàn)出一條紅色的檢測線，表示無WSSV與TSV 感染，或者WSSV與TSV含量極低。如圖6所示，無效結(jié)果檢測線與質(zhì)控線均無紅色線出現(xiàn)，表示檢測結(jié)果無效。以上對(duì)本實(shí)用新型實(shí)施例所提供的技術(shù)方案進(jìn)行了詳細(xì)介紹，本文中應(yīng)用了具體個(gè)例對(duì)本實(shí)用新型實(shí)施例的原理以及實(shí)施方式進(jìn)行了闡述，以上實(shí)施例的說明只適用于幫助理解本實(shí)用新型實(shí)施例的原理；同時(shí)，對(duì)于本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員，依據(jù)本實(shí)用新型實(shí)施例，在具體實(shí)施方式
以及應(yīng)用范圍上均會(huì)有改變之處，綜上所述，本說明書內(nèi)容不應(yīng)理解為對(duì)本實(shí)用新型的限制。
權(quán)利要求1.ー種同時(shí)檢測對(duì)奸白斑病毒和桃拉病毒的層析條，包括一基板，其特征在于在所述基板上從左至右依次粘貼有樣品墊(I)、膠體金標(biāo)記墊(2)、硝酸纖維素膜(3)、以及吸收墊⑷。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的同時(shí)檢測對(duì)蝦白斑病毒和桃拉病毒的層析條，其特征在于 所述樣品墊(I)的長為2. 0厘米寬為0. 8厘米，所述膠體金標(biāo)記墊(2)的長為0. 4厘米寬為0. 8厘米，所述硝酸纖維素膜(3)的長為2. 2厘米寬為0. 8厘米，所述吸收墊(4)的長為2. 8厘米寬為0.8厘米。
專利摘要本實(shí)用新型屬于免疫學(xué)與病毒學(xué)交叉技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了一種同時(shí)檢測對(duì)蝦白斑病毒和桃拉病毒的層析條。該層析條，包括一基板，在所述基板上從左至右依次粘貼有樣品墊、膠體金標(biāo)記墊、硝酸纖維素膜、以及吸收墊。本實(shí)用新型中的膠體金標(biāo)記墊，以膠體金來標(biāo)記抗WSSV抗體和抗TSV抗體，來同時(shí)檢測對(duì)蝦體內(nèi)的WSSV和TSV，此法方法方便、簡單、快速，適合現(xiàn)場檢測使用。本實(shí)用新型通過一次操作可同時(shí)檢測出WSSV和TSV，無需專門設(shè)施和操作技術(shù)，適于普通養(yǎng)殖戶池邊檢測。
文檔編號(hào)G01N33/569GK202339344SQ20112026944
公開日2012年7月18日 申請日期2011年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月28日
發(fā)明者李健興, 李月明, 溫俊林, 王少沛, 趙肅清, 閆鴻鵬 申請人:廣東工業(yè)大學(xué), 廣州清綠健康科技發(fā)展有限公司