專利名稱：一種梳式斑點酶聯(lián)免疫多項病毒檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及一種固相酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，具體涉及一種檢測非人靈長類實驗動物多項病毒的梳式斑點固相酶聯(lián)多項病毒檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
靈長類實驗動物是研究病毒感染性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及腫瘤等疾病和新藥研發(fā)所必需的重要動物模型。隨著研究的深入，對靈長類實驗動物的需求量及其品質(zhì)的要求也不斷提高。我國科技部已經(jīng)制定實驗猴健康標(biāo)準(zhǔn)，明確要求普通級動物必須是B病毒陰性，SPF級動物必須是B病毒、包括STLV、SIV、SRV在內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄病毒等陰性，但因為缺乏可靠 的檢測方法，靈長類實驗動物健康檢測遠(yuǎn)遠(yuǎn)跟不上行業(yè)發(fā)展的需要，因此，提供一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測速度快、效率高的猴病毒檢測方法已成為必然的需求?，F(xiàn)有的檢測方法主要是玻片法和ELISA方法，該兩種方法一次只能檢測出一種病毒，操作繁瑣，檢測的速度慢、效率低。
發(fā)明內(nèi)容為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本實用新型的目的在于提供一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測速度快、效率高的梳式斑點酶聯(lián)免疫多項病毒檢測試劑盒。為達(dá)到上述目的，本實用新型是通過以下的技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種梳式斑點酶聯(lián)免疫多項病毒檢測試劑盒，其特征在于，包括抗原梳、與抗原梳相匹配的深孔板和塑料平皿、所述抗原梳的一端部設(shè)置有多個平行的梳齒，所述的梳齒上貼附有按順序預(yù)點了若干項病毒抗原的硝酸纖維膜。其中,所述的梳齒為12條,且所述的深孔板為lml96孔,深孔板每排具有12個孔，與12條梳齒一一對應(yīng)，而所述的梳齒的長度與深孔板的深度相配合。此外，所述的抗原梳的材質(zhì)為PVC板。所述的塑料平皿的尺寸為12cm*12cm。而所述的硝酸纖維膜上預(yù)點的抗原為實驗猴易感的B病毒(BV)、猴T細(xì)胞趨向性病毒I型(STLV-I)和猴逆轉(zhuǎn)錄D型病毒(SRV1，2，5)、麻疹病毒、埃博拉病毒、猴痘病毒、狂犬病毒、猴病毒40及猴泡沫病毒等多種病毒中的至少一種。此外，還包括一臺用于將染色后的抗原梳成像的成像儀。而通過成像儀將染色后的抗原梳拍成照片，再經(jīng)過軟件的處理和分析，可以對結(jié)果做定量分析。上述抗原梳使用硝酸纖維膜作為病毒抗原的載體，將所需檢測的病毒抗原按順序點布在硝酸纖維膜上，將該硝酸纖維膜貼于PVC板材制成的梳齒上。將梳齒置于加了待檢樣本的稀釋液中，樣本中相關(guān)的病毒抗體和硝酸纖維膜上相應(yīng)的抗原發(fā)生特異性結(jié)合，然后加入酶標(biāo)二抗，形成抗原-抗體-酶復(fù)合物，最后加入顯色劑顯色一定時間后終止反應(yīng)，通過所述一系列的反應(yīng)使得相應(yīng)的抗原點呈現(xiàn)肉眼可見的斑點，達(dá)到定性檢測病毒的目的。[0012]本實用新型的有益效果是本實 用新型提供的檢測試劑盒，可在兩小時內(nèi)，一次性同時檢測出多種病毒抗體，實現(xiàn)了多種病毒同步檢測，減少了每個標(biāo)本的采樣量。一把抗原梳可以同時檢測12份樣本，一次實驗可以同時操作多把抗原梳，大大提高了檢測的速度和效率。使用硝酸纖維膜作為固相載體，可以增加抗原吸附量，提高了免疫反應(yīng)的效率和敏感性，而且可批量加工，且易于保存，穩(wěn)定性及重復(fù)性好，結(jié)果可靠，檢測過程不需要特殊儀器設(shè)備，結(jié)果可以肉眼觀察，并能長期保存，適合養(yǎng)殖場或基層單位使用。

圖I為本實用新型所述的抗原梳的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本實用新型所述的與圖I所示的抗原梳相匹配的深孔板的俯視圖。
具體實施方式
以下結(jié)合附圖和具體實施例對本實用新型作具體的介紹。圖I為本實用新型所述的抗原梳的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本實用新型所述與圖I所示的抗原梳相匹配的深孔板的俯視圖。如圖I和圖2所示梳式斑點酶聯(lián)免疫多項病毒檢測試劑盒，包括抗原梳I、與抗原梳I相匹配的Iml96孔深孔板2和12cm*12cm的塑料平皿(圖中未示出)，所述抗原梳I的材質(zhì)為PVC板，其上貼附有按順序預(yù)點了若干抗原的硝酸纖維膜3。所述抗原梳I有12個梳齒，以及所述的Iml深孔板每排有與所述的梳齒對應(yīng)個數(shù)的12個孔，共八排，梳齒的長度與深孔板的深度相配合，保證深孔板里面的液體能將抗原梳I的梳齒浸沒。而本實用新型還可以額外配備一臺成像儀，通過成像儀將染色后的抗原梳拍成照片，再經(jīng)過軟件的處理和分析，可以對結(jié)果做定量分析。此外，所述的硝酸纖維膜上所預(yù)點的抗原為猴血清中B病毒(BV)、猴T細(xì)胞趨向性病毒I型(STLV-I)和猴逆轉(zhuǎn)錄D型病毒(SRV1，2，5)、麻疹病毒、埃博拉病毒、猴痘病毒、狂犬病毒、猴病毒40及猴泡沫病毒等多種病毒中的至少一種病毒。而將梳齒置于加了待檢樣本的稀釋液中，即插入到深孔板2的孔中，樣本中相關(guān)的病毒抗體和硝酸纖維膜3上相應(yīng)的抗原發(fā)生特異性結(jié)合，然后加入酶標(biāo)二抗，形成抗原-抗體-酶復(fù)合物，最后加入顯色劑顯色一定時間后終止反應(yīng)，通過所述一系列的反應(yīng)使得相應(yīng)的抗原點呈現(xiàn)肉眼可見的斑點，達(dá)到定性檢測病毒的目的。梳式斑點多項病毒檢測試劑盒對病毒抗原的定性檢測。I.梳式斑點多項病毒檢測試劑盒內(nèi)的材料及試劑(I) 12*12cm 塑料平皿；(2)96 孔 Iml 深孔板；(3)將所需檢測的病毒抗原按矩陣點于硝酸纖維膜上，具體為如圖I所示圖中每個梳齒上點有九個點，第一和第九個標(biāo)記點(顏色實際為紫色)為用于定位的甲基紫點33，位于兩者之間的點為病毒的抗原點32及其對照細(xì)胞31 ；(4)然后將上述硝酸纖維膜貼于0. 2mm厚原帶膠的PVC板上,再切為長4cm、寬6mm的梳齒，將沒有抗原的一端夾在兩塊厚0. 4mm原帶膠的長12cm、寬Icm的PVC板之間，就制成了抗原梳1，4°C干燥保存。(5)堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗猴IgG 二抗購自KPL ；(6)快紅購自 Sigma ;(7)萘酹購自 Sigma ;(8)配Ix磷酸鹽緩沖液(PBS，0. 01 M, pH 7. 2 7. 4)，室溫保存；(9)在1000 ml PBS中加入I ml 100%吐溫，充分混勻，得0. 1%PBST洗滌液，室溫保存；(10)取適量BSA粉末，加入Ix PBS配成含1%BSA的樣本稀釋液，4°C保存； (11)配 Tris 緩沖液(0. 2 M, pH 8. 0)，室溫保存；(12)配0. 1% EDTA反應(yīng)終止液，室溫保存；2.操作步驟(I)將抗原梳I從冰箱拿出，平衡20-30分鐘至室溫。(2)將待檢血清樣本按照I :100的比例用1%BSA稀釋于Iml深孔板中。(3)將稀釋好的血清震蕩混勻，再將抗原梳I插入Iml深孔板2的樣本稀釋液中，室溫反應(yīng)30分鐘。(4)孵育結(jié)束后，取出抗原梳1，置于加入洗滌液的12*12cm塑料平皿中，置于搖床上中速搖動，每個塑料平皿可放置1-3把梳子，洗滌5遍，每遍I分鐘。(5)將堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗(羊抗猴IgG)按所需濃度稀釋混勻后加入平皿中，置室溫(20-25 °C)孵育30分鐘。(7)倒出二抗溶液，加入洗滌液，在搖床上中速搖動。洗滌5遍，每遍I分鐘。(8)稱取30 mg快紅溶于10 ml Ix Tris緩沖液中，4mg萘酚溶于10 ml超純?nèi)ルx子水(或蒸餾水)。將顯色液混勻后加入塑料平皿中，染色5分鐘。將抗原梳轉(zhuǎn)移至含20ml終止液的塑料平皿中，反應(yīng)I分鐘，然后用水沖洗抗原梳I片刻，置于空氣中自然晾干，最后判讀結(jié)果。染色后，病毒抗體陽性的點呈紅色(可視點)，病毒抗體陰性的抗原點無著色。3.結(jié)果判定，可以選用3. I和/或3. 2所述方式進(jìn)行判讀。3. I肉眼判讀陽性⑵若對照細(xì)胞點無色或顏色很淡，但病毒抗原點顏色達(dá)試劑盒中提供的陽性對照點深度或更深，則判為陽性；陰性(N):若病毒抗原點無色，或顏色很淺且與相應(yīng)對照細(xì)胞點接近，判為陰性。3. 2對檢測結(jié)果做定量分析。取獲得的帶有免疫斑點的抗原梳I,通過成像儀將免疫梳I成像,再用Image J軟件進(jìn)行處理和分析。即可對所檢測的病毒抗體做定量分析。本實用新型提供的檢測試劑盒，可在兩小時內(nèi)，一次性同時檢測出B病毒、STLV、SIV、SRV、麻疹病毒、埃博拉病毒、猴痘病毒、狂犬病毒、猴病毒40及猴泡沫病毒等多種病毒抗體中的任意數(shù)種，實現(xiàn)了多種病毒同步檢測，減少了每個標(biāo)本的采樣量。一把抗原梳I可以同時檢測12份樣本，一次實驗可以同時檢測多把抗原梳，大大提高了檢測的速度和效率。預(yù)點了若干病毒抗原的硝酸纖維膜可批量加工，且易于保存，穩(wěn)定性及重復(fù)性好，結(jié)果可靠。上述實施例不以任何形式限制本實用新型，凡采用等同替換或等效變換的方式所獲得的技術(shù)方案，均落在本實用新型的保 護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求1.一種梳式斑點酶聯(lián)免疫多項病毒檢測試劑盒，其特征在于，包括抗原梳、與抗原梳相匹配的深孔板和塑料平皿、所述抗原梳的一端部設(shè)置有多個平行的梳齒，所述的梳齒上貼附有按順序預(yù)點了若干項病毒抗原的硝酸纖維膜。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種梳式斑點酶聯(lián)免疫多項病毒檢測試劑盒，其特征在于，所述的梳齒為12條。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的一種梳式斑點酶聯(lián)免疫多項病毒檢測試劑盒，其特征在于，所述的抗原梳的材質(zhì)為PVC板。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種梳式斑點酶聯(lián)免疫多項病毒檢測試劑盒，其特征在于，所述的深孔板為lml96孔，且深孔板每排具有12個孔，而所述的梳齒的長度與深孔板的深度相配合。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種梳式斑點酶聯(lián)免疫多項病毒檢測試劑盒，其特征在于，所述的塑料平皿的尺寸為12cm*12cm。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種梳式斑點酶聯(lián)免疫多項病毒檢測試劑盒，其特征在于所述的硝酸纖維膜上預(yù)點的抗原為實驗猴易感的B病毒、猴T細(xì)胞趨向性病毒I型和猴逆轉(zhuǎn)錄D型病毒、麻疹病毒、埃博拉病毒、猴痘病毒、狂犬病毒、猴病毒40及猴泡沫病毒中的至少一種病毒抗原。
7.根據(jù)權(quán)利要求I或2任一權(quán)利要求所述的一種梳式斑點酶聯(lián)免疫多項病毒檢測試劑盒，其特征在于還包括一臺用于將染色后的抗原梳成像的成像儀。
專利摘要本實用新型公開了一種梳式斑點酶聯(lián)免疫多項病毒檢測試劑盒，其特征在于，包括抗原梳、與抗原梳相匹配的深孔板和塑料平皿、所述抗原梳設(shè)置有多個平行的梳齒，所述的梳齒上貼附有按順序預(yù)點了若干項病毒抗原的硝酸纖維膜。本實用新型提供的檢測試劑盒，可在兩小時內(nèi)，一次性同時檢測出多種病毒抗體，實現(xiàn)了多種病毒同步檢測，減少了每個標(biāo)本的采樣量。一把抗原梳可以同時檢測12份樣本，一次實驗可以同時操作多把抗原梳，大大提高了檢測的速度和效率。使用硝酸纖維膜作為固相載體，可以增加抗原吸附量，提高了免疫反應(yīng)的效率和敏感性，而且可批量加工，且易于保存，穩(wěn)定性及重復(fù)性好，結(jié)果可靠。
文檔編號G01N33/543GK202393769SQ201120511078
公開日2012年8月22日 申請日期2011年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月9日
發(fā)明者時長軍 申請人:蘇州西山生物技術(shù)有限公司