專利名稱：改進(jìn)的糖基化測定、糖分析陣列和測定系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請涉及改進(jìn)的糖基化測定(分析)。
背景技術(shù)：
寡糖和多糖是由單糖(糖)單元通過糖苷鍵互相連接而組成的聚合物。這些聚合物具有可根據(jù)單糖亞單元的線性序列進(jìn)行描述的結(jié)構(gòu)，其稱為多糖的二維結(jié)構(gòu)。也可根據(jù)由它們的組分單糖亞單元在三個(gè)維度形成的結(jié)構(gòu)來描述多糖。與DNA或蛋白的鏈一樣，糖鏈具有兩個(gè)不同的末端。在糖鏈的情況下，這些是還原性末端(相當(dāng)于線性糖分子的醛基)和非還原性末端。然而，與蛋白和DNA不同，多糖一般
被支化，其中基本上多糖中的每個(gè)糖單元均可作為可選的支化點(diǎn)。存在許多結(jié)合于糖的蛋白。許多這些蛋白特異性地結(jié)合于特定短單糖序列或二糖序列。凝集素是與糖結(jié)合的蛋白的一大家族。已表征了許多植物凝集素并在研究中使用。也表征了許多哺乳動(dòng)物凝集素?？贵w是特異性識(shí)別特定分子結(jié)構(gòu)的蛋白。與凝集素一樣，抗體也可識(shí)別糖結(jié)構(gòu)。糖苷酶是能夠切割糖鏈中糖苷鍵的酶。糖苷酶也可特異性識(shí)別特定寡糖序列。糖基轉(zhuǎn)移酶是將糖單元轉(zhuǎn)移至受體分子的酶。在體內(nèi)，這些受體分子是增長的聚糖結(jié)構(gòu)。多糖的結(jié)構(gòu)測定對糖生物學(xué)的發(fā)展非常重要。糖生物學(xué)的研究涉及包括細(xì)菌細(xì)胞壁、血液聚糖的對象，涉及與病毒性疾病如HIV感染，自身免疫病如胰島素依賴型糖尿病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，以及如在癌癥中發(fā)生的異常細(xì)胞生長有關(guān)的生長因子和細(xì)胞表面受體結(jié)構(gòu)。青霉素的發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了糖分子的重要性，青霉素是細(xì)菌細(xì)胞壁糖分子合成的抑制齊U，并且可能是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的最成功的抗生素。另一個(gè)實(shí)例是肝素的醫(yī)學(xué)應(yīng)用，肝素是能抑制血液凝固的粘多糖，并且目前廣泛用于醫(yī)藥中。醫(yī)學(xué)上重要的糖分子的另外的實(shí)例包括粘多糖(GAG)、硫酸乙酰肝素、單克隆抗體、細(xì)胞因子(例如，IL-8、TNF、和最成功的ΕΡ0)、趨化因子(例如酸性成纖維細(xì)胞生長因子)和不同的生長因子。上述細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子也能夠結(jié)合于GAG和其它多糖，因此也可以被認(rèn)為是凝集素。多糖的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性阻礙它們的分析。例如，認(rèn)為糖類通過非模板依賴性機(jī)理進(jìn)行合成。在缺少結(jié)構(gòu)信息的情況下，研究人員因此必須假設(shè)構(gòu)建單元選自目前已知的任意糖單元。此外，這些單元可能在合成過程中例如通過加入硫酸酯基團(tuán)而被修飾。在沒有測量該碳水化合物結(jié)構(gòu)信息的能力的情況下，研究人員無法確定細(xì)胞群體例如組織中真實(shí)的、正確的糖基化模式。此外，這些單元可能在合成過程中例如通過加入硫酸酯基團(tuán)而被修飾，使得僅僅了解添加了哪些類型的糖并不能提供全貌。此外,糖單元間的連接是多樣的。如果所連接的糖單元是己糖，則該糖可以連接至Cl、C2、C3、C4或C6原子中的任一個(gè)。而且，與Cl原子的連接可能為α構(gòu)型或β構(gòu)型。此外，許多糖之間的結(jié)構(gòu)上的差異是微小的，因?yàn)樘菃卧赡軆H僅通過羥基的位置區(qū)別于另一個(gè)(差向異構(gòu)體)。在體內(nèi)，糖基化是組織依賴性的，并可以隨著細(xì)胞狀態(tài)而顯著變化。在體外，糖基化強(qiáng)烈地取決于生長條件細(xì)胞類型，養(yǎng)分濃度，PH，細(xì)胞密度和年齡可以影響糖蛋白的糖基化模式。糖型的數(shù)量及其在細(xì)胞內(nèi)的相對豐度受到單個(gè)蛋白的固有結(jié)構(gòu)性質(zhì)以及可用的糖基化酶的全部性質(zhì)(包括其類型、濃度、動(dòng)力學(xué)特征、區(qū)室化)的影響。已顯示該全部性質(zhì)在細(xì)胞狀態(tài)改變時(shí)發(fā)生變化(例如，致癌性轉(zhuǎn)化)。

實(shí)用新型內(nèi)容本申請?zhí)峁┝烁倪M(jìn)的糖基化測定。該改進(jìn)的測定能夠提供更準(zhǔn)確的結(jié)果。這些改進(jìn)的實(shí)例包括但不限于對測定系統(tǒng)的測定優(yōu)化改進(jìn)；涉及陣列改進(jìn)的K指紋陣列格式；與檢測系統(tǒng)的改進(jìn)有關(guān)的QC監(jiān)測和校正；陣列和系統(tǒng)的測定外標(biāo)志(out of assay flag)的 實(shí)施。根據(jù)至少一些實(shí)施方式，提供了糖分析陣列，包括平面基板和存在于所述基板的表面上多個(gè)預(yù)定位置的多種糖結(jié)合劑，所述多種糖結(jié)合劑中的每一種存在于所述表面上的多個(gè)獨(dú)立的預(yù)定位置，其中所述多個(gè)獨(dú)立的預(yù)定位置涉及所述位置的所述糖結(jié)合劑在濃度曲線中的多個(gè)濃度；所述平面基板適于接觸包括糖蛋白的樣品，使得所述糖蛋白與至少一種糖結(jié)合劑特異性結(jié)合并形成可檢測的結(jié)合復(fù)合物，以便根據(jù)所述濃度曲線來確定非特異性結(jié)合的基線。根據(jù)至少一些實(shí)施方式，提供了一種糖分析陣列，其特征在于，包括平面基板；和多個(gè)接觸部，所述多個(gè)接觸部存在于所述平面基板的表面上的多個(gè)預(yù)定位置處，在所述多個(gè)接觸部中設(shè)置有多種糖結(jié)合劑，所述多種糖結(jié)合劑設(shè)置在所述平面基板的預(yù)定位置中；所述多種糖結(jié)合劑中的每一種存在于所述表面上的多個(gè)獨(dú)立的預(yù)定位置，其中所述多個(gè)獨(dú)立的預(yù)定位置設(shè)置有在濃度曲線中的多個(gè)濃度的所述糖結(jié)合劑；所述平面基板被設(shè)置成與包括糖蛋白的樣品接觸，使得所述糖蛋白在所述多個(gè)接觸部處與至少一種糖結(jié)合劑特異性結(jié)合并形成可檢測的結(jié)合復(fù)合物，以便根據(jù)所述濃度曲線確定用于非特異性結(jié)合的基線。可選地，所述接觸部選自圓形、橢圓形、方形的凹槽、凹陷或孔。可選地，可通過結(jié)合信號(hào)對所述可檢測的結(jié)合復(fù)合物進(jìn)行檢測，并且其中在所述濃度曲線中，所述結(jié)合信號(hào)在糖結(jié)合劑濃度總數(shù)的至少五個(gè)中是線性的?？蛇x地，所述平面基板具有凹陷或孔?？蛇x地，所述平面基板包括膜、玻璃或塑料中的至少一種。可選地，所述平面基板為衍生化的?？蛇x地，所述陣列進(jìn)一步包括在所述平面基板上的多個(gè)標(biāo)記的預(yù)定位置，以提供高信號(hào)來支持所述陣列在與所述樣品接觸后的圖像分析?？蛇x地，所述陣列進(jìn)一步包括多種糖結(jié)合劑，在所述平面基板的預(yù)定位置中作為校正標(biāo)準(zhǔn)?？蛇x地，所述平面基板被分為多個(gè)襯墊，并且其中每一個(gè)襯墊包括獨(dú)立的多個(gè)校正標(biāo)準(zhǔn)?？蛇x地,所述糖結(jié)合劑包括凝集素或抗體,或其修飾的成分或組合?？蛇x地，所述基板上的每種凝集素的濃度范圍為O. 01mg/ml至10mg/ml。可選地，所述濃度范圍為O. 001mg/ml至10mg/ml。可選地，所述濃度范圍為0. 01mg/ml至5mg/ml?？蛇x地，每個(gè)位置具有斑點(diǎn)尺寸直徑，并且其中所述斑點(diǎn)尺寸直徑在0. 05mm至75mm的范圍內(nèi)。可選地，每個(gè)位置具有斑點(diǎn)尺寸直徑，并且其中所述斑點(diǎn)尺寸直徑在80微米至2500微米的范圍內(nèi)?？蛇x地，所述糖蛋白包括IgG抗體或片段?？蛇x地，每個(gè)位置所述IgG的量在I. 8-12 μ g的范圍內(nèi)?？蛇x地，在用于將所述IgG抗體或片段與所述糖結(jié)合劑接觸的溶液中，所述IgG濃度在O. 001微摩爾至100微摩爾的范圍內(nèi)?？蛇x地，所述溶液包括去污劑，以展開所述IgG抗體或片段并暴露至少一種聚糖。根據(jù)本申請的至少一些實(shí)施方式，提供了用如本文所述的多個(gè)陣列進(jìn)行糖基化測 定的測定系統(tǒng)，其包括用于進(jìn)行所述糖基化測定的試劑盒，通過結(jié)合信號(hào)來檢測所述可檢測的結(jié)合復(fù)合物以獲得結(jié)合數(shù)據(jù)的檢測器，以及測定優(yōu)化模塊，其用于比較參考數(shù)據(jù)和從樣品糖蛋白獲得的所述結(jié)合數(shù)據(jù)，以通過計(jì)算最佳凝集素活性，測量僅與樣品糖蛋白產(chǎn)生信號(hào)的凝集素，以及通過與基于使用大量樣品類型創(chuàng)建的實(shí)驗(yàn)確定的數(shù)據(jù)庫來定義的計(jì)算的基線相比較而計(jì)算載玻片背景值，來確定合適的測定條件。根據(jù)本申請的至少一些實(shí)施方式，提供了一種用于進(jìn)行糖基化測定的測定系統(tǒng)其特征在于，包括-多個(gè)陣列，-測定執(zhí)行模塊，所述多個(gè)陣列連接至所述測定執(zhí)行模塊(104)，或容納在所述測定執(zhí)行1吳塊中；-檢測器，連接至所述測定執(zhí)行模塊，通過所述檢測器檢測所述糖結(jié)合劑與樣品蛋白的結(jié)合；-測定數(shù)據(jù)分析儀，與所述檢測器通信或連接至所述檢測器；-測定外標(biāo)志模塊；連接至所述測定數(shù)據(jù)分析儀或者與所述測定數(shù)據(jù)分析儀通信；以及-測定優(yōu)化模塊，連接至所述測定數(shù)據(jù)分析儀或者與所述測定數(shù)據(jù)分析儀通信；其中，所述多個(gè)陣列中的每一個(gè)包括_平面基板；和-多個(gè)接觸部，所述多個(gè)接觸部存在于所述平面基板的表面上的多個(gè)預(yù)定位置處，在所述多個(gè)接觸部中設(shè)置有多種糖結(jié)合劑，所述多種糖結(jié)合劑設(shè)置在所述平面基板的預(yù)定位置中；所述多種糖結(jié)合劑中的每一種存在于所述表面上的多個(gè)獨(dú)立的預(yù)定位置，其中所述多個(gè)獨(dú)立的預(yù)定位置設(shè)置有在濃度曲線中的多個(gè)濃度的所述糖結(jié)合劑；所述平面基板被設(shè)置成與包括糖蛋白的樣品接觸，使得所述糖蛋白在所述多個(gè)接觸部處與至少一種糖結(jié)合劑特異性結(jié)合并形成可檢測的結(jié)合復(fù)合物，以便根據(jù)所述濃度曲線確定用于非特異性結(jié)合的基線?？蛇x地，所述接觸部選自圓形、橢圓形、方形的凹槽、凹陷或孔?？蛇x地，所述陣列插入或提供至所述測定執(zhí)行模塊，可選地用于測定優(yōu)化僅一次?？蛇x地，所述檢測器與所述測定執(zhí)行模塊組合或與所述測定執(zhí)行模塊分開?？蛇x地，所述檢測器與所述測定數(shù)據(jù)分析儀組合或與所述測定數(shù)據(jù)分析儀分開。可選地，所述測定優(yōu)化模塊包括數(shù)據(jù)庫，所述數(shù)據(jù)庫包含與感興趣的蛋白在不同實(shí)驗(yàn)條件下測定的結(jié)合有關(guān)的數(shù)據(jù)?？蛇x地，所述測定優(yōu)化模塊接收包含其它特定類型蛋白的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果的文件?？蛇x地，所述測定優(yōu)化模塊根據(jù)以下參數(shù)中的一個(gè)或多個(gè)進(jìn)一步確定合適的測定條件用于溫育樣品蛋白和糖結(jié)合劑的結(jié)合時(shí)間、溫度和緩沖液的PH值；糖結(jié)合劑信號(hào)、信號(hào)比、當(dāng)暴露為非最佳時(shí)發(fā)生反應(yīng)的一組指定的糖結(jié)合劑、背景值以及與校正標(biāo)準(zhǔn)背景相比較的背景值；樣品緩沖液中的去污劑濃度；以及樣品蛋白濃度?？蛇x地，所述測定優(yōu)化模塊對樣品糖蛋白濃度、基板格式和測定格式進(jìn)行優(yōu)化。可選地，所述樣品糖蛋白包括IgG抗體，并且其中所述測定優(yōu)化模塊確定IgG樣品抗體是否具有Fab糖基化或O-連接糖基化，以便實(shí)施特異優(yōu)化條件，以及發(fā)出有關(guān)這樣的糖基化存在的警告?？蛇x地，所述測定優(yōu)化模塊確定施加于所述樣品糖蛋白的暴露溶液的量，其中所 述暴露溶液具有用于展開蛋白的本領(lǐng)域中已知百分比的去污劑，其選自由膽酸鹽、脫氧膽酸鹽、C16TAB、LysoPC, CHAPS、兩性表面活性劑(兼性離子洗滌劑，Zwittergent)、辛基糖苷、洋地黃皂苷、蘆布若爾、C12E8、曲拉通X-100 (Triton X-100)、諾乃P-40SDS (十二烷基硫酸鈉)、和吐溫-80組成的組?？蛇x地，所述測定優(yōu)化模塊確定涉及以下中的一個(gè)或多個(gè)的條件矩陣最優(yōu)化暴露溶液濃度0. 001至1%，最優(yōu)化溫度50-80°C，預(yù)處理溫育的最優(yōu)化時(shí)間1分鐘至I小時(shí)?？蛇x地，該系統(tǒng)進(jìn)一步包括至少一個(gè)QC (質(zhì)量控制)監(jiān)測，其選自由通過前景均一性、背景均一性、平均中位密度間的相似性、飽和水平進(jìn)行的斑點(diǎn)評(píng)估；根據(jù)陣列背景、對照斑點(diǎn)、陣列內(nèi)重現(xiàn)性對整個(gè)平面基板的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估的陣列驗(yàn)證；樣品和校正位置之間歸一化的評(píng)估；整個(gè)陣列信號(hào)的測定組成的組。可選地，該系統(tǒng)進(jìn)一步包括作為校正樣品而施加于多個(gè)包含所述糖結(jié)合劑的預(yù)定位置的校正蛋白，以根據(jù)黃金指紋標(biāo)準(zhǔn)，通過所述測定優(yōu)化模塊來校正糖結(jié)合劑的反應(yīng)性。可選地，所述測定優(yōu)化模塊可根據(jù)所述樣品糖蛋白與所述校正樣品的結(jié)合信號(hào)的比較來確定測定外標(biāo)志?？蛇x地，所述測定優(yōu)化模塊根據(jù)所述測定外標(biāo)志發(fā)出警告。除非另有規(guī)定，此處使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本申請所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解相同的含義。雖然可在本申請的實(shí)施或測試中使用與本文所述的相似或等同的方法和材料，但下面描述合適的方法和材料。本文中提及的所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻(xiàn)的全部內(nèi)容均以引用方式并入本文中。這些包括但不限于WO00/68688 和 W001/84147(US20060194269, US20070092915, US7056678 和 US7132251)， WO02/37106 (US20040132131)，和 WO 02/44714 (US7079955 和 US20040153252)。在沖突的情況下，以本說明書，包括定義為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實(shí)例僅是說明性的，并不旨在是限制性的。

此處僅通過舉例的方式，參考附圖對本申請進(jìn)行描述。在現(xiàn)在對圖的詳細(xì)內(nèi)容進(jìn)行具體參考的情況下，強(qiáng)調(diào)以實(shí)施例的方式顯示詳細(xì)內(nèi)容并且僅用于對本申請的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行描述性討論，并且是為了提供認(rèn)為最有用的和最容易理解本申請的原理和概念方面的描述而提出的。在這方面，與基本理解本申請所必需的細(xì)節(jié)相比，未試圖更加詳細(xì)地顯示本申請的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，圖所附的描述使得如何使本申請的幾種形式在實(shí)踐中體現(xiàn)對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。在圖中圖I示出了根據(jù)本申請的至少一些實(shí)施方式的示例性陣列；圖2示出了根據(jù)本申請的至少一些實(shí)施方式的示例性系統(tǒng)；圖3涉及用于根據(jù)本申請的至少一些實(shí)施方式的示例性凝集素的示例性印刷濃度；圖4示出了用于圖2的系統(tǒng)操作的示例性QC和校正過程，以及圖5示出了測試優(yōu)化實(shí)驗(yàn)布局、樣品和陣列類型與不同的測試樣品暴露條件結(jié)合的結(jié)果，其實(shí)驗(yàn)是使用示例性的IgG抗體，阿瓦斯汀，通過上述系統(tǒng)針對一個(gè)陣列類型(一個(gè)襯墊載玻片或多個(gè)襯墊載玻片)進(jìn)行測試的。
具體實(shí)施方式
本申請是改進(jìn)的糖基化測定。根據(jù)本申請的優(yōu)選實(shí)施方式，可能可選地且優(yōu)選地根據(jù)與本申請共有的美國專利號(hào)7，056，678進(jìn)行這樣的測定，此處以參考方式并入本文，如同在本文中完全闡述一樣。例如，該專利描述了用于糖的結(jié)構(gòu)分析的方法，包括在表面上設(shè)置多個(gè)必需的序列特異性和/或位點(diǎn)特異性結(jié)合劑，使表面與待分析的糖的混合物接觸，例如來自細(xì)胞或組織的特定區(qū)室的糖分子的提取物；洗滌或以其他方式去除未結(jié)合的糖或糖片段；將之前獲得的必需序列特異性和/或位點(diǎn)特異性標(biāo)志物，或必需序列特異性和/或位點(diǎn)特異性標(biāo)志物的混合物添加到表面上；獲得結(jié)合于表面的標(biāo)志物的一個(gè)或多個(gè)圖像；以及衍生(導(dǎo)出)與通過圖像分析的糖的鑒定有關(guān)的信息。在一個(gè)方面，本申請?zhí)峁┝艘环N糖分析陣列102，其特征在于，包括平面基板I ;和多個(gè)接觸部10，所述多個(gè)接觸部存在于所述平面基板I的表面上的多個(gè)預(yù)定位置處，在所述多個(gè)接觸部10中設(shè)置有多種糖結(jié)合劑，所述多種糖結(jié)合劑作為在所述平面基板I的預(yù)定位置中的分析樣品上的聚糖結(jié)構(gòu)的檢測器；所述多種糖結(jié)合劑中的每一種存在于所述表面上的多個(gè)獨(dú)立的預(yù)定位置10，其中所述多個(gè)獨(dú)立的預(yù)定位置10設(shè)置有在濃度曲線中的多個(gè)濃度的所述糖結(jié)合劑；所述平面基板I被設(shè)置成與包括糖蛋白的樣品接觸，使得所述糖蛋白在所述多個(gè)接觸部10處與至少一種糖結(jié)合劑特異性結(jié)合并形成可檢測的結(jié)合復(fù)合物，以便根據(jù)所述濃度曲線確定用于非特異性結(jié)合的基線。在另一方面，提供了一種用于進(jìn)行糖基化測定的測定系統(tǒng)100，其特征在于，包括-多個(gè)陣列102，所述多個(gè)陣列102中的每一個(gè)包括平面基板I;和多個(gè)接觸部10，所述多個(gè)接觸部10存在于所述平面基板I的表面上的多個(gè)預(yù)定位置處，在所述多個(gè)接觸部10中設(shè)置有多種糖結(jié)合劑，所述多種糖結(jié)合劑設(shè)置在所述平面基板I的預(yù)定位置中；所述多種糖結(jié)合劑中的每一種存在于所述表面上的多個(gè)獨(dú)立的預(yù)定位置10，其中所述多個(gè)獨(dú)立的預(yù)定位置10設(shè)置有在濃度曲線中的多個(gè)濃度的所述糖結(jié)合劑；所述平面基板I被設(shè)置成與包括糖蛋白的樣品接觸，使得所述糖蛋白在所述多個(gè)接觸部10處與至少一種糖結(jié)合劑特異性結(jié)合并形成可檢測的結(jié)合復(fù)合物，以便根據(jù)所述濃度曲線確定用于非特異性結(jié)合的基線；-測定執(zhí)行模塊104，所述多個(gè)陣列102連接至所述測定執(zhí)行模塊104，或容納在所述測定執(zhí)彳丁I旲塊104中；-檢測器105，連接至所述測定執(zhí)行模塊104，通過所述檢測器105檢測所述糖結(jié)合劑與樣品蛋白的結(jié)合；-測定數(shù)據(jù)分析儀106，與所述檢測器105通信或連接至所述檢測器105；-測定外標(biāo)志模塊107;連接至所述測定數(shù)據(jù)分析儀106或者與所述測定數(shù)據(jù)分析儀106通信；以及-測定優(yōu)化模塊108，連接至所述測定數(shù)據(jù)分析儀106或者與所述測定數(shù)據(jù)分析儀 106通信。可選地，所述接觸部10選自圓形、橢圓形、方形的凹槽、凹陷或孔?？蛇x地，所述陣列102插入或提供至所述測定執(zhí)行模塊104。 可選地，所述檢測器105與所述測定執(zhí)行模塊104組合或與所述測定執(zhí)行模塊104分開。可選地，所述檢測器105與所述測定數(shù)據(jù)分析儀106組合或與其分開?？蛇x地，所述測定優(yōu)化模塊108包括數(shù)據(jù)庫，所述數(shù)據(jù)庫包含與感興趣的蛋白在不同實(shí)驗(yàn)條件下測定的結(jié)合有關(guān)的數(shù)據(jù)?？蛇x地，所述測定優(yōu)化模塊108接收包含其它特定類型蛋白的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果的文件。其上設(shè)置有結(jié)合劑的表面可以包括，例如珠或陣列，或多孔板(例如96孔板)，但優(yōu)選包括平面基板。平面基板(優(yōu)選具有凹陷或孔)上的陣列可選地可以包括膜、玻璃或塑料表面等中的任一種。可選地可以通過獲得標(biāo)志物的圖像并生成待分析的多糖的識(shí)別位點(diǎn)圖來檢測糖結(jié)合標(biāo)志物的結(jié)合，以衍生(導(dǎo)出)樣品結(jié)構(gòu)上的部分結(jié)構(gòu)分布，從而衍生涉及多糖的至少部分序列信息。標(biāo)志物可選地可以包括色原結(jié)合劑，使得通過結(jié)合劑與例如復(fù)合物的結(jié)合來提供圖像，所述圖像是在基板表面顯像的顏色?？商鎿Q地，標(biāo)志物可能是標(biāo)記的結(jié)合劑，使得根據(jù)來自標(biāo)記的信號(hào)提供標(biāo)志物的圖像?？赏ㄟ^例如使用濾光器、激光掃描儀或通過攝影和/或數(shù)字化圖像來獲得圖像。用于測定樣品例如細(xì)胞或人類IgG的糖基化模式或“指紋”的另外的方法和測定還披露在美國專利申請?zhí)?0050186645中，其也與本申請共有，將其以參考方式并入本文，如同在本文中完全闡述一樣。該申請描述了一種通過將糖分子添加到連接有一種或多種糖結(jié)合劑(此處還稱作第一糖結(jié)合劑)的基板上來獲得關(guān)于糖分子的碳水化合物含量信息的方法。鑒定了與糖分子結(jié)合的第一糖結(jié)合劑，并且所得的結(jié)合信息用于生產(chǎn)糖分子的指紋。本申請的必需序列特異性和/或位點(diǎn)特異性結(jié)合劑可以包括，例如凝集素(例如有色凝集素、熒光凝集素、生物素標(biāo)記的凝集素)或抗體(例如，熒光抗體、生物素標(biāo)記的抗體、或酶標(biāo)記的抗體)。可使用至少五個(gè)凝集素實(shí)施方法或測定，例如，5、IO、15、20、25、30、
35、40、45或50個(gè)凝集素，雖然可以可選地使用任意數(shù)量的凝集素，例如約5個(gè)凝集素至約100個(gè)或更多的凝集素。例如，可以可選地使用以4-8組重復(fù)(或任意其他合適的重復(fù)組)印在膜涂覆的載玻片上的一組20-30個(gè)凝集素實(shí)施該方法，或者可替換地在能夠提供每個(gè)印刷的凝集素的劑量應(yīng)答的濃度范圍內(nèi)。將完整糖蛋白的樣品應(yīng)用于陣列，并通過使用任意熒光團(tuán)直接標(biāo)記或通過使用針對蛋白部分-例如抗體，或碳水化合物部分-凝集素的熒光團(tuán)標(biāo)記的探針來檢測其結(jié)合模式。所得的指紋是高度特有的樣品的糖基化模式。每個(gè)都具有其特異識(shí)別模式的大量的凝集素，可確保指紋對糖基化模式的變化的高靈敏性?？梢允褂迷S多熒光標(biāo)記，如FITC、羅丹明、Cy3、Cy5、或任意Alexa染料。此處將這些熒光標(biāo)記和染料標(biāo)記統(tǒng)稱為“色原標(biāo)記”。此外，可使用本領(lǐng)域中已知的生物素-親和素系統(tǒng)和/或使用任意其它合適的標(biāo)記類型進(jìn)行標(biāo)記。在如上述進(jìn)行分析之前，可以可選地對糖分子進(jìn)行修飾。本申請的方法和測定可以可選地在整個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行?？商鎿Q地，方法和測定可在細(xì)胞制品中進(jìn)行(非完整細(xì)胞材料)，例如膜蛋白提取物、細(xì)胞勻漿、或粗制膜混合物。在包括使用完整細(xì)胞的實(shí)施方式中，優(yōu)選首先對細(xì)胞進(jìn)行固定。例如，通過添加在索倫森氏緩沖液(Sorenson’s buffer),pH 為 7. 3 (Tousimis Research Corp. ,Rockville,Md)中的I %戊二醛的溶液，在24-48小時(shí)后用索倫森氏緩沖液洗滌，細(xì)胞可固定在RPMI培養(yǎng)基的懸浮液中，(如例如描述在Sanders et al,A high-yield technique for pr印aringcells fixed in suspension for scanning electron microscopy,The Journal of CellBiology, Volume 67，1975，pages 476480 中)?？商鎿Q地，可通過在環(huán)境溫度下將細(xì)胞浸入PBS/3. 7%甲醛中60分鐘對細(xì)胞進(jìn)行固定，隨后用蒸懼水洗搽細(xì)胞(如例如描述在Nimrichter et al, Intact cell adhesionto glycan microarrays, Glycobiology, vol. 14，no. 2 ；pp. 197-203，2004 中)。當(dāng)然，可以可選地進(jìn)行任何類型的細(xì)胞固定過程，以允許檢測糖結(jié)合劑與細(xì)胞的
彡口口 本申請的方法可以可選地并優(yōu)選地在體外進(jìn)行。本申請的方法和測定可以可選地并優(yōu)選地使用Qproteome Glycoprofiling試劑盒(Qiagen,美國)或任意GlycoScope型試劑盒實(shí)施。使用了精心挑選的大量數(shù)據(jù)集、已表征的糖蛋白、和一大組酶合成的這些蛋白的糖變異體，通過分析超過80個(gè)凝集素的組對在這樣的試劑盒中使用的凝集素進(jìn)行選擇。在可能的情況下，根據(jù)單糖特異性對陣列上的凝集素進(jìn)行分組；表示為“復(fù)合物”的組中的凝集素不與單糖結(jié)合，但可與復(fù)雜N-連接聚糖結(jié)合。下面詳細(xì)描述各組和每組內(nèi)凝集素間的差異。復(fù)合物該組中的凝集素可識(shí)別位于復(fù)雜N-連接復(fù)合聚糖的三甘露糖基核心的兩個(gè)α -甘露糖殘基中任一個(gè)的分支。由于該組中某些凝集素結(jié)合聚糖結(jié)構(gòu)的大部分，因此它們對不同的天線末端是敏感的。表示為復(fù)合物(I)和復(fù)合物(4)的凝集素傾向于2，6_支化結(jié)構(gòu)；凝集素復(fù)合物(3)傾向于2，4_支化結(jié)構(gòu)，而凝集素復(fù)合物(2)以相似親和力識(shí)別兩種結(jié)構(gòu)。GlcNAc該組中的凝集素與N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)結(jié)合，并且其β 4_連接的寡聚物具有隨后者的鏈長增加而增加的親和力。該組中兩種凝集素的碳水化合物特異性不存在差異，但觀察到其結(jié)合模式中的差異，并且可能源于樣品的非碳水化合物部分。Gl c/Man該凝集素組是甘露糖結(jié)合凝集素的子組(參見下面)，并且由于它們除了與甘露糖結(jié)合以外還與葡萄糖結(jié)合，因此表示為Glc/Man結(jié)合凝集素。該組中的所有凝集素與雙天線復(fù)合N-連接聚糖以高親和力結(jié)合。將其對雙天線結(jié)構(gòu)的親和力進(jìn)行比較，凝集素Glc/Man(I)和(2)以較低的親和力結(jié)合于高甘露糖聚糖，而凝集素Glc/Man(3)將以較高的親和力結(jié)合于高甘露糖聚糖。甘露糖該組由特異性結(jié)合于甘露糖的凝集素組成。這些凝集素可以以較低的親和力結(jié)合于高甘露糖結(jié)構(gòu)，并且可識(shí)別雙天線復(fù)合結(jié)構(gòu)的核心甘露糖。末端GlcNAc該凝集素特異性地識(shí)別末端GIcNAc殘基。a -Gal這些凝集素結(jié)合于末端α -半乳糖(a -Gal)。凝集素a -Gal (I)可與α -半乳糖和a -GalNAc ( α -N-乙酰半乳糖胺)兩者結(jié)合，并且可結(jié)合于N和O-連接聚糖。凝集素a-Gal (3)主要與以N-連接天線為基礎(chǔ)的Galili抗原(Galal_3Gal)結(jié)合。β -Gal這些凝集素特異性結(jié)合于末端(非唾液酸化的)β -半乳糖殘基。Gal/GalNAc這些凝集素對末端半乳糖和N-乙酰半乳糖胺殘基是特異性的。該組內(nèi)的不同凝集素對于半乳糖和N-乙酰半乳糖胺的相對親和力有所不同。來自該組的凝集素(2)和(5)幾乎專門地與Gal結(jié)合；凝集素⑴、(3)和(4)幾乎專門地與GalNAc結(jié)合。組中的其余凝集素對GalNAc/Gal的相對親和力順序?yàn)?8) >
(7)> (6)。巖藻糖來自該組的凝集素以各種連接與巖藻糖殘基結(jié)合。凝集素巖藻糖(6)優(yōu)先與1-2連接的巖藻糖結(jié)合；凝集素巖藻糖(8)優(yōu)先與1-3和1-6連接的巖藻糖結(jié)合；凝集素巖藻糖(12)和(13)優(yōu)先與Fucl-4G1CNAC結(jié)合(路易斯A抗原)。由于空間位阻，這些凝集素通常不與完整糖蛋白上的N-連接寡糖的核心巖藻糖
彡口口 唾液酸唾液酸凝集素與帶電荷的唾液酸殘基反應(yīng)。也觀察到該組的成員對其它酸性基團(tuán)(如硫酸鹽化)具有中級(jí)特異性。凝集素唾液酸(I)主要識(shí)別2-3連接的唾液酸；凝集素唾液酸(4)主要識(shí)別2-6連接的唾液酸。應(yīng)當(dāng)理解，僅以討論為目的提供這些用于檢測糖基化的方法和測定的實(shí)例，并且不用于以任何方式限制本申請，可在本申請中可選地使用任何其它合適的方法和/或測定。參照附圖和所附描述及以下實(shí)施例可以更好地理解本申請的原理和操作。[0112]實(shí)施例I對測定系統(tǒng)的測定優(yōu)化改進(jìn)該實(shí)施例涉及對測定系統(tǒng)的測定優(yōu)化改進(jìn)。該測定系統(tǒng)通?？捎糜跍y定用于許多不同類型蛋白的糖基化。然而，發(fā)現(xiàn)了針對一種類型蛋白的該系統(tǒng)的特異性改進(jìn)，其優(yōu)選涉及抗體，并且優(yōu)選人類IgG抗體。已驚人地發(fā)現(xiàn)這些蛋白的糖分析需要暴露隱藏在蛋白結(jié)構(gòu)中的聚糖，而這可通過特異性改進(jìn)的糖分析系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。系統(tǒng)限定了最佳暴露條件，并帶領(lǐng)使用者通過優(yōu)化過程，包括測定參數(shù)和分析參數(shù)。系統(tǒng)調(diào)節(jié)陣列以及使用調(diào)節(jié)的陣列進(jìn)行檢測的相關(guān)陣列條件，并且包括樣品緩沖液中的最佳暴露溫度和暴露溶液濃度，優(yōu)化方案和軟件。系統(tǒng)優(yōu)選驗(yàn)證了所選的最佳暴露處理與通過傳統(tǒng)方法例如HPLC和/或通過如下更詳細(xì)描述的對照獲得的參比結(jié)果相比，能夠?qū)崿F(xiàn)準(zhǔn)確的糖分析。雖然優(yōu)選針對圖2所述的測定系統(tǒng)進(jìn)行完整分析，但可選地在通過HPLC或其它測定分析前對蛋白進(jìn)行消化。可使用具有或不具有HPLC參比的方案，以允許使用者進(jìn)行內(nèi)部校正或以簡單方式校正。該系統(tǒng)優(yōu)選具有測定軟件以及有關(guān)方案和樣品?！と鐖DI中所示，本申請的糖分析陣列102包括平面基板I ;和多個(gè)接觸部10，所述多個(gè)接觸部10存在于所述平面基板I的表面上的多個(gè)預(yù)定位置處，在所述多個(gè)接觸部10中設(shè)置有多種糖結(jié)合劑，所述多種糖結(jié)合劑根據(jù)它們的結(jié)合特異性在所述平面基板I的預(yù)定位置中作為糖類和聚糖的檢測器；所述多種糖結(jié)合劑中的每一種存在于所述表面上的多個(gè)獨(dú)立的預(yù)定位置10，其中所述多個(gè)獨(dú)立的預(yù)定位置10設(shè)置有在濃度曲線中的多個(gè)濃度的所述糖結(jié)合劑；所述平面基板I被設(shè)置成與包括糖蛋白的樣品接觸，使得所述糖蛋白在所述多個(gè)接觸部10處與至少一種糖結(jié)合劑特異性結(jié)合并形成可檢測的結(jié)合復(fù)合物，以便根據(jù)所述濃度曲線確定用于非特異性結(jié)合的基線。如圖2所示，提供測定系統(tǒng)100以進(jìn)行糖基化測定。測定系統(tǒng)100具有多個(gè)陣列102，每個(gè)都包括固體(優(yōu)選平面)基板，在該固體基板上以預(yù)定順序提供多個(gè)序列或位點(diǎn)特異性的糖結(jié)合劑(對于該順序的格式的非限定性實(shí)例，參見下面的實(shí)施例2)。這樣的結(jié)合劑包括但不限于抗體、凝集素等。這樣的凝集素的非限定性實(shí)例先前已描述。固體基板可以可選地包括多孔膜，例如硝酸纖維素，或非多孔基板，例如玻璃(如本領(lǐng)域中已知的，優(yōu)選對后一類型的基板進(jìn)行衍生化以允許蛋白穩(wěn)固地與其結(jié)合)?？蛇x地可以根據(jù)如下實(shí)施例2所述的K指紋陣列格式來制備陣列102。優(yōu)選通過基于測定方案和測定優(yōu)化方案中的具體說明的試劑盒的組分對陣列102進(jìn)行處理，例如包括一種或多種如本文所述的洗滌和/或封閉緩沖液(blockingbuffers)。可以可選地將陣列102插入(或以其他方式提供至)測定執(zhí)行模塊104，用于自動(dòng)制備和執(zhí)行如本文所述的測定方案。在測定執(zhí)行模塊104中，將樣品蛋白施加于每個(gè)陣列102上，接著進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)洗滌步驟?？蛇x地，在施加樣品蛋白前，還進(jìn)行一次或多次封閉、平衡和/或洗滌步驟。“封閉”是指施加緩沖液以阻斷非特異性相互作用。也可以在樣品蛋白施加于陣列102后可選地進(jìn)行這樣的封閉。以下也將陣列102稱為“載玻片”。在施加樣品蛋白后以及可選地在一個(gè)或多個(gè)洗滌步驟后，通過檢測器105檢測糖結(jié)合劑與樣品蛋白的結(jié)合。應(yīng)注意，樣品蛋白可選地在沒有糖結(jié)合劑的情況下首先結(jié)合于陣列102，并且之后施加糖結(jié)合劑，但在任何情況下，均通過檢測器105對糖結(jié)合劑和樣品蛋白之間的復(fù)合物的形成進(jìn)行檢測。檢測器105可選地可以與檢測執(zhí)行模塊104組合或可以可替換地與其分尚。檢測器105優(yōu)選接收直接指示結(jié)合的原始信號(hào)；例如，如果使用比色指示器來檢測結(jié)合復(fù)合物的形成，則可選地用檢測器105進(jìn)行圖像分析以獲得原始結(jié)合信號(hào)。可選地并且優(yōu)選地，隨后用測定數(shù)據(jù)分析儀106分析數(shù)據(jù)以確定結(jié)合是否確實(shí)發(fā)生。檢測器105與測定數(shù)據(jù)分析儀106連通，但可能可選地與測定數(shù)據(jù)分析儀106組合或可替換地與其分離。通過計(jì)算糖結(jié)合劑信號(hào)例如凝集素信號(hào)，并且通過計(jì)算凝集素信號(hào)比來測量結(jié)合。例如，如下文中的某些實(shí)施例所述，認(rèn)為可選的校正結(jié)果或QC(質(zhì)量控制)因素能夠確定結(jié)合是否發(fā)生?？蛇x地，如實(shí)施例4所述，測定外標(biāo)志模塊107對任何異常的或“離群”結(jié)果進(jìn)行標(biāo)志，并且也檢測測定相關(guān)的問題；還如下文更詳細(xì)地描述的，通過進(jìn)一步考慮可能可選地排除這些結(jié)果。 隨后測定優(yōu)化模塊108接收結(jié)合結(jié)果。測定優(yōu)化模塊108優(yōu)選包括數(shù)據(jù)庫，其含有與感興趣的蛋白在不同實(shí)驗(yàn)條件下測定的結(jié)合有關(guān)的數(shù)據(jù)，在本實(shí)施例中感興趣的蛋白為IgG抗體。測定優(yōu)化模塊108優(yōu)選接收含有其它特定類型蛋白如IgG抗體的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果的文件。文件優(yōu)選包括涉及以下內(nèi)容的數(shù)據(jù)校正標(biāo)準(zhǔn)在不同暴露條件的基質(zhì)中的所需樣品(不同暴露溶液濃度和不同暴露溫度)參比樣品用于這樣的實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)布局的非限定性實(shí)例(例如參見圖5)為圖5示出了優(yōu)化/暴露校正實(shí)驗(yàn)結(jié)果的實(shí)例。該實(shí)驗(yàn)優(yōu)選進(jìn)行一次，以利用樣品確定用于未來實(shí)驗(yàn)的最佳條件。下面的表示出了實(shí)驗(yàn)布局(具有相關(guān)測試暴露條件的所需載玻片和樣品)。當(dāng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，如圖5所示，通過具有另外的信息如用戶名、日期等的系統(tǒng)來產(chǎn)生一組結(jié)果/糖分析。將圖5所示的報(bào)告加載(上傳)到用于分析的測定優(yōu)化軟件模塊，并且該系統(tǒng)產(chǎn)生表明用于運(yùn)行未來測定的最佳條件的報(bào)告。
I號(hào)襯墊/載2號(hào)襯塾3號(hào)襯塾/ 4號(hào)襯墊/ 5號(hào)襯墊/ 6號(hào)襯墊/ 7號(hào)襯墊/ 8號(hào)襯墊/ 玻片(頂部/載玻片載玻片載玻片載玻片載玻片載玻片載玻片 襯墊/第I載(底部襯
玻片)________墊)
培養(yǎng)基暴露無暴露培養(yǎng)基暴培養(yǎng)基暴低暴露溶高暴露溶高暴露溶高暴露溶 溶液濃度％處理露溶液濃露溶液濃液濃度％液濃度％液濃度％液濃度％
(低溫。C) 測試IgG度％(低度％ (低(低溫。C)(低溫°C)(高溫。C)(低溫。C)
校正標(biāo)準(zhǔn)溫°() 溫°() 測試IgG 測試IgG 測試IgG 參比樣品
(已提供)測試IgG 測試IgG(已提供)每個(gè)襯墊或載玻片與材料的類型和/或材料和特定樣品暴露條件的組合有關(guān)，因而與產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)條件設(shè)定的實(shí)驗(yàn)組有關(guān)。例如，對于襯墊載玻片(如載玻片數(shù)量為2)，在特定暴露條件(溫度、暴露溶液濃度和暴露時(shí)間)下，在每片載玻片上均存在一種材料。在載玻片之間提供共享的校正標(biāo)準(zhǔn)以實(shí)現(xiàn)校正數(shù)據(jù)。多襯墊載玻片具有一個(gè)基板，如一個(gè)平面基板，但具有多個(gè)子區(qū)域。對于這樣的載玻片，第一襯墊通常為校正標(biāo)準(zhǔn)?？蛇x地，獨(dú)立襯墊可具有樣品、參比標(biāo)準(zhǔn)和對照。可在相同載玻片或襯墊/子區(qū)域中提供多于一個(gè)的具有不同檢測劑(例如具有不同顏色的比色劑)的探針。此外，如果可提供，則測定優(yōu)化模塊108還可以可選地接收對存在于陣列102中的相同蛋白樣品和至少一種糖結(jié)合蛋白的比較性HPLC(高效液相色譜)數(shù)據(jù)；可選地根據(jù)本領(lǐng)域中已知的一種或多種方法來獲得數(shù)據(jù)。然后測定優(yōu)化模塊108將所有可用的參比數(shù)據(jù)和獲自樣品蛋白的實(shí)際數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，以通過計(jì)算最佳凝集素活性，測量僅當(dāng)樣品暴露時(shí)產(chǎn)生信號(hào)的凝集素，以及通過與基于使用大量樣品類型創(chuàng)建的實(shí)驗(yàn)確定的數(shù)據(jù)庫來定義的計(jì)算的基線相比較而計(jì)算載玻片背景值，來確定最合適的測定條件。這樣的參數(shù)的非限定性實(shí)例包括用于溫育樣品蛋白和糖結(jié)合劑的結(jié)合時(shí)間、溫度和緩沖液的暴露溶液濃度值；凝集素(糖結(jié)合劑)信號(hào)、信號(hào)比、當(dāng)暴露為非最佳時(shí)發(fā)生反應(yīng)的一組指定的凝集素、背景值以及與校正標(biāo)準(zhǔn)背景相比較的背景值；樣品緩沖液中的 ES(暴露溶液)濃度(例如樣品緩沖液體積的O. 01%);和樣品蛋白濃度。測定優(yōu)化模塊108也可特異性確定IgG樣品抗體蛋白是否具有Fab糖基化或O-連接糖基化；如果有，則實(shí)施特異優(yōu)化條件。對使用者發(fā)出有關(guān)該糖基化存在的警告，該糖基化的存在可能對結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生負(fù)面影響?？蛇x地，對一個(gè)或多個(gè)以下的其它參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化-樣品濃度-載玻片格式-測定格式-解釋算法(腳本)為了將測定定制為特異性mAb (抗體)并允許Fe (免疫分子)相關(guān)聚糖的最大化暴露而進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化包括至少三個(gè)參數(shù)的校正暴露溶液濃度，溫度和暴露預(yù)處理的溫育時(shí)間，以將聚糖暴露于陣列凝集素。暴露溶液可以可選地包括任何適合將未暴露的聚糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行暴露的成分，其會(huì)以其他方式被封閉?？蛇x地且優(yōu)選地，溶液含有去污劑；更優(yōu)選地，去污劑選自包括膽酸鹽、脫氧膽酸鹽、C16TAB、LysoPC、CHAPS、兩性表面活性劑(兼性離子洗漆劑，Zwittergent、SDS>辛基糖苷、洋地黃皂苷、蘆布若爾、C12E8、曲拉通X-100 (Triton X-100)、諾乃P-40、和吐溫-80的組，其比例均為用于展開蛋白的本領(lǐng)域已知的百分比。由于蛋白序列的差異可能影響抗體的生化和結(jié)構(gòu)特性，因此暴露條件可能會(huì)隨著單克隆抗體不同而稍微變化。待控制的條件矩陣可以可選地包括優(yōu)化暴露溶液濃度0. 001%至1%優(yōu)化溫度50_80°C預(yù)處理溫育的優(yōu)化時(shí)間I分鐘至I小時(shí)通過如本文所述的軟件方法自動(dòng)地進(jìn)行最佳條件的選擇。實(shí)施例2多濃度陣列格式多濃度陣列格式涉及對其本身物理陣列的改進(jìn)，以獲得更優(yōu)化的結(jié)合結(jié)果。與先前陣列類型中的單一濃度相比，該新型網(wǎng)格格式在陣列上使用了針對每個(gè)凝集素(或抗體-糖結(jié)合劑)而印刷的濃度曲線。開發(fā)多濃度格式以便提高系統(tǒng)重現(xiàn)性并生成更精確的信號(hào)。不希望限于封閉列表中，多濃度陣列格式還提供了至少以下改進(jìn)指紋和解釋水平的更高的重現(xiàn)性在某些非特異性結(jié)合的情況下，用于定義基線的改進(jìn)和更可靠的方式多濃度格式能夠解決各種問題， 例如“凝集素零點(diǎn)”，重現(xiàn)性和樣品濃度，這些問題對于高背景或低信號(hào)可以是非常重要的。對該問題的解決使得印刷在陣列上的糖結(jié)合劑的量得以降低。多濃度格式定義了每個(gè)結(jié)合劑有多個(gè)斑點(diǎn)，包括用于每個(gè)糖結(jié)合劑如凝集素的濃度曲線，因而每個(gè)陣列需要更多斑點(diǎn)。為了實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)，對陣列格式進(jìn)行修飾，并且使每個(gè)凝集素包括另外的斑點(diǎn)。也將板格式進(jìn)行改變以包括所有改進(jìn)的自動(dòng)圖像分析所需的濃度和其它標(biāo)記斑點(diǎn)。添加更多斑點(diǎn)可能降低自動(dòng)圖像分析軟件精確地檢測陣列上的斑點(diǎn)并定位虛擬測量網(wǎng)格(設(shè)置斑點(diǎn)值并計(jì)算指紋)的能力。為了提高圖像分析能力，可能提供其它的標(biāo)記斑點(diǎn)，包括在處理的陣列掃描過程中提供高信號(hào)的預(yù)標(biāo)記蛋白。如上所述，多濃度格式針對每個(gè)糖結(jié)合劑例如凝集素定義濃度曲線。在該非限定性實(shí)施例中，針對印刷在多個(gè)斑點(diǎn)之上的陣列的固體基板上的凝集素的量，給出了濃度曲線。優(yōu)選地，對于陣列基板上的每個(gè)凝集素(糖結(jié)合劑)，存在多個(gè)不同的斑點(diǎn)，其與不同蛋白濃度相關(guān)?？蛇x地，濃度范圍為O. 01mg/ml至10mg/ml ;優(yōu)選地,該范圍為O. 038mg/ml至
3.5mg/ml,并且更優(yōu)選地為O. 05mg/ml至lmg/ml (作為每毫升點(diǎn)樣溶液中的凝集素的毫克量給出)。例如，凝集素ConA的濃度在圖3中給出，具有7種不同的濃度(因而在物理基板上有7個(gè)不同斑點(diǎn)，每個(gè)含有凝集素的量在表中給出)。多濃度印刷格式用于計(jì)算載玻片上每種凝集素的信號(hào)曲線。如上所述，系統(tǒng)100優(yōu)選自動(dòng)測定哪些濃度是可接受的；如果信號(hào)和線性存在問題，則可以可選地忽略曲線中多達(dá)2個(gè)濃度點(diǎn)(在濃度的總數(shù)之內(nèi))。所計(jì)算的曲線和信號(hào)的質(zhì)量決定所提交指紋的錯(cuò)誤值。預(yù)計(jì)結(jié)合信號(hào)在凝集素濃度總數(shù)的至少五個(gè)中呈線性；該參數(shù)是通過測定優(yōu)化模塊108測定的參數(shù)之一，并且是選擇如實(shí)施例I所述的特定實(shí)驗(yàn)條件組的標(biāo)準(zhǔn)之一。通過接觸或非接觸印刷，可選地在陣列上制備多濃度格式，如先前所述優(yōu)選平面基板。如其名稱所示，接觸印刷涉及將包覆有含有糖結(jié)合劑的溶液的固體裝置如針頭與平面基板的表面接觸。非接觸印刷可能例如可選地涉及噴灑或含有糖結(jié)合劑的溶液的其它分布方式，以使糖結(jié)合劑沉積在平面基板上。對于接觸印刷,斑點(diǎn)尺寸直徑優(yōu)選從O. 05mm至75mm變化。對于非接觸印刷,斑點(diǎn)尺寸直徑優(yōu)選從80微米至2500微米變化。“直徑”指的是斑點(diǎn)的最長軸(尺寸)；斑點(diǎn)不需要呈圓形或關(guān)于它們的軸對稱。根據(jù)每個(gè)斑點(diǎn)的樣品蛋白的量，對于IgG蛋白，推薦的IgG量在I. 8-12 μ g的范圍內(nèi)。推薦的IgG濃度在O. OOl微摩爾至100微摩爾的范圍內(nèi)；特別優(yōu)選O. I μ M。實(shí)施例3QC監(jiān)測和校ιΗQC(質(zhì)量控制)監(jiān)測和校正涉及測定系統(tǒng)的改進(jìn)。QC監(jiān)測識(shí)別在系統(tǒng)100的工作流程的濕(載玻片處理)和干(掃描)階段中的技術(shù)問題。檢測的主要問題是載玻片質(zhì)量、掃描質(zhì)量、副本間的相關(guān)性(如果有)和圖像分析步驟過程中的問題。提供給使用者實(shí)驗(yàn)中的載玻片和樣品的數(shù)值得分(對于技術(shù)質(zhì)量，等級(jí)為0-1，而對于圖像分析網(wǎng)格校正質(zhì)量，等級(jí)為-100至-200)。在提供每個(gè)樣品的報(bào)告中提供了關(guān)于每個(gè)得分的內(nèi)部成分的更詳細(xì)的信息。計(jì)算階段:算法的計(jì)算階段以測試載玻片上的每個(gè)斑點(diǎn)開始；每個(gè)斑點(diǎn)根據(jù)其均一性和背景水平接收得分。在該過程中可排除某些斑點(diǎn)。然后根據(jù)其平均斑點(diǎn)質(zhì)量，兩個(gè)相同子塊間的相關(guān)性和其它技術(shù)參數(shù)，對整個(gè)載玻片進(jìn)行打分。下一階段是測試副本載玻片間的相關(guān)性(兩個(gè)樣品載玻片，或兩個(gè)對照載玻片)。如果副本相關(guān)性很差，則系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)選擇更好的載玻片作為計(jì)算的基礎(chǔ)。下表總結(jié)了用于計(jì)算載玻片得分的主要監(jiān)測；應(yīng)當(dāng)注意，下表是用于一種載玻片類型的實(shí)例，并且對于其它的載玻片格式和/或表面類型可以是不同的。
權(quán)利要求1.一種糖分析陣列，包括平面基板和存在于所述基板的表面上多個(gè)預(yù)定位置的多種糖結(jié)合劑，所述多種糖結(jié)合劑中的每一種存在于所述表面上的多個(gè)獨(dú)立的預(yù)定位置，其中所述多個(gè)獨(dú)立的預(yù)定位置涉及所述位置的所述糖結(jié)合劑在濃度曲線中的多個(gè)濃度；所述平面基板適于接觸包括糖蛋白的樣品，使得所述糖蛋白與至少一種糖結(jié)合劑特異性結(jié)合并形成可檢測的結(jié)合復(fù)合物，以便根據(jù)所述濃度曲線確定用于非特異性結(jié)合的基線。
2.一種糖分析陣列(102)，其特征在于，包括 平面基板(I);和 多個(gè)接觸部(10)，所述多個(gè)接觸部(10)存在于所述平面基板(I)的表面上的多個(gè)預(yù)定位置處，在所述多個(gè)接觸部(10)中設(shè)置有多種糖結(jié)合劑，所述多種糖結(jié)合劑設(shè)置在所述平面基板(I)的預(yù)定位置中；所述多種糖結(jié)合劑中的每一種存在于所述表面上的多個(gè)獨(dú)立的預(yù)定位置(10)，其中所述多個(gè)獨(dú)立的預(yù)定位置(10)設(shè)置有在濃度曲線中的多個(gè)濃度的所述糖結(jié)合劑；所述平面基板(I)被設(shè)置成與包括糖蛋白的樣品接觸，使得所述糖蛋白在所述多個(gè)接觸部(10)處與至少一種糖結(jié)合劑特異性結(jié)合并形成可檢測的結(jié)合復(fù)合物，以便根據(jù)所述濃度曲線確定用于非特異性結(jié)合的基線。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的陣列，其中，所述平面基板具有凹陷或孔。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的陣列，其中，所述平面基板包括膜、玻璃或塑料中的至少一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的陣列，其中，所述平面基板是衍生化的。
6.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的陣列，其中，所述陣列進(jìn)一步包括在所述平面基板上的多個(gè)標(biāo)記的預(yù)定位置，以提供高信號(hào)來支持所述陣列在與所述樣品接觸后的圖像分析。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的陣列，其中，所述陣列進(jìn)一步包括多種糖結(jié)合劑，在所述平面基板的預(yù)定位置作為校正標(biāo)準(zhǔn)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的陣列，其中，所述平面基板被分成多個(gè)襯墊，并且其中每一個(gè)襯墊包括獨(dú)立的多個(gè)校正標(biāo)準(zhǔn)。
9.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的陣列，其中，所述糖結(jié)合劑包括凝集素或抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的陣列，其中，所述基板上的每種凝集素的濃度范圍為O. 001mg/ml 至 10mg/ml。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的陣列,其中，所述濃度范圍為O.01mg/ml至10mg/ml。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的陣列，其中，所述濃度范圍為0.01mg/ml至5mg/ml。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的陣列，其中，每個(gè)位置具有斑點(diǎn)尺寸直徑，并且其中所述斑點(diǎn)尺寸直徑在0. 05mm至75mm的范圍內(nèi)。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的陣列，其中，每個(gè)位置具有斑點(diǎn)尺寸直徑，并且其中所述斑點(diǎn)尺寸直徑在80微米至2500微米的范圍內(nèi)。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的陣列，其中，所述糖蛋白包括IgG抗體或片段。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的陣列，其中，每個(gè)位置所述IgG量在I.8-12 μ g的范圍內(nèi)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的陣列，其中，在用于使所述IgG抗體或片段與所述糖結(jié)合劑接觸的溶液中，所述IgG濃度在O. 001微摩爾至100微摩爾的范圍內(nèi)。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的陣列，其中，所述溶液包括去污劑，用于展開所述IgG抗體或片段并暴露至少一種聚糖。
19.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的陣列，其中，所述平面基板具有凹陷或孔。
20.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的陣列，其中，所述糖結(jié)合劑包括凝集素或抗體。
21.一種用根據(jù)權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)所述的多個(gè)陣列進(jìn)行糖基化測定的測定系統(tǒng)，包括用于進(jìn)行所述糖基化測定的試劑盒，通過結(jié)合信號(hào)來檢測所述可檢測的結(jié)合復(fù)合物以獲得結(jié)合數(shù)據(jù)的檢測器，以及測定優(yōu)化模塊，所述測定優(yōu)化模塊用于比較參考數(shù)據(jù)和從樣品糖蛋白獲得的所述結(jié)合數(shù)據(jù)，以通過計(jì)算最佳凝集素活性、測量僅與樣品糖蛋白產(chǎn)生信號(hào)的凝集素、以及通過與基于使用大量樣品類型創(chuàng)建的實(shí)驗(yàn)確定的數(shù)據(jù)庫來定義的計(jì)算的基線相比較而計(jì)算載玻片背景值，來確定合適的測定條件。
22.一種用于進(jìn)行糖基化測定的測定系統(tǒng)(100)，其特征在于，包括 多個(gè)陣列(102)， 測定執(zhí)行模塊(104)，所述多個(gè)陣列(102)連接至所述測定執(zhí)行模塊(104)，或容納在所述測定執(zhí)行模塊(104)中； 檢測器(105)，連接至所述測定執(zhí)行模塊(104)，通過所述檢測器(105)檢測所述糖結(jié)合劑與樣品蛋白的結(jié)合； 測定數(shù)據(jù)分析儀(106)，與所述檢測器(105)通信或連接至所述檢測器(105)； 測定外標(biāo)志模塊(107);連接至所述測定數(shù)據(jù)分析儀(106)或者與所述測定數(shù)據(jù)分析儀(106)通信；以及 測定優(yōu)化模塊(108)，連接至所述測定數(shù)據(jù)分析儀(106)或者與所述測定數(shù)據(jù)分析儀(106)通信； 其中，所述多個(gè)陣列(102)中的每一個(gè)包括 平面基板(10);和 多個(gè)接觸部(10)，所述多個(gè)接觸部(10)存在于所述平面基板(I)的表面上的多個(gè)預(yù)定位置處，在所述多個(gè)接觸部(10)中設(shè)置有多種糖結(jié)合劑，所述多種糖結(jié)合劑設(shè)置在所述平面基板(I)的預(yù)定位置中；所述多種糖結(jié)合劑中的每一種存在于所述表面上的多個(gè)獨(dú)立的預(yù)定位置(10)，其中所述多個(gè)獨(dú)立的預(yù)定位置(10)設(shè)置有在濃度曲線中的多個(gè)濃度的所述糖結(jié)合劑；所述平面基板(I)被設(shè)置成與包括糖蛋白的樣品接觸，使得所述糖蛋白在所述多個(gè)接觸部(10)處與至少一種糖結(jié)合劑特異性結(jié)合并形成可檢測的結(jié)合復(fù)合物，以便根據(jù)所述濃度曲線確定用于非特異性結(jié)合的基線。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的測定系統(tǒng)，其中，所述樣品糖蛋白包括IgG抗體，并且其中所述測定優(yōu)化模塊確定IgG樣品抗體是否具有Fab糖基化或O-連接糖基化，使得實(shí)施特異優(yōu)化條件，并發(fā)出有關(guān)這樣的糖基化存在的警告。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的測定系統(tǒng)，其中，所述測定優(yōu)化模塊確定待施加于所述樣品糖蛋白的暴露溶液的量，其中所述暴露溶液具有用于展開蛋白的本領(lǐng)域已知百分比的去污劑，所述去污劑選自由十二烷基硫酸鈉、膽酸鹽、脫氧膽酸鹽、C16TAB、LysoPC, CHAPS、兩性表面活性劑、辛基糖苷、洋地黃皂苷、蘆布若爾、C12E8、曲拉通X-100、諾乃P-40、和吐溫-80組成的組。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的測定系統(tǒng)，其中，所述測定優(yōu)化模塊確定涉及以下中的一個(gè)或多個(gè)的條件矩陣優(yōu)化暴露溶液濃度0. 001%至1%，優(yōu)化溫度50-80°C，預(yù)處理溫育的優(yōu)化時(shí)間1分鐘至I小時(shí)。
26.根據(jù)權(quán)利要求21或22或23-25中任一項(xiàng)所述的測定系統(tǒng)，進(jìn)一步包括至少一個(gè)質(zhì)量控制監(jiān)測，其選自由通過前景均一性、背景均一性、平均中位密度間的相似性、飽和水平的斑點(diǎn)評(píng)估；根據(jù)陣列的背景、對照斑點(diǎn)、陣列內(nèi)重現(xiàn)性對整個(gè)平面基板的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估的陣列驗(yàn)證；樣品和校正位置之間的歸一化的評(píng)估；整個(gè)陣列信號(hào)的確定組成的組。
27.根據(jù)權(quán)利要求21或22或23-25中任一項(xiàng)所述的測定系統(tǒng)，進(jìn)一步包括作為校正樣品而應(yīng)用于多個(gè)包含所述糖結(jié)合劑的預(yù)定位置的校正蛋白，以根據(jù)黃金指紋標(biāo)準(zhǔn)，通過所述測定優(yōu)化模塊來校正糖結(jié)合劑的反應(yīng)性。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的測定系統(tǒng)，其中，所述測定優(yōu)化模塊根據(jù)所述測定外標(biāo)志發(fā)出警告。
29.根據(jù)權(quán)利要求2所述的陣列，其中，所述接觸部(10)選自圓形、橢圓形、方形的凹槽、凹陷或孔。
30.根據(jù)權(quán)利要求22所述的測定系統(tǒng)，其中，所述接觸部(10)選自圓形、橢圓形、方形的凹槽、凹陷或孔。
31.根據(jù)權(quán)利要求22所述的測定系統(tǒng)，其中，所述陣列(102)插入或提供至所述測定執(zhí)行模塊(104)。
32.根據(jù)權(quán)利要求22所述的測定系統(tǒng)，其中，所述檢測器(105)與所述測定執(zhí)行模塊(104)組合或與所述測定執(zhí)行模塊(104)分開。
33.根據(jù)權(quán)利要求22所述的測定系統(tǒng)，其中，所述檢測器(105)與所述測定數(shù)據(jù)分析儀(106)組合或與所述測定數(shù)據(jù)分析儀(106)分開。
34.根據(jù)權(quán)利要求22所述的測定系統(tǒng)，其中，所述測定優(yōu)化模塊(108)包括數(shù)據(jù)庫，所述數(shù)據(jù)庫包含與感興趣的蛋白在不同實(shí)驗(yàn)條件下測定的結(jié)合有關(guān)的數(shù)據(jù)。
35.根據(jù)權(quán)利要求22所述的測定系統(tǒng)，其中，所述測定優(yōu)化模塊(108)接收包含其它特定類型蛋白的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果的文件。
專利摘要本申請?zhí)峁┮环N改進(jìn)的糖基化檢測法、糖分析陣列和測定系統(tǒng)。該糖分析陣列(102)包括平面基板(1)；和多個(gè)接觸部(10)，多個(gè)接觸部存在于平面基板(1)的表面上的多個(gè)預(yù)定位置處，在多個(gè)接觸部(10)中設(shè)置有多種糖結(jié)合劑，多種糖結(jié)合劑在平面基板(1)的預(yù)定位置中起糖類和聚糖檢測器和結(jié)合劑的作用；多種糖結(jié)合劑中的每一種存在于表面上的多個(gè)獨(dú)立的預(yù)定位置(10)，其中多個(gè)獨(dú)立的預(yù)定位置(10)設(shè)置有在濃度曲線中的多個(gè)濃度的糖結(jié)合劑；平面基板(1)被設(shè)置成與包括糖蛋白的樣品接觸，使得糖蛋白在多個(gè)接觸部(10)處與至少一種糖結(jié)合劑特異性結(jié)合并形成可檢測的結(jié)合復(fù)合物，以便根據(jù)濃度曲線確定用于非特異性結(jié)合的基線。
文檔編號(hào)G01N33/68GK202471720SQ20112033992
公開日2012年10月3日 申請日期2011年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月9日
發(fā)明者戴維·達(dá)布什, 查南·希梅爾法布, 約瑟夫·柯亨, 耶胡迪特·阿莫爾, 耶薩亞胡·亞基爾, 艾拉納·貝爾澤爾, 艾里斯·利德爾, 阿爾貝納·薩莫科夫利斯基 申請人:普若康尼(以色列)有限公司