專利名稱：熒光檢測裝置和熒光檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對測量對象物受激光照射時發(fā)出的熒光進行測量的熒光檢測裝置和熒光檢測方法。
背景技術(shù)：
公知有如下的熒光檢測裝置向測量對象物照射激光，并接收測量對象物發(fā)出的熒光，由此獲得測量對象物的信息。在利用熒光檢測裝置的流式細胞儀中，在鞘液中使由熒光試劑標簽化的細胞、DNA、RNA、酶、蛋白等的測量對象物流動。通過向該測量對象物照射激光，附著在測量對象物的熒光色素發(fā)出熒光。流式細胞儀通過測量該熒光，由此能夠獲得測量對象物的信息。
另外，公知有通過接收測量對象物受激光照射后發(fā)出的熒光來獲得熒光弛豫時間常數(shù)的熒光檢測裝置(專利文獻I)。專利文獻I :特開2007-101397號公報

發(fā)明內(nèi)容
接收測量對象物發(fā)出的熒光的熒光檢測裝置對測量對象物受激光照射時發(fā)出的熒光進行測量時，在所測量的熒光數(shù)據(jù)中有一定程度的分散。為了精度更高地測量熒光弛豫時間等，要求一種能夠降低所測量的熒光數(shù)據(jù)的分散的熒光檢測裝置。本發(fā)明的目的在于提供ー種熒光檢測裝置和熒光檢測方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，能夠提高測量對象物受激光照射時發(fā)出的熒光的測量精度。本發(fā)明的熒光檢測裝置對測量對象物受激光照射時發(fā)出的熒光進行測量，其特征在于，包括激光光源，向所述測量對象物照射激光；第一受光部，接收所述測量對象物受激光照射時的散射光；第二受光部，接收所述測量對象物受激光照射時的熒光；信號處理部，對應(yīng)第一受光部所接收的所述散射光強度，對第二受光部所接收的所述熒光信號進行加權(quán)處理。另外，優(yōu)選的是，所述信號處理部根據(jù)對所述激光強度進行調(diào)制的調(diào)制信號和第ニ受光部接收的所述熒光信號之間的相位差求出熒光壽命。另外，優(yōu)選的是，所述信號處理部將第一受光部所接收的所述散射光強度進行標準化，并將被標準化的所述散射光的強度與第二受光部接收的所述熒光信號相乗。本發(fā)明的熒光檢測方法對測量對象物受激光照射時發(fā)出的熒光進行測量，其特征在于，包括如下エ序向所述測量對象物照射激光的エ序；第一受光エ序，接收所述測量對象物受激光照射時的散射光；第二受光エ序，接收所述測量對象物受激光照射時的熒光；信號處理工序，相應(yīng)第一受光エ序中所接收的所述散射光強度，對第二受光エ序中所接收的所述熒光信號進行加權(quán)處理。另外，優(yōu)選的是，所述信號處理工序根據(jù)對所述激光強度進行調(diào)制的調(diào)制信號和在第二受光エ序中所接收的所述熒光信號之間的相位差求出熒光壽命。
另外，優(yōu)選的是，所述信號處理工序包括將第一受光エ序中所接收的所述散射光強隊進行標準化的標準化工序，并將在所述標準化工序中被標準化的所述散射光強度與第ニ受光エ序中所接收的所述熒光信號相乗。本發(fā)明的熒光檢測裝置和熒光檢測方法與現(xiàn)有技術(shù)相比能夠提高測量對象物受激光照射時發(fā)出的熒光的測量精度。


圖I為表示本實施方式的流式細胞儀的一例的概略構(gòu)成圖；圖2為表示圖I所示的控制部的一例的圖； 圖3為表不圖I所不的信號處理部的一例的圖；圖4 Ca)為表不參照信號的時間變化的一例的圖，圖4 (b)為表不突光信號的時間變化的一例的圖；圖5 (a) (c)為表示測量對象物通過激光照射區(qū)域的樣子的圖；圖6為表示前向散射光強度的時間變化的一例的圖；圖7 (a)為表不突光信號的cos成分的一例的圖，圖7 (b)為表不突光信號的sin成分的一例的圖；圖8 (a)為表示乘以被標準化的前向散射光強度的熒光信號的cos成分的一例的圖，圖8(b)為乘以被標準化的前向散射光強度的熒光信號的sin成分一例的圖；圖9為表不相對于的參照信號的突光信號的相位差的圖；圖10為表示比較例的信號處理部的一例的圖；圖11為表示在比較例中相對于參照信號的熒光信號的相位差的圖。附圖標記說明10 :流動池12 :細胞14 :熒光色素16 :容器20 :激光光源30 :第一受光部32 :第二受光部40 :控制部42 :振蕩器44 :功率分配器46、48 :放大器50 :信號處理部52: IQ 混頻器54 :放大器56 :低通濾波器58 A/D 轉(zhuǎn)換器60 :運算部
70 :輸出部
具體實施例方式以下，根據(jù)實施方式說明適用了本發(fā)明的熒光檢測裝置和熒光檢測方法的流式細胞儀。<實施方式>(流式細胞儀的構(gòu)成)首先，參照圖I說明本實施方式的流式細胞儀的構(gòu)成。圖I為表示本實施方式的流式細胞儀的一例的概略構(gòu)成圖。流式細胞儀通過接收測量對象物受激光照射后發(fā)出的熒光來能夠獲得測量對象物的信息。如圖I所示，本實施方式的流式細胞儀包括流動池10、激光光源20、第一受光部30、第二受光部32、控制部40、信號處理部50、輸出部70。下面，詳細說明各構(gòu)成。
細胞12等的測量對象物被鞘液包圍而在流動池10的內(nèi)部流動。如后述，激光光源20向測量對象物照射激光，此時為了從所發(fā)出的熒光獲得測量對象物信息，在細胞12上事先附著有熒光色素14。熒光色素14例如使用CFP (藍綠色熒光蛋白，Cyan FluorescentProtein)、YFP (黃色突光蛋白，Yellow Fluorescent Protein)等。在流動池 10 內(nèi)部,被鞘液包圍的測量對象物受流體動力學(xué)性聚焦，由此成為細細的液流而在流動池10內(nèi)流動。激光光源20向測量對象物照射以規(guī)定頻率進行強度調(diào)制的激光。激光光源20例如可以使用半導(dǎo)體激光器。激光的輸出例如為5 100mW。激光的波長例如為350nnT800nm。激光光源20照射的激光強度通過從后述的控制部40輸出的調(diào)制信號進行調(diào)制。第一受光部30以流動池10中激光照射的位置作為基準配置在激光光源20的相反側(cè)上。第一受光部30接收測量對象物受激光照射時產(chǎn)生的前向散射光。第一受光部30包括例如光電ニ極管等光電轉(zhuǎn)換器。第一受光部30將所接收的前向散射光轉(zhuǎn)換成電信號。通過第一受光部30轉(zhuǎn)換的電信號輸出給信號處理部50，用作通知測量對象物正通過流動池10中激光照射的位置的時間的觸發(fā)信號。第二受光部32以流動池10中激光照射的位置作為基準配置在與從激光光源20照射激光的方向和在流動池10中測量對象物流動的方向相互垂直的方向上。第二受光部32接收測量對象物受激光照射時發(fā)出的熒光。第二受光部32包括例如光電倍增管等光電轉(zhuǎn)換器。第二受光部32將所接收的熒光轉(zhuǎn)換成電信號(熒光信號)。通過第二受光部32轉(zhuǎn)換的電信號輸出給信號處理部50，用作通過流動池10中激光照射的位置的測量對象物的信息。接著，關(guān)于控制部40進行說明。控制部40控制激光光源20照射的激光的調(diào)制頻率。在此，參照圖2說明控制部40的構(gòu)成。圖2為表示控制部40的一例的圖。如圖2所示，控制部40包括振蕩器42、功率分配器44、放大器46、48。振蕩器42輸出規(guī)定頻率的正弦波信號。從振蕩器42輸出的正弦波信號用作對從激光光源20輸出的激光進行強度調(diào)制的調(diào)制信號。正弦波信號的頻率例如為f 50MHz。從振蕩器42輸出的規(guī)定頻率的正弦波信號(調(diào)制信號)通過功率分配器44分配給兩個放大器46、48。在放大器46放大的調(diào)制信號輸出給激光光源20。另外,在放大器48放大的調(diào)制信號輸出給信號處理部50。如后述,在放大器48放大的調(diào)制信號輸出給信號處理部50是用作對從第二受光部32輸出的信號進行檢波的參照信號。接著，關(guān)于信號處理部50進行說明。信號處理部50對應(yīng)第一受光部30接收的前向散射光強度，對第二受光部32接收的突光信號進行加權(quán)處理。另外，信號處理部50根據(jù)對激光進行強度調(diào)制的調(diào)制信號和第二受光部32接收的熒光信號之間的相位差求出熒光壽命。在此，參照圖3說明信號處理部50的構(gòu)成。圖3為表示信號處理部50的一例的圖。如圖3所示，信號處理部50包括IQ混頻器52、放大器54、低通濾波器56、A/D轉(zhuǎn)換器58、運算部60。IQ混頻器52接收通過放大器54進行放大的、從第二受光部32輸出的突光信號的輸入。另外，IQ混頻器52接收從控制部40的放大器48輸出的參照信號的輸入。IQ混頻器52通過將突光信號和參照信號相乘,生成包括突光信號的cos成分和高頻成分的信號。另外，IQ混頻器52通過對熒光信號和將參照信號的相位90度位移的信號相乗，生成包括熒光信號的sin成分和高頻成分的信號。根據(jù)該信號能夠求出調(diào)制信號(參 照信號)和熒光信號之間的相位差。通過IQ混頻器52生成的信號的高頻成分通過低通濾波器56被去除。通過低通濾波器56被去除高頻成分的信號通過A/D轉(zhuǎn)換器58轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(后述的cos Θ >sin Θ )。另外，從第一受光部30輸出的前向散射光信號通過A/D轉(zhuǎn)換器58轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號。通過A/D轉(zhuǎn)換器58轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號的信號輸出給運算部60。運算部60對應(yīng)第一受光部30接收的前線散射光強度，對第二受光部32接收的熒光信號進行加權(quán)處理。另外，運算部60將第一受光部30接收的前向散射光強度進行標準化，并將標準化的前向散射光強度與熒光信號相乗。另外，運算部60利用通過A/D轉(zhuǎn)換器58轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號的信號求出熒光壽命。關(guān)于運算部60所進行的詳細的處理在后面所述。運算部60所運算的結(jié)果輸出給輸出部70。返回到圖1，輸出部70輸出通過信號處理部50求出的信息。輸出部70例如為顯示裝置或打印機。輸出部70輸出例如通過信號處理部50求出的熒光壽命。以上為本實施方式的流式細胞儀的概略構(gòu)成。接著，說明信號處理部50進行信號處理的流程。首先，用于調(diào)制激光強度的調(diào)制信號作為參照信號從控制部40輸出給信號處理部50。圖4 (a)表不輸入到信號處理部50的參照信號的時間變化的一例。圖4 (a)所不的例的參照信號為規(guī)定頻率的正弦波信號。另外，第二受光部32接收測量對象物受激光照射時發(fā)出的熒光。圖4 (b)表示從第二受光部32輸出的熒光信號的時間變化的一例。相對于參照信號，熒光信號產(chǎn)生相位差Θ。在此，如果將調(diào)制信號的角頻率用ω表示、測量對象物的熒光壽命用τ表示，則通過以下的式(1)，能夠從相位差Θ求出熒光壽命τ。[數(shù)I]tan θ = ω τ(I)另外，如圖4 (b)所示，熒光信號的振幅并不是規(guī)定的振幅。參照圖5說明熒光信號的振幅變化。圖5為表示細胞12等測量對象物通過流動池10中激光照射區(qū)域的樣子的圖。圖5 (a)為表示測量對象物剛進入激光照射區(qū)域的瞬間的圖。圖5 (b)為表示測量對象物被激光完全照射的瞬間的圖。圖5 (C)為表示測量對象物剛從激光照射區(qū)域出去的瞬間的圖。圖5 (a) (c)的任意瞬間中，測量對象物受激光照射后發(fā)出熒光，但其熒光強度并不是規(guī)定強度的熒光。具體地說，在圖5 (b)的瞬間發(fā)出的熒光強度比在圖5 (a)、(c)的瞬間發(fā)出的熒光強度強。因此，如圖4 (b)所示，熒光信號的振幅隨時間變化。另外，第一受光部30接收測量對象物受激光照射時發(fā)出的前向散射光。圖6表示第一受光部30所接收的前向散射光強度隨時間變化的一例。如果ー個測量對象物通過流動池10中激光照射區(qū)域，則能夠測量一個前向散射光的峰值。前向散射光強度成為最大的瞬間相當于前面所述的圖5 (b)的瞬間。前向散射光信號通過A/D轉(zhuǎn)換器58轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號后輸入到運算部60。另外，如上所述，正弦波信號的頻率例如為f 50MHz。另外，測量對象物通過流動池10中激光照射區(qū)域所需的時間為20 μ秒程度。因此，一個測量對象物通過期間圖4所 示的信號實際上包括2(Γ1000周期程度的信號。在圖4中，為了便于說明，利用比實際低的頻率的信號進行說明。IQ混頻器52通過將圖4 (b)所不的突光信號和圖4 (a)所不的參照信號相乘,生成包括熒光信號的cos成分和高頻成分的信號。圖7 (a)表示之后通過低通濾波器56去除高頻成分的熒光信號的cos成分的一例。另外，IQ混頻器52將圖4 (b)所不的突光信號和圖4 (a)所不的參照信號的相位90度位移的信號相乘，生成包括熒光信號的sin成分和高頻成分的信號。圖7 (b)表示之后通過低通濾波器56去除高頻成分的熒光信號的sin成分一例。本實施方式的運算部60對應(yīng)圖6所示的前向散射光強度對圖7 (a)、(b)所示的熒光信號的COS成分、Sin成分的各信號進行加權(quán)處理。具體地說，運算部60將前線散射光強度進行標準化，以使圖6所示的前向散射光強度的最大值成為1，并將被標準化的前向散射光強度與圖7 (a)、(b)所示的熒光信號的cos成分、sin成分的各信號相乗。圖8 (a)、(b)表示將被標準化的前向散射光強度與圖7 (a)、(b)所示的熒光信號的cos成分、sin成分相乘的結(jié)果。如圖8 (a)、(b)所示，前向散射光強度小的部分的熒光信號的值比圖7
(a)、(b)所示的值小。其原因是，與如圖5 (a)、(c)所示熒光強度弱的瞬間發(fā)出的熒光相比，在如圖5
(b)所示熒光強度強的瞬間發(fā)出的熒光中含有高精度的信息。因此，通過將被標準化的前向散射光強度與COS成分、Sin成分相乘，并利用精度高的信息能夠求出相位差Θ。然后，運算部60計算出圖8 (a)、(b)所示的熒光信號的cos成分、sin成分的各時間平均。被時間平均的熒光信號的COS成分、Sin成分在圖9所示的圖中繪圖。對于ー個測量對象物進行上述的信號處理，由此完成ー個圖9所示的圖的繪圖。運算部60對于多個測量對象物繪圖被時間平均的熒光信號的cos成分、sin成分。另外，運算部60從被時間平均的熒光信號的cos成分、sin成分的多個繪圖求出相對于參照信號的熒光信號的相位差。例如，運算部60從將圖9所示的多個繪圖以通過原點的直線近似化后的直線的斜率，能夠求出相對于參照信號的熒光信號的相位差Θ。如以上的說明，本實施方式的熒光檢測裝置和熒光檢測方法中按照對應(yīng)前向散射光強度對包含精度高的信息的突光信號進行更大的加權(quán)處理的方式對突光信號進行加權(quán)處理。因此，能夠提高測量對象物受激光照射時發(fā)出的熒光的測量精度。
尤其是，本實施方式的熒光檢測裝置和熒光檢測方法中對應(yīng)前向散射光強度對測量對象物的各個熒光信 號進行加權(quán)處理。因此，即使測量對象物的大小是不規(guī)定的大小，但也能夠提高測量對象物受激光照射時發(fā)出的熒光的測量精度。(比較例)下面，為了表示上述的實施方式的效果，對比較例進行說明。本比較例的流式細胞儀的構(gòu)成與上述的實施方式的流式細胞儀大致相同。本比較例的流式細胞儀的信號處理部50的構(gòu)成與實施方式不同。下面，關(guān)于本比較例的信號處理部50進行說明。圖10為表示本比較例的信號處理部50的一例的圖。如圖10所示，本比較例的信號處理部50包括IQ混頻器52、放大器54、低通濾波器56、A/D轉(zhuǎn)換器58、運算部60。IQ混頻器52、放大器54、低通濾波器56、A/D轉(zhuǎn)換器58的構(gòu)成與上述的實施方式相同，因此在此省略說明。在本比較例中，從第一受光部30輸出的前向散射光的信號沒有輸入到信號處理部50,這點與實施方式不同。下面，說明本比較例的信號處理部50的信號處理的流程。如參照圖4 (a)進行的說明，用于對激光強度進行調(diào)節(jié)的調(diào)制信號從控制部40作為參照信號輸出到信號處理部50。另外，如參照圖4 (b)進行說明那樣，第二受光部32接收測量對象物受激光照射時發(fā)出的熒光。IQ混頻器52通過將圖4 (b)所示的熒光信號和圖4 (a)所示的參照信號相乘，生成包括熒光信號的COS成分和高頻成分的信號。然后，如參照圖7 (a)進行說明那樣，獲得通過低通濾波器56去除高頻成分的熒光信號的cos成分。另外，IQ混頻器52通過將圖4 (b)所示的熒光信號和圖4 (a)所示的參照信號的相位90度位移的信號相乘，生成包括熒光信號的sin成分和高頻成分的信號。然后，如參照圖7 (b)進行說明那樣，獲得通過低通濾波器56去除高頻成分的熒光信號的sin成分。本比較例的運算部60計算出圖7 (a)、(b)所示的突光信號的cos成分、sin成分的各個時間平均。被時間平均的熒光信號的cos成分、sin成分在如圖11所示的圖中繪圖。另外，運算部60從被時間平均的熒光信號的cos成分、sin成分的多個繪圖求出相對于參照信號的熒光信號的相位差。將從上述的實施方式得到的圖9和從比較例得到的圖11相比較，結(jié)果可知實施方式的繪圖比比較例的繪圖分散小。例如，從圖9所示的繪圖的相位差Θ的分散求出的標準偏差為O. 71[rad]，相對于該相位差從圖11所示的繪圖的相位差Θ的分散求出的標準偏差為O. 79[rad]。這是由于實施方式的熒光檢測裝置和熒光檢測方法中按照對應(yīng)前向散射光強度對包含精度高的信息的突光信號進行更大的加權(quán)處理的方式對突光信號進行加權(quán)處理。因此，根據(jù)實施方式的熒光檢測裝置和熒光檢測方法，能夠以更高的精度測量熒光壽命O以上，關(guān)于本發(fā)明的熒光檢測裝置和熒光檢測方法進行了詳細的說明，但本發(fā)明并不局限于所述實施方式。另外，不脫離本發(fā)明主要內(nèi)容的范圍內(nèi)，可以進行多種改進或變更。
權(quán)利要求
1.一種熒光檢測裝置，對測量對象物受激光照射時發(fā)出的熒光進行測量，其特征在于，包括 激光光源，向所述測量對象物照射激光； 第一受光部，接收所述測量對象物受激光照射時的散射光； 第二受光部，接收所述測量對象物受激光照射時的熒光； 信號處理部，對應(yīng)第一受光部所接收的所述散射光強度，對第二受光部所接收的所述突光信號進行加權(quán)處理。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的熒光檢測裝置，其特征在于，所述信號處理部根據(jù)對所述激光強度進行調(diào)制的調(diào)制信號和第二受光部接收的所述熒光信號之間的相位差求出熒光壽命。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的熒光檢測裝置，其特征在于，所述信號處理部將第一受光部所接收的所述散射光強度進行標準化，并將被標準化的所述散射光的強度與第二受光部接收的所述熒光信號相乘。
4.一種熒光檢測方法，對測量對象物受激光照射時發(fā)出的熒光進行測量，其特征在于，包括如下工序 向所述測量對象物照射激光的工序； 第一受光工序，接收所述測量對象物受激光照射時的散射光； 第二受光工序，接收所述測量對象物受激光照射時的熒光； 信號處理工序，對應(yīng)第一受光工序中所接收的所述散射光強度，對第二受光工序中所接收的所述熒光信號進行加權(quán)處理。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的熒光檢測方法，其特征在于，所述信號處理工序根據(jù)對所述激光強度進行調(diào)制的調(diào)制信號和在第二受光工序中所接收的所述熒光信號之間的相位差求出熒光壽命。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的熒光檢測方法，其特征在于，所述信號處理工序包括將第一受光工序中所接收的所述散射光強隊進行標準化的標準化工序，并將在所述標準化工序中被標準化的所述散射光強度與第二受光工序中所接收的所述熒光信號相乘。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種熒光檢測裝置和熒光檢測方法。熒光檢測裝置能夠提高測量對象物受激光照射時發(fā)出的熒光的測量精度。該熒光檢測裝置對測量對象物受激光照射時發(fā)出的熒光進行測量，包括激光光源，向測量對象物照射激光；第一受光部，接收測量對象物受激光照射時的散射光；第二受光部，接收測量對象物受激光照射時的熒光；信號處理部，對應(yīng)第一受光部所接收的所述散射光強度，對第二受光部所接收的所述熒光信號進行加權(quán)平均。
文檔編號G01N21/64GK102713575SQ201180005789
公開日2012年10月3日 申請日期2011年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月15日
發(fā)明者中田成幸, 星島一輝 申請人:三井造船株式會社