專利名稱：食道癌標(biāo)志物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以SLC38A4(別名SANT4)蛋白質(zhì)的表達(dá)為指標(biāo)的食道癌的檢查方法，包含抗SLC38A4蛋白質(zhì)抗體的食道癌檢測(cè)用組合物，該食道癌檢測(cè)用組合物的制造方法，包含抗SLC38A4蛋白質(zhì)抗體的食道癌檢測(cè)用試劑盒，以及利用SLC38A4蛋白質(zhì)的食道癌治療藥的篩選方法。
背景技術(shù)：
食道癌是發(fā)生于食道的上皮性來源的腫瘤。在組織學(xué)上主要分類為食道粘膜上皮癌變的鱗狀上皮細(xì)胞癌和食道腺癌變的腺癌。在日本，鱗狀上皮細(xì)胞癌占食道癌整體的90%，余下的5%為腺癌。從此可知，日本人的食道癌基本是鱗狀上皮細(xì)胞癌。而且，多發(fā)于 60多歲的男性，男女比為3 5:1。因?yàn)樽鳛槭车佬螒B(tài)學(xué)上的特征沒有外膜(漿膜)，增殖的癌細(xì)胞容易向周圍浸潤(rùn)，也容易轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)，所以癌變的進(jìn)展快。加上由于缺乏主觀癥狀，因而早期發(fā)現(xiàn)容易延遲。食道癌的預(yù)后在包括胃癌、大腸癌在內(nèi)的消化系統(tǒng)癌中極差，食道癌整體的5年存活率為14%左右。雖然致癌因子不明，但禁煙可降低食道鱗狀上皮細(xì)胞癌的發(fā)病率，由此啟示吸煙和食道鱗狀上皮細(xì)胞癌有關(guān)聯(lián)。食道癌的診斷利用體檢發(fā)現(xiàn)、影像學(xué)診斷、以及腫瘤標(biāo)志物。體檢發(fā)現(xiàn)在早期癌中幾乎不存在。在晚期癌中有時(shí)發(fā)現(xiàn)右側(cè)或者左側(cè)鎖骨上部的淋巴結(jié)腫大。在被確診為食道癌后的患者中，74%在確診時(shí)刻有包括食道不舒服在內(nèi)的吞咽困難，14%有吞咽疼痛。在影像學(xué)診斷中，可以利用硫酸鋇X射線拍照來簡(jiǎn)便地觀察食道的變窄和/或變形。但是，這種檢查方法難以檢測(cè)早期癌。在早期癌的發(fā)現(xiàn)中最有用的是內(nèi)鏡。然而，在通常的內(nèi)鏡觀察中也常常難以發(fā)現(xiàn)停留在粘膜面上的淺表癌。為此，利用盧戈溶液(Lugolsolution)來進(jìn)行染色(色素內(nèi)鏡檢查)。盧戈溶液將正常的粘膜鱗狀上皮中富含的糖原染色。如果由于粘膜的癌化以及非典型上皮化而糖原量顯著減少，則病變部位不被盧戈溶液染色而形成白色的不染色帶。但是盧戈溶液不染色帶不是對(duì)癌特異性的，在食道炎、萎縮部位也呈陽性。還可使用碘藍(lán)染色，這種情況下，正常粘膜形成不染色帶而癌病變被染成藍(lán)色。在該染色中，癌病變露出表面是不可缺少的條件，皮內(nèi)癌則不顯陽性。無論哪種情況，利用與內(nèi)鏡相結(jié)合進(jìn)行的活體檢查的病理學(xué)診斷成為食道癌的確診。在確定為食道癌的情況下，為了判斷其浸潤(rùn)深度(進(jìn)展期)，實(shí)施超聲波內(nèi)鏡檢查和/或CT (計(jì)算機(jī)斷層成像)。從而可以檢測(cè)出有沒有向食道癌的周圍組織的浸潤(rùn)和/或向淋巴結(jié)、遠(yuǎn)端器官的轉(zhuǎn)移，從而診斷食道癌的進(jìn)展期。PET檢查被認(rèn)為對(duì)難以利用CT判斷的轉(zhuǎn)移灶的評(píng)價(jià)是有用的。對(duì)于利用腫瘤標(biāo)志物的診斷，如上所述，因?yàn)樵谌毡?0%以上的食道癌是鱗狀上皮細(xì)胞癌，所以作為子宮頸、食道的鱗狀上皮細(xì)胞癌的指標(biāo)的SCC(鱗狀上皮細(xì)胞癌相關(guān)抗原)較經(jīng)常被利用。單獨(dú)利用SCC的術(shù)前診斷率是30%左右。作為除SCC以外的腫瘤標(biāo)志物，使用CEA、CYFRA21-1等。但是，在使用這些標(biāo)記物的情況下，隨著癌的進(jìn)展率的發(fā)展而陽性率較高，但在早期癌的情況下診斷率低下。關(guān)于自身抗體，P53抗體雖然具有在比較早期的病例中陽性率較高的特征，但陽性率仍然只有20-30 %左右。
另一方面，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異常表達(dá)增強(qiáng)被指出可以成為癌變的指標(biāo)之一(專利文獻(xiàn)I 3，非專利文獻(xiàn)I)。作為癌變細(xì)胞的特征可列舉顯著的增殖和/或轉(zhuǎn)移，但因?yàn)閷?shí)現(xiàn)這些增殖和/或轉(zhuǎn)移需要大量的營(yíng)養(yǎng)源，所以癌細(xì)胞有時(shí)會(huì)增加葡萄糖、氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)量。例如，已知L型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LATl在人的各種癌組織(前列腺癌、大腸癌、膀胱癌、Barrett食道腺癌、口腔鱗狀上皮細(xì)胞癌、肝癌)中高表達(dá)(非專利文獻(xiàn)2)。然而，包括LATl在內(nèi)至今已報(bào)告的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白都在正常細(xì)胞中少量表達(dá)，很難說是癌特異性的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(非專利文獻(xiàn)3和4)。如上所述，到目前為止，并沒有發(fā)現(xiàn)對(duì)食道癌特異性高的標(biāo)志物或?qū)υ缙谑车腊╋@示高的陽性率的標(biāo)志物。食道癌不僅缺乏主觀癥狀，而且有在發(fā)病后容易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差的特征。因此，需要鑒定對(duì)食道癌特異性高、而且能實(shí)現(xiàn)食道癌的早期發(fā)現(xiàn)的腫瘤標(biāo)志物?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn) 專利文獻(xiàn)I :日本特愿平11-248546號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2 :日本特愿2004-76282號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3 :日本特愿平10-126648號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)國(guó)際公開2008/096416號(hào)小冊(cè)子非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)I: Imai H, et al. Histopathology. 2009 Jun; 54 (7) : 804-13. 非專利文獻(xiàn)2: Kondoh N, et al. Int J Oncol. 2007 Jul; 31 (I) : 81-7.非專利文獻(xiàn)3: del Amo EM, et al. Eur J Pharm Sci. 2008 Oct 2; 35 (3) :161-74.Epub 2008 Jul 5.非專利文獻(xiàn)4:Mackenzie B, Erickson JD. Pflugers Arch. 2004Feb;447 (5):784-95. Epub 2003 Jul 4. Review.非專利文獻(xiàn)5:Sugawara M, et al. Biochim Biophys Acta.2000 Dec20; 1509(1-2) :7-13.非專利文獻(xiàn)6:Hatanaka T, et al. Biochim Biophys Acta. 2001 Feb9; 1510(1-2) :10-7.非專利文獻(xiàn)7: Gu S, et al. Genomics. 2001 Jun 15; 74 (3) :262-72.非專利文獻(xiàn)8: Sundberg BE, et al. J Mol Neurosci. 2008 Jun; 35 (2) : 179-93.Epub 2008 Apr 17.非專利文獻(xiàn)9:Desforges M, et al. J Physiol. 2009 Jan 15; 587 (Pt I) :61-72.Epub 2008 Nov 17.非專利文獻(xiàn)10: Gao H, et al. Biol Reprod. 2009 Jun; 80 (6) : 1196-208. Epub 2009Jan 28.非專利文獻(xiàn)ll:Desforges M，et a I. Am J Physiol CellPhysiol. 2006Jan;290(I):C305-12. Epub 2005 Sep 7.非專利文獻(xiàn)12: Song B, et al. World J Gastroenterol. 2005 Mar14;11(10):1463-72.
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題本發(fā)明是鑒于如上狀況而做出的，其目的是提供對(duì)食道癌特異性高、且能夠?qū)崿F(xiàn)食道癌的早期發(fā)現(xiàn)的腫瘤標(biāo)志物。進(jìn)而本發(fā)明的目的是提供以該腫瘤標(biāo)志物為靶標(biāo)的食道癌(特別優(yōu)選是早期食道癌)的檢查方法，包含用于檢測(cè)該腫瘤標(biāo)志物的分子的食道癌檢測(cè)用組合物，該組合物的制造方法，包含該組合物的食道癌檢測(cè)用試劑盒，以及利用了該腫瘤標(biāo)志物的食道癌治療藥的篩選方法。用于解決課題的方法SLC38A4蛋白質(zhì)(別名SNAT4)屬于鈉離子依賴型的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(非專利文獻(xiàn)4)，其基因首先在2000年從大鼠的肌肉中被克隆化，對(duì)于人在2001年由來源于肝臟的培養(yǎng)細(xì)胞中被克隆化(非專利文獻(xiàn)5 7)。SLC38A4蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上被分類為谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族，但實(shí)際上對(duì)谷氨酰胺的親和性低，其轉(zhuǎn)運(yùn)能力遠(yuǎn)低于其他谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。 另一方面，主要輸送L-丙氨酸和天冬酰胺(非專利文獻(xiàn)4)。關(guān)于SLC38A4在成體內(nèi)的定位，在mRNA水平通過RNA印跡法從大鼠的肌肉和肝臟中檢測(cè)出，在人組織中肝臟含量最高(非專利文獻(xiàn)6 8)。通過RT-PCR法從除肝臟以外的骨骼肌、腦、肺、心臟、小腸、腎臟、胰、胎盤、子宮中擴(kuò)增出基因(非專利文獻(xiàn)9和10)。關(guān)于SLC38A4的蛋白質(zhì)水平的定位信息，通過蛋白質(zhì)印跡法在肝臟和胎盤中檢測(cè)出，通過免疫組織染色在胎盤中檢測(cè)出(非專利文獻(xiàn)9和11)。關(guān)于與癌的關(guān)系，在肝細(xì)胞癌的細(xì)胞株JHH4中確認(rèn)了 mRNA的表達(dá)，但與正常肝臟組織為相同水平，表達(dá)增強(qiáng)沒有在實(shí)驗(yàn)上被確認(rèn)(專利文獻(xiàn)2)。此外，在小鼠中，針對(duì)高轉(zhuǎn)移性的株化肝細(xì)胞癌Hca-F和低轉(zhuǎn)移性肝細(xì)胞癌Hca-P的利用了基因芯片的基因表達(dá)分析的結(jié)果，報(bào)告了 SLC38A4基因在Hca-F中較高表達(dá)，但與肝癌轉(zhuǎn)移的因果關(guān)系不明(非專利文獻(xiàn)12)。這樣，關(guān)于SLC38A4的表達(dá)與食道或食道癌的關(guān)系，至今未知。本發(fā)明者們鑒于上述背景，為了探索癌特異性標(biāo)志物，對(duì)于各種標(biāo)志物候選，進(jìn)行了針對(duì)人癌病理切片和正常組織切片的免疫組織染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在自行開發(fā)的針對(duì)80種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抗原特異性抗體中，針對(duì)SLC38A4蛋白質(zhì)的抗體對(duì)食道癌組織(特別是早期的食道癌組織)特異性且強(qiáng)烈地反應(yīng)。而且，本發(fā)明者們基于SLC38A4蛋白質(zhì)在食道癌中高表達(dá)、在正常組織中幾乎檢測(cè)不到這樣的知識(shí)，發(fā)現(xiàn)可以以SLC38A4蛋白質(zhì)的表達(dá)為指標(biāo)來檢查食道癌，利用抗SLC38A4蛋白質(zhì)抗體的免疫學(xué)方法在食道癌的檢查中是有用的。進(jìn)而，本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)，可以利用SLC38A4蛋白質(zhì)來進(jìn)行食道癌治療藥的篩選。S卩，本發(fā)明涉及以SLC38A4蛋白質(zhì)的表達(dá)為指標(biāo)檢查食道癌(特別優(yōu)選為早期的食道癌)的方法，包含抗SLC38A4蛋白質(zhì)抗體的食道癌檢測(cè)用組合物，該組合物的制造方法，包含抗SLC38A4蛋白質(zhì)抗體的食道癌檢測(cè)用試劑盒，以及利用SLC38A4蛋白質(zhì)的食道癌治療藥的篩選方法。更具體地，本發(fā)明提供以下(I) (14)。(I)食道癌的檢查方法，其中，包括檢測(cè)從被檢體分離出的細(xì)胞或組織中的SLC38A4蛋白質(zhì)的表達(dá)的工序。(2)根據(jù)⑴所述的方法，其中，使用抗體來檢測(cè)SLC38A4蛋白質(zhì)的表達(dá)。(3)根據(jù)⑵所述的方法，其中，抗體是識(shí)別包含SLC38A4蛋白質(zhì)中的序列號(hào)2所記載的氨基酸序列的區(qū)域的抗體。
(4)根據(jù)(I) (3)的任一項(xiàng)所述方法，其中，食道癌是早期的食道癌。(5)食道癌檢測(cè)用組合物，其中，包含抗SLC38A4蛋白質(zhì)抗體。(6)根據(jù)(5)所述的組合物，其中，抗體是識(shí)別包含SLC38A4蛋白質(zhì)中的序列號(hào)2所記載的氨基酸序列的區(qū)域的抗體。(7)根據(jù)(5)或(6)所述的組合物，其中，食道癌是早期的食道癌。(8) (5)所述的組合物的制造方法，其中，包括以下工序(a)免疫SLC38A4蛋白質(zhì)或者其有免疫原性的一部分的工序，以及(b)分離和/或純化與SLC38A4蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體的工序。(9) (6)所述組合物的制造方法，其中，包括以下工序 (a)免疫包含SLC38A4蛋白質(zhì)中的序列號(hào)2所記載的氨基酸序列的肽的工序，以及(b)分離和/或純化與包含SLC38A4蛋白質(zhì)中的序列號(hào)2所記載的氨基酸序列的區(qū)域結(jié)合的抗體的工序。(10)根據(jù)(9)或(10)所述的制造方法，其中，組合物是早期的食道癌的檢測(cè)用組合物。(11)食道癌檢測(cè)用試劑盒，其中，包含(5) (7)所述的組合物。(12)食道癌治療藥的篩選方法，其中，包括以下工序(a)提供SLC38A4蛋白質(zhì)或其一部分的工序，(b)使候選化合物與SLC38A4蛋白質(zhì)或其一部分接觸的工序，以及(c)選擇與SLC38A4蛋白質(zhì)或其一部分結(jié)合的化合物的工序。(13)食道癌治療藥的篩選方法，其中，包括以下工序(a)對(duì)食道癌模型動(dòng)物(除人以外)施與候選化合物或者對(duì)照的工序，(b)采集該模型動(dòng)物的食道部的組織的工序，以及(c)檢測(cè)采集的組織中的SLC38A4蛋白質(zhì)的表達(dá)，與對(duì)照比較，選擇降低SLC38A4蛋白質(zhì)的表達(dá)的化合物的工序。(14)根據(jù)(12)或(13)所述的篩選方法，其中，治療藥是早期的食道癌的治療藥。發(fā)明的效果在本發(fā)明中，判明了 SLC38A4蛋白質(zhì)的表達(dá)在食道癌中特異性地被檢測(cè)出，特別是在處于早期的高分化階段的食道癌中以高陽性率被檢測(cè)出。因此，根據(jù)以SLC38A4蛋白質(zhì)的表達(dá)為指標(biāo)的本發(fā)明的食道癌的檢查方法，可以以高精度早期地檢測(cè)出食道癌。由此，可以在食道癌的進(jìn)展的早期階段進(jìn)行食道癌的治療，可以對(duì)患者的治療和患者的預(yù)后的改善做出較大的貢獻(xiàn)。此外，根據(jù)利用SLC38A4蛋白質(zhì)的本發(fā)明的食道癌治療藥的篩選方法，可以有效地鑒定治療藥候選化合物。包含抗SLC38A4蛋白質(zhì)抗體的本發(fā)明的食道癌檢測(cè)用組合物、食道癌檢測(cè)試劑盒在上述本發(fā)明中的食道癌的檢查、食道癌的治療藥的篩選中極為有用。
圖I是顯示來源于人的SLC38A4蛋白質(zhì)的氨基酸全長(zhǎng)序列和人工合成而用作免疫原的氨基酸序列(方框內(nèi)第29位 第47位)的圖。圖2是顯示將對(duì)兔免疫之后得到的抗血清、抗原親和性純化抗體和正常兔血清的抗體效價(jià)通過抗原固相ELISA進(jìn)行分析而得的結(jié)果的圖。X軸表示抗原濃度(yg/ml)，Y軸表示吸光度(0D450)。圖3是顯示使用強(qiáng)制表達(dá)SLC38A4的細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀評(píng)價(jià)抗SLC38A4蛋白質(zhì)抗體的性能的結(jié)果的圖。X軸表示作為目標(biāo)基因表達(dá)的指標(biāo)的綠色熒光蛋白質(zhì)Azami-Green的突光量。Y軸表示PE標(biāo)記的二抗的反應(yīng)性。
圖4是顯示使用強(qiáng)制表達(dá)SLC38A4的細(xì)胞，通過細(xì)胞免疫染色評(píng)價(jià)抗SLC38A4蛋白質(zhì)抗體的性能的結(jié)果的顯微鏡照片。左圖顯示對(duì)不表達(dá)SLC38A4蛋白質(zhì)的293T細(xì)胞的反應(yīng)性，右圖顯示對(duì)瞬時(shí)表達(dá)SLC38A4蛋白質(zhì)的293T細(xì)胞的反應(yīng)性。圖5是顯示使用食道癌患者樣本，通過免疫組織染色確認(rèn)抗SLC38A4蛋白質(zhì)抗體的染色性的結(jié)果的顯微鏡照片。使用典型的2例。左圖是使用患者的正常部位的結(jié)果，右圖是使用患者的包含癌部的組織的結(jié)果。圖6是顯示使用抗SLC38A4蛋白質(zhì)抗體的食道癌樣本的各等級(jí)的陽性率的圖。圖7是顯示使用WHO病理分類的I級(jí)和I - II級(jí)的食道癌樣本，利用抗SLC38A4蛋白質(zhì)抗體進(jìn)行免疫組織染色的結(jié)果的顯微鏡照片。圖中顯示I級(jí)的典型的4例。圖8是顯示使用WHO病理分類的II級(jí)和II - III級(jí)的食道癌樣本，利用抗SLC38A4蛋白質(zhì)抗體進(jìn)行免疫組織染色的結(jié)果的顯微鏡照片。圖中顯示II級(jí)的典型的4例。圖9是顯示使用WHO病理分類的III級(jí)的食道癌樣本，利用抗SLC38A4蛋白質(zhì)抗體進(jìn)行免疫組織染色的結(jié)果的顯微鏡照片。圖中顯示III級(jí)的典型的4例。圖10是顯示利用抗SLC38A4蛋白質(zhì)抗體的食道癌樣本的各等級(jí)的組織染色的得分的圖。圖11是顯示使用抗SLC38A4蛋白質(zhì)抗體對(duì)除食道癌以外的消化系統(tǒng)癌樣本6例(胃腺癌、大腸腺癌、直腸癌、胰腺癌、肝細(xì)胞癌、腎癌)進(jìn)行免疫組織染色的結(jié)果的顯微鏡照片。圖中顯示各癌樣本的組織染色的典型例。
具體實(shí)施例方式〈食道癌的檢查方法〉本發(fā)明提供食道癌的檢查方法，其中，包括檢測(cè)從被檢體分離出的細(xì)胞或組織中的SLC38A4蛋白質(zhì)的表達(dá)的工序。在本發(fā)明中，“細(xì)胞或組織”是指在本發(fā)明的檢查方法中檢測(cè)SLC38A4蛋白質(zhì)的表達(dá)時(shí)成為樣品(對(duì)象)的細(xì)胞或組織。對(duì)從生物體分離出的狀態(tài)的細(xì)胞或組織應(yīng)用本發(fā)明?！皬谋粰z體分離出”是指通過從生物體摘出細(xì)胞或組織，從而使該細(xì)胞或組織與其來源的生物體完全隔離的狀態(tài)。作為摘出細(xì)胞或組織的被檢體，不限于癌患者，也可以以健常人(包含可能患癌者)為對(duì)象。將在活組織檢查(Biopsy)中采集的、被檢體的臟器和/或組織的一部分供給被發(fā)明的檢查方法。病理組織通常在存在于生物體中的狀態(tài)、即與周圍的細(xì)胞結(jié)合狀態(tài)下(作為組織片)制備，在本發(fā)明的方法中使用，但也可以在將病理組織從周圍的細(xì)胞中分離出之后在本發(fā)明的方法中使用。在以將SLC38A4蛋白質(zhì)的表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果用于食道癌的診斷為目的的情況下，作為病理組織，優(yōu)選使用通過其他診斷法判斷為是癌的組織、判斷為是癌的概率高的組織、或者有可能是癌的組織。所使用的組織優(yōu)選為通過其他診斷法判斷為是癌的組織、或者判斷為是癌的概率高的組織。這里，作為其他診斷法，可列舉例如，使用X射線造影檢查、內(nèi)鏡檢查、超聲波檢查、CT檢查、MRI檢查、PET檢查、腫瘤標(biāo)志物的診斷法等。通常，使用通過以上診斷法中的一種以上而懷疑是癌的組織。在本發(fā)明中，檢測(cè)表達(dá)的“SLC38A4蛋白質(zhì)”典型地是包含序列號(hào)I所記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。但是，蛋白質(zhì)的氨基酸序列可能由于其編碼基因的突變等而在自然界中(即，非人工地)突變。因此，在本發(fā)明中，這樣的SLC38A4蛋白質(zhì)的天然突變體也可以成為檢測(cè)對(duì)象。在本發(fā)明中，“檢測(cè)SLC38A4蛋白質(zhì)的表達(dá)”包含SLC38A4蛋白質(zhì)的表達(dá)的有無的檢測(cè)和表達(dá)程度的檢測(cè)兩方面。SLC38A4蛋白質(zhì)的表達(dá)量可以作為絕對(duì)量或者相對(duì)量來掌握。在掌握相對(duì)量的情況下，例如，可以與準(zhǔn)備的標(biāo)準(zhǔn)樣品的SLC38A4蛋白質(zhì)的表達(dá)量比較來判斷?！皹?biāo)準(zhǔn)樣品”是事先確定了是否表達(dá)SLC38A4蛋白質(zhì)的樣品。例如，可以將已經(jīng)確
定為存在食道癌的部位的病理組織作為本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)樣品。此外，未罹患癌的組織(正常組織)也可以作為本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)樣品。本發(fā)明中的SLC38A4蛋白質(zhì)的表達(dá)的檢測(cè)優(yōu)選通過免疫學(xué)方法來進(jìn)行。作為免疫學(xué)方法，可列舉例如，免疫組織化學(xué)染色法、ELISA法、放射免疫測(cè)定、FCM、免疫沉淀法、免疫印跡等。在免疫學(xué)方法中，使用抗SLC38A4蛋白質(zhì)抗體，使該抗體與SLC38A4蛋白質(zhì)接觸，以該抗體對(duì)SLC38A4蛋白質(zhì)的結(jié)合性(結(jié)合量)為指標(biāo)，檢測(cè)SLC38A4蛋白質(zhì)。這里“接觸”是指在抗SLC38A4蛋白質(zhì)抗體能夠識(shí)別SLC38A4蛋白質(zhì)的生理?xiàng)l件下放置該抗體和SLC38A4蛋白質(zhì)。例如，在使用該抗體進(jìn)行細(xì)胞表面上的SLC38A4蛋白質(zhì)的染色的情況下，是指將從被檢體分離出的細(xì)胞或組織浸潤(rùn)到含有抗體的溶液中，或者將含有抗體的溶液充分滴加或者噴霧到該細(xì)胞或組織中，放置在該抗體能夠識(shí)別存在于細(xì)胞或組織中的SLC38A4的生理?xiàng)l件下。根據(jù)免疫學(xué)檢測(cè)法，可以迅速且靈敏度良好地檢測(cè)，操作也簡(jiǎn)便。本發(fā)明的檢測(cè)方法在對(duì)患者身體的負(fù)擔(dān)小的方面也是有利的。作為本發(fā)明的檢測(cè)方法中使用的抗SLC38A4蛋白質(zhì)抗體，只要具有對(duì)SLC38A4蛋白質(zhì)的特異性結(jié)合即可，對(duì)其種類和/或來源沒有特別限制。優(yōu)選為識(shí)別SLC38A4蛋白質(zhì)(序列號(hào)I)的第29位 第47位的氨基酸序列“GIGNSEKAAMSSQFANEDT” (序列號(hào)2)的抗體。如果作為抗SLC38A4蛋白質(zhì)抗體，使用結(jié)合有標(biāo)記物質(zhì)的抗體，則可以通過檢測(cè)該標(biāo)記而直接測(cè)定與SLC38A4蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體量，是簡(jiǎn)便的。但另一方面，這種方法也存在準(zhǔn)備結(jié)合有標(biāo)記物質(zhì)的抗體麻煩，而且檢測(cè)靈敏度一般較低這樣的問題。因此在本發(fā)明中，優(yōu)選利用結(jié)合有標(biāo)記物質(zhì)的二抗的方法，和/或利用二抗與標(biāo)記物質(zhì)結(jié)合而得的聚合物的方法等間接檢測(cè)方法。這里“二抗”是針對(duì)抗SLC38A4蛋白質(zhì)抗體顯示特異結(jié)合性的抗體。例如，在作為兔抗體來制備抗SLC38A4蛋白質(zhì)抗體的情況下，作為二抗可以使用抗兔IgG抗體。針對(duì)來源于兔、山羊、小鼠等各種生物種的抗體，市售有能夠使用的二抗，可以根據(jù)抗SLC38A4蛋白質(zhì)抗體的來源生物種不同來選擇適當(dāng)?shù)亩?，在本發(fā)明中使用。還可以使用結(jié)合有標(biāo)記物質(zhì)的蛋白A、蛋白G等來代替二抗。作為標(biāo)記物質(zhì)，可列舉過氧化物酶、β -D-半乳糖苷酶、微過氧化物酶、辣根過氧化物酶(HRP)、異硫氰酸熒光素(FITC)、異硫氰酸羅丹明(RITC)、堿性磷酸酶、生物素和放射性物質(zhì)等。在本發(fā)明中，如果使用生物素作為標(biāo)記物質(zhì)，使其與抗生物素蛋白過氧化物酶反應(yīng)，則可以以高靈敏度檢測(cè)與SLC38A4蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體。生物體組織的免疫組織化學(xué)染色一般通過以下步驟(I) (10)來進(jìn)行。其中，關(guān)于生物體組織的免疫組織化學(xué)染色法可以參照各種文獻(xiàn)和成書(例如，“酵素抗體法，改訂第三版”，渡邊圭一，中根一穗編集，學(xué)際企畫)。(I)固定·石蠟包埋將通過外科從生物體采集的組織樣本用福爾馬林或低聚甲醛、無水乙醇等固定。然后用石蠟包埋。一般在醇脫水后用二甲苯處理，最后用石蠟包埋。將石蠟包埋后的標(biāo)本切成所需的厚度(例如，3 5μπι厚)的薄切片，使其在載玻片上伸展。此外，有時(shí)也可以使用醇固定標(biāo)本、干燥密封的標(biāo)本、凍結(jié)標(biāo)本等代替石蠟包埋標(biāo)本。
(2)脫石蠟一般用二甲苯、酒精和純化水依次處理。(3)前處理(抗原修復(fù))根據(jù)需要為了抗原修復(fù)而進(jìn)行酶處理、加熱處理和/或加壓處理等。(4)內(nèi)源性過氧化物酶除去在作為染色時(shí)的標(biāo)記物質(zhì)使用過氧化物酶的情況下，預(yù)先用過氧化氫水處理以除去內(nèi)源性過氧化物酶活性。(5)非特異性反應(yīng)的抑制將切片用牛血清白蛋白溶液(例如，1%溶液)處理幾分鐘 幾十分鐘以抑制非特異性反應(yīng)。此外，如果使用含有牛血清白蛋白的抗體溶液進(jìn)行接下來的一抗反應(yīng)，則可以省略該工序。(6)抗體反應(yīng)將稀釋到適當(dāng)濃度的抗體滴加到載玻片上的切片上，然后反應(yīng)幾十分鐘 幾小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，用磷酸緩沖液等適當(dāng)?shù)木彌_液清洗。(7)標(biāo)記試劑的添加作為標(biāo)記物質(zhì)經(jīng)常使用過氧化物酶。在上述抗體反應(yīng)中，也可以使用結(jié)合有過氧化物酶的抗SLC38A4蛋白質(zhì)抗體，在不標(biāo)記抗SLC38A4蛋白質(zhì)抗體的情況下，還可以使用結(jié)合有過氧化物酶的二抗、結(jié)合有過氧化物酶的蛋白G、蛋白A等。例如，在使用二抗的情況下，將結(jié)合有過氧化物酶的二抗滴加到載玻片上的切片上，然后反應(yīng)幾十分鐘 幾小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，用磷酸緩沖液等適當(dāng)緩沖液清洗。⑶顯色反應(yīng)在Tris緩沖液中溶解DAB (3，3’ - 二氨基聯(lián)苯胺)。然后添加過氧化氫水。使這樣調(diào)制的顯色用溶液浸透切片幾分鐘(例如5分鐘)，使其顯色。顯色之后，將切片用自來水充分清洗，以除去DAB。(9)核染色使Mayer蘇木精反應(yīng)幾秒 幾十秒鐘進(jìn)行核染色。用流水清洗而顯色(通常幾分鐘)。(10)脫水、清晰化、密封在用醇脫水后，用二甲苯進(jìn)行清晰化處理，最后用合成樹脂或甘油、封片劑等密封。細(xì)胞或組織為癌的概率和/或組織中的癌化部位，與免疫染色的染色強(qiáng)度和/或通過免疫染色而被染色的細(xì)胞的比例有強(qiáng)的相關(guān)性。因此，在本發(fā)明中，通過檢測(cè)SLC38A4蛋白質(zhì)的表達(dá)可以進(jìn)行從被檢體分離出的細(xì)胞或組織為癌的概率的評(píng)價(jià)、和/或組織中的癌化部位的特定。由此，可以在視覺上確認(rèn)食道癌存在的部位和狀況(包括轉(zhuǎn)移部位和/或轉(zhuǎn)移的狀況、向新的組織浸潤(rùn)的癌細(xì)胞的存在方式等)。特別是由于SLC38A4蛋白質(zhì)的表達(dá)在處于早期的高分化階段的食道癌中以高陽性率被檢測(cè)出，因而根據(jù)本發(fā)明的方法，可判定病理組織的階段(高分化階段)。與等級(jí)發(fā)展的晚期癌相比，高分化階段的癌細(xì)胞與正常鱗狀上皮細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)上類似點(diǎn)較多，難以實(shí)現(xiàn)癌與正常的區(qū)分，但利用了抗SLC38A4蛋白質(zhì)抗體的本發(fā)明的組織染色，在通過目視與正常難以區(qū)別的早期癌的檢測(cè)中極為有用。在本發(fā)明中，“早期的食道癌”具體是未達(dá)到III級(jí)的階段的食道癌，優(yōu)選為I級(jí)或II級(jí)的食道癌。以癌患者為對(duì)象實(shí)施上述方法得到的信息，可以在該患者的病情的評(píng)價(jià)或掌握、治療效果的評(píng)價(jià)等中利用。例如，如果與治療并行地實(shí)施本發(fā)明的方法，則可以以作為結(jié)果得到的信息為基礎(chǔ)評(píng)價(jià)治療效果。具體地說，可以通過在施與藥劑之后實(shí)施本發(fā)明的方法來研究病理組織中的染色性的變化，由染色部位的增減的變化來判定治療效果。這樣可以利 用本發(fā)明的方法作為治療效果的監(jiān)視器。另一方面，以除了患者以外的人、即未認(rèn)定為癌的人為對(duì)象獲得的信息，可以在食道癌的罹患的有無的判定評(píng)價(jià)等中利用。如果基于本發(fā)明的方法，則可以基于染色性這樣的客觀性優(yōu)異的指標(biāo)來進(jìn)行癌的診斷。被檢體中的癌的診斷通常是由醫(yī)生(包括受到醫(yī)生指示的人。下同。)來進(jìn)行，通過本發(fā)明的方法獲得的、關(guān)于病理組織中的SLC38A4蛋白質(zhì)的表達(dá)量的數(shù)據(jù)對(duì)醫(yī)生的診斷發(fā)揮作用。因此，本發(fā)明的方法也可以說是收集、提示對(duì)醫(yī)生的診斷發(fā)揮作用的數(shù)據(jù)的方法。<食道癌檢測(cè)用組合物及其制造方法>本發(fā)明提供食道癌檢測(cè)用組合物，其中，包含抗SLC38A4蛋白質(zhì)抗體。抗SLC38A4蛋白質(zhì)抗體只要具有對(duì)SLC38A4蛋白質(zhì)的特異結(jié)合性即可，對(duì)其種類和/或來源沒有特別限制。在本發(fā)明的食道癌檢測(cè)用組合物中使用的抗體，可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體。此外，在本發(fā)明的食道癌檢測(cè)用組合物中使用的抗體可以是抗體的功能性片段和/或功能性片段的多聚體的形態(tài)(例如，二聚體、三聚體、四聚體、多聚體)。作為這樣的功能性片段和/或其多聚體，可列舉例如，F(xiàn)ab、Fab’、F (ab，)2、Fv、scFv、sc(Fv)2、dsFv和雙價(jià)抗體(diabody)等。這里“Fab”是指包含一條輕鏈和重鏈的一部分的免疫球蛋白的一價(jià)的抗原結(jié)合片段?？梢酝ㄟ^抗體的木瓜蛋白酶消化、以及通過重組方法得到?！癋ab’”包含抗體的鉸鏈區(qū)的一個(gè)或2個(gè)以上半胱氨酸，由于在重鏈CHl結(jié)構(gòu)域的羧基末端添加了少量殘基而與Fab不同?！癋(ab’)2”是包含兩條輕鏈和兩條重鏈的部分的免疫球蛋白的二價(jià)的抗原結(jié)合片段?！癋v”是具有完整的抗原識(shí)別和結(jié)合部位的最小的抗體片段。Fv是由重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過非共價(jià)鍵牢固地連接而成的二聚體?！皊cFv”包含抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，這些區(qū)域存在于單一的多肽鏈中?！皊c (Fv) 2”是兩個(gè)重鏈可變區(qū)和兩個(gè)輕鏈可變區(qū)通過接頭(linker)結(jié)合成單鏈而得的?！癲sFv”是二硫鍵穩(wěn)定化的Fv?！半p價(jià)抗體”是具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小的抗體片段，該片段包含在同一多肽鏈中與輕鏈可變區(qū)結(jié)合的重鏈可變區(qū)，各區(qū)域與其他鏈的互補(bǔ)區(qū)域形成配對(duì)。
作為抗SLC38A4蛋白質(zhì)抗體，優(yōu)選為識(shí)別SLC38A4蛋白質(zhì)(序列號(hào)I)的第29位 第47位的氨基酸序列“GIGNSEKAAMSSQFANEDT” (序列號(hào)2)的抗體。本發(fā)明的食道癌檢測(cè)用組合物的制造方法包括免疫SLC38A4蛋白質(zhì)或者其有免疫原性的一部分的工序，以及分離和/或純化與SLC38A4蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體的工序。進(jìn)一步可以包括混合作為組合物允許的其他成分的工序。本發(fā)明的食道癌檢測(cè)用組合物中使用的抗體制備方法在本領(lǐng)域是已知的，例如記載于 Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (New York: Co Id Spring HarborLaboratory Press, 1988)。抗體可以利用通常的免疫學(xué)方法、以及曬菌體表面展示法來制備。多克隆抗體的制備可以按照以下步驟進(jìn)行。首先制備抗原(例如，序列號(hào)I所記載的SLC38A4蛋白質(zhì)的全長(zhǎng)或其一部分)，然后使用該抗原對(duì)兔等動(dòng)物進(jìn)行免疫。作為抗原的SLC38A4蛋白質(zhì)可以通過從生物體樣品中分離 純化來制備。另外，也可以使用作為重組 蛋白質(zhì)制備的SLC38A4蛋白質(zhì)作為抗原。重組蛋白質(zhì)如下制備將編碼SLC38A4蛋白質(zhì)的基因或其一部分以能夠表達(dá)的狀態(tài)插入載體中，將該載體導(dǎo)入適當(dāng)宿主，再對(duì)宿主體中表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離·純化。還可以將SLC38A4蛋白質(zhì)、優(yōu)選為包含第29位 第47位的氨基酸序列“GIGNSEKAAMSSQFANEDT” (序列號(hào)2)的肽區(qū)域制備成與GST、β -半乳糖苷酶、麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)、組氨酸(His)標(biāo)簽等的融合蛋白質(zhì)，使用該融合蛋白質(zhì)作為抗原。這樣的融合蛋白質(zhì)可以通過通用的方法簡(jiǎn)便地分離·純化。根據(jù)需要重復(fù)免疫，在抗體的效價(jià)充分上升的時(shí)刻采血，通過離心處理等獲取血清。獲得的血清可以通過利用蛋白G、蛋白A等的親和層析制成IgG級(jí)分。可以通過利用SLC38A4蛋白質(zhì)或其一部分的親和純化，從抗血清、IgG級(jí)分中進(jìn)一步分離·純化與作為免疫原的SLC38A4蛋白質(zhì)或其一部分結(jié)合的抗體。在本發(fā)明的食道癌檢測(cè)用組合物中使用的多克隆抗體特別優(yōu)選為免疫包含SLC38A4蛋白質(zhì)的第29位 第47位的氨基酸序列“GIGNSEKAAMSSQFANEDT” (序列號(hào)2)的肽，作為與該肽結(jié)合的抗體分離·純化而得的多克隆抗體。另一方面，單克隆抗體可以按照以下的步驟制備。首先按照與上述同樣的步驟實(shí)施免疫操作。根據(jù)需要重復(fù)免疫，在抗體效價(jià)充分上升的時(shí)刻從免疫動(dòng)物摘取抗體產(chǎn)生細(xì)胞。接著將所得的抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合而獲得雜交瘤。接著選擇產(chǎn)生對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)具有高特異性的抗體的克隆?？梢栽趯㈦s交瘤單克隆化之后，通過純化所選擇的克隆的培養(yǎng)液，獲得目標(biāo)抗體。另一方面，也可以使雜交瘤增殖至所需數(shù)目以上，然后將其移植到動(dòng)物(例如小鼠)的腹腔內(nèi)使其在腹水內(nèi)增殖，然后對(duì)腹水進(jìn)行純化，從而獲取目標(biāo)抗體。在上述培養(yǎng)液的純化或腹水的純化中，優(yōu)選使用利用了蛋白G、蛋白A的親和層析。另外也可以使用使抗原固相化了的親和層析。另外還可以使用離子交換層析、凝膠過濾層析、硫酸銨分級(jí)和離心分離等方法。這些方法可以單獨(dú)使用或任意組合使用。以這樣獲得的抗體或其基因?yàn)榛A(chǔ)，可以制備Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、sv (Fv) 2、dsFv和雙價(jià)抗體等抗體的功能性片段和/或其多聚體(例如,二聚體、三聚體、四聚體和多聚體)。如上所述，在直接檢測(cè)與SLC38A4蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體量的情況下，所得的抗SLC38A4蛋白質(zhì)抗體可以直接通過酶、熒光等標(biāo)記使用。另一方面，在實(shí)施利用二抗等檢測(cè)與SLC38A4蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體量的間接檢測(cè)方法時(shí)，也可以不標(biāo)記抗SLC38A4蛋白質(zhì)抗體(一抗)，而對(duì)識(shí)別該抗體的二抗進(jìn)行標(biāo)記。作為本發(fā)明的食道癌檢測(cè)用組合物，除了含有抗SLC38A4蛋白質(zhì)抗體以外，還可以含有作為組合物允許的其他成分。作為這樣的其他成分，可列舉例如，擔(dān)載體、賦形劑、崩解齊IJ、緩沖劑、乳化劑、懸浮劑、穩(wěn)定劑、保存劑、防腐劑、生理食鹽、標(biāo)記化合物、二抗等。作為賦形劑，可以使用乳糖、淀粉、山梨糖醇、D-甘露糖醇、白糖等。作為崩解劑，可以使用淀粉、羧甲基纖維素、碳酸鈣等。作為緩沖劑，可以使用磷酸鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽等。作為乳化劑，可以用阿拉伯樹膠、海藻酸鈉、黃蓍膠等。作為懸浮劑，可以使用甘油單硬脂酸酯、單硬脂酸鋁、甲基纖維素、羥甲基纖維素、羥甲基纖維素、十二烷基硫酸鈉等。作為穩(wěn)定劑，可以使用丙二醇、二乙胺基亞硫酸鹽、抗壞血酸等。作為保存劑，可以使用苯酚、苯扎氯胺、苯甲醇、氯丁醇、對(duì)羥基苯甲酸甲酯等。作為防腐劑，可以使用苯扎氯胺、對(duì)羥基苯甲酸、氯丁醇等?！词车腊z測(cè)用試劑盒〉
本發(fā)明還提供包含上述的食道癌檢測(cè)用組合物的食道癌檢測(cè)用試劑盒。本發(fā)明的試劑盒中，除了食道癌檢測(cè)用組合物(抗體標(biāo)準(zhǔn)品)之外，可以組合標(biāo)記的檢測(cè)所需的底物、陽性對(duì)照和/或陰性對(duì)照、或者在試劑的稀釋和/或洗滌中使用的緩沖液等。在以未標(biāo)記的抗體為抗體標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，本發(fā)明的試劑盒可以組合將與該抗體結(jié)合的物質(zhì)(例如，二抗、蛋白G、蛋白A等)標(biāo)記化而得的物質(zhì)。而且，本發(fā)明的試劑盒可以包含該試劑盒的使用說明書。本發(fā)明的試劑盒例如在食道癌的診斷中是有用的。[食道癌治療藥的篩選]本發(fā)明還提供食道癌治療藥的篩選方法。其一種方式是以SLC38A4蛋白質(zhì)為靶標(biāo)的篩選方法，是包括以下工序的方法提供SLC38A4蛋白質(zhì)或其一部分的工序，使候選化合物與SLC38A4蛋白質(zhì)或其一部分接觸的工序，以及選擇與SLC38A4蛋白質(zhì)或其一部分結(jié)合的化合物的工序。通過該方法，可以得到與SLC38A4蛋白質(zhì)結(jié)合的化合物，進(jìn)行食道癌治療藥的篩選。作為候選化合物，可以使用化學(xué)合成或天然的低分子化合物、天然或合成的蛋白質(zhì)、肽、抗體(包含本發(fā)明的抗體)、細(xì)胞提取液、培養(yǎng)上清等。在作為候選化合物使用抗體的情況下，可以通過EIA、ELISA等來測(cè)定候選化合物的結(jié)合活性。使用通過組合化學(xué)技術(shù)的高通量法來篩選與蛋白質(zhì)結(jié)合的人工合成的化合物也是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)(Verdine GL. Nature (ENGLAND) 1996 Nov 7; 384:11-13、Hogan JC Jr.Nature (ENGLAND) 1996Nov 7;384:17-19)。這樣獲得的化合物也可以在食道癌的靶向篩選中使用。另一方式是以SLC38A4蛋白質(zhì)的表達(dá)為指標(biāo)的篩選方法，是包括以下工序的方法對(duì)食道癌模型動(dòng)物(除人以外)施與候選化合物或者對(duì)照的工序，分離該模型動(dòng)物的食道部的組織的工序，以及檢測(cè)分離的組織中的SLC38A4蛋白質(zhì)的表達(dá)，與對(duì)照比較，選擇降低SLC38A4蛋白質(zhì)的表達(dá)的化合物的工序。本方法可以和上述的以SLC38A4蛋白質(zhì)為靶標(biāo)的篩選方法結(jié)合實(shí)施，也可以獨(dú)立實(shí)施。在本方法中，首先準(zhǔn)備食道癌動(dòng)物模型、例如，可以在ALDH2敲除小鼠的皮下等注射乙醇或乙醛，誘發(fā)鱗狀上皮細(xì)胞癌，獲得食道癌的動(dòng)物模型(例如，參照日本特開2005-110601號(hào)公報(bào))。此外也可以通過將人食道癌細(xì)胞移植入免疫缺陷小鼠中來制作食道癌動(dòng)物模型。接著，對(duì)該模型動(dòng)物施與候選化合物或?qū)φ?。作為候選化合物，可以使用化學(xué)合成或天然的低分子化合物、天然或合成的蛋白質(zhì)、肽、抗體(包含本發(fā)明的抗體)、細(xì)胞提取液、培養(yǎng)上清等。作為對(duì)照，可以使用陽性對(duì)照和/或陰性對(duì)照。這里，作為陰性對(duì)照，通常使用生理鹽水等。也可以是已判明沒有治療效果的物質(zhì)。作為陽性對(duì)照，使用已判明有治療效果的物質(zhì)等。施與的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，可以從經(jīng)口、靜脈注射、皮內(nèi)或皮下等中適宜選擇。接著，分離模型動(dòng)物的食道部的組織。被分離的組織在供給免疫染色的情況下，如上所述，可以進(jìn)行固定·石蠟包埋等處理。最后，檢測(cè)分離的組織中的SLC38A4蛋白質(zhì)的表達(dá)，選擇出與對(duì)照相比降低SLC38A4蛋白質(zhì)的表達(dá)的化合物。在通過免疫染色來檢測(cè)SLC38A4蛋白質(zhì)的表達(dá)的情況下，通過比較陽性對(duì)照施與組的染色圖像與候選化合物施與組的染色圖像，選出候選化合物施與組的染色為更陰性(例如，染色強(qiáng)度弱，或者強(qiáng)染色的癌細(xì)胞的比例少)的化合物。作為 對(duì)照的染色圖像，也可以準(zhǔn)備陽性對(duì)照施與組的染色圖像(有治療效果的物質(zhì)的施與組的染色圖像標(biāo)準(zhǔn)染色圖像)代替陰性對(duì)照施與組的染色圖像，選擇同等以上地帶來陰性的染色圖像的化合物。實(shí)施例以下通過實(shí)施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。(I)抗體的制作根據(jù)SLC38A4蛋白質(zhì)的氨基酸序列信息，通過計(jì)算機(jī)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，綜合了其與溶劑的接觸率、柔軟性、表面露出、抗原性、親水性和極性的全部因素，結(jié)果判斷第29位 第47位的氨基酸序列“GIGNSEKAAMSSQFANEDT”(序列號(hào)2)的位置抗原性最高(圖I)。人工合成包含第29位 第47位的氨基酸序列的肽使其與KLH結(jié)合，然后與弗氏完全佐劑混合，每隔一周6次對(duì)兩只以上的兔進(jìn)行免疫。使用固相化有抗原肽的瓊脂糖珠柱從免疫后得到的抗血清中純化出抗原特異性的IgG。對(duì)于純化IgG，使用固相化有抗原肽的96孔板進(jìn)行ELISA，在抗原濃度O. 4 μ g/ml時(shí)其效價(jià)(吸光度0D450)為I. O以上的情況下，用于以后的實(shí)驗(yàn)。本實(shí)施例中獲得的抗原特異性的IgG級(jí)分的效價(jià)為I. 2(圖2)。(2)抗體的性能確認(rèn)所得的抗體優(yōu)選在對(duì)強(qiáng)制表達(dá)SLC38A4蛋白質(zhì)的全長(zhǎng)的293T培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞染色和流式細(xì)胞儀(FCM)中顯示反應(yīng)性。表達(dá)載體使用了 pcDNA3. I (invitrogen公司)。在SLC38A4基因的下游裝載作為核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的IRES序列并在該IRES序列的緊下游裝載綠色突光蛋白質(zhì)Azami-Green (Amalgam公司)的基因。將該表達(dá)載體利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(invitrogen公司)瞬時(shí)導(dǎo)入293T細(xì)胞中，Azami-Green突光發(fā)光的細(xì)胞被判定為導(dǎo)入了SLC38A4基因的細(xì)胞。首先，為了在基因?qū)牒蟮?93T細(xì)胞(IXlO5個(gè)細(xì)胞)的細(xì)胞膜上開孔，用4%的低聚甲醛/磷酸緩沖液(PBS)在4°C固定15分鐘，然后室溫下用O. 1%的TritonX-IOO/PBS處理15分鐘。接著，在室溫下使I μ g/ml的抗體溶液(在100 μ I的含有1%的BSA和
O.l%TritonX-100的PBS中稀釋)和細(xì)胞反應(yīng)I小時(shí)，然后作為二抗使PE標(biāo)記的抗兔IgG抗體(BECKMANC0ULTER公司制，200倍稀釋。稀釋液和一抗稀釋液相同)反應(yīng)。當(dāng)抗體與抗原表達(dá)細(xì)胞反應(yīng)時(shí)，因Azami-Green(綠色)而發(fā)光的細(xì)胞同時(shí)因PE(紅光)而發(fā)光(即，在FCM數(shù)據(jù)中散點(diǎn)向右上移動(dòng))。將染色細(xì)胞用散點(diǎn)圖展開，結(jié)果在使用作為陰性對(duì)照使用的兔IgG的情況下散點(diǎn)不向右上移動(dòng)，另一方面，在使用作為陽性對(duì)照的myc標(biāo)簽抗體(MBL制PL14)的情況下，和使用抗SLC38A4蛋白質(zhì)抗體的情況下，散點(diǎn)向右上移動(dòng)(圖3)。另外，將作為對(duì)照的導(dǎo)入了模擬基因的293T細(xì)胞、和導(dǎo)入了 SLC38A4/SNAT4基因的293T細(xì)胞與上述同樣地進(jìn)行處理后，使用UV熒光顯微鏡(OLYMPUS公司OLYMPUS 1X71熒光顯微鏡系統(tǒng))進(jìn)行觀察。其結(jié)果是，在對(duì)照細(xì)胞中幾乎看不到熒光(紅色)，而在導(dǎo)入了 SLC38A4/SNAT4基因的293T細(xì)胞中檢測(cè)到熒光(紅色)(圖4)。從圖2 4的結(jié)果判斷，制備的抗體特異性地識(shí)別SLC38A4蛋白質(zhì)。(3)利用抗體的組織切片(石蠟包埋)染色為了使樣本統(tǒng)一來源于亞洲人，所有的組織切片(進(jìn)行了石蠟包埋)從上海的Outdo公司(中國(guó))購(gòu)買。首先，使用食道正常部(左)和食道鱗狀上皮細(xì)胞癌部(右)各2例進(jìn)行了染色性的確認(rèn)。由該染色性，基于WHO的腫瘤分類(Pathology and Genetics ofTumours of the Digestive System Edited by Stanley R. Hamilton Lauri A. Aaltonen IARCPress Lyon，2000，pl6)評(píng)價(jià)了食道鱗狀上皮細(xì)胞癌的進(jìn)展率。在該評(píng)價(jià)中，將WHO的腫瘤分類中的“高分化(well differentiaed) ”作為I級(jí)，“中分化(moderatelydifferentiaed) ” 作為 II 級(jí)，“低分化(poorly differentiaed) ” 作為III級(jí)(以下相同)?；颊咛?hào)Com01-D7和Com01-D8均為WHO病理分類I級(jí)的食道鱗狀上皮細(xì)胞癌。為了將組織切片進(jìn)行脫石蠟處理，將在二甲苯中5分鐘的處理進(jìn)行3次、將在100%乙醇中5分鐘的處理進(jìn)行2次、將在95%乙醇中5分鐘的處理進(jìn)行I次、將在90%乙醇中5分鐘的處理進(jìn)行I次、將在80%乙醇中5分鐘的處理進(jìn)行I次、將在70%乙醇中5分鐘的處理進(jìn)行I次、然后將在PBS中5分鐘的處理進(jìn)行3次(所有處理均在室溫下進(jìn)行)。接著，為了進(jìn)行抗原修復(fù)，將組織切片浸泡在含有0. 05%的Tween20的IOmM檸檬酸緩沖液(pH值6)中，用高壓釜在125°C處理5分鐘。為了消除內(nèi)源性的過氧化物酶活性，在含有3%的過氧化氫水的PBS中在室溫下處理10分鐘，然后用含有5 %的正常山羊血清和0. 5 %的BSA的PBS (封閉溶液)在室溫下處理30分鐘。用布擦去過量的溶液，添加適量的用封閉溶液稀釋到I μ g / ml的抗SLC38A4蛋白質(zhì)抗體(充分浸泡組織切片的程度)，在室溫下反應(yīng)2小時(shí)。用含有0. 05%的Tween20的PBS在室溫下洗滌3次，每次5分鐘，然后作為二抗添加適量的Histostar (Ms+Rb) (MBL公司)的原液(充分浸泡組織切片的程度)，在室溫下反應(yīng)60分鐘。用含有0. 05%的Tween20的PBS在室溫下洗滌3次，每次5分鐘，然后與DAB底物液(MBL公司)反應(yīng)10分鐘。通過用水洗滌組織切片來停止反應(yīng)。蘇木精染色后，用乙醇和二甲苯進(jìn)行脫水處理，用標(biāo)本制作液(松浪硝子)制成標(biāo)本。用明視場(chǎng)顯微鏡下(OLYMPUS1X71)進(jìn)行鏡檢和記錄，結(jié)果確認(rèn)了抗SLC38A4蛋白質(zhì)抗體不與正常食道部反應(yīng)，而與食道鱗狀上皮細(xì)胞癌反應(yīng)(圖5)。接著，通過與上述同樣的方法使用表I、表2中記載的96例食道癌患者樣本(在WHO的病理分類中為高分化型的I級(jí)27例，介于高分化和中分化之間I 一 II級(jí)4例，中分化的II級(jí)36例，介于中分化和低分化之間II 一III級(jí)3例，低分化的III級(jí)26例)進(jìn)行組織染色。表I_患者號(hào)性別.. .齡........................................................................τι.一.1"" 織 ..who病理分矣…..…
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kWHO病理分類-組織染色得分
「I級(jí)高分化階段「++ 強(qiáng)陽性
I Π級(jí)中分化階段+ :陽性
L丨Π級(jí):低分化階段+ -:弱陽性
■ :陰性表權(quán)利要求
1.食道癌的檢查方法，其中，包括檢測(cè)從被檢體分離出的細(xì)胞或組織中的SLC38A4蛋白質(zhì)的表達(dá)的工序。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，使用抗體來檢測(cè)SLC38A4蛋白質(zhì)的表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，抗體是識(shí)別包含SLC38A4蛋白質(zhì)中的序列號(hào)2所記載的氨基酸序列的區(qū)域的抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求I 3的任一項(xiàng)所述方法，其中，食道癌是早期的食道癌。
5.食道癌檢測(cè)用組合物，其中，包含抗SLC38A4蛋白質(zhì)抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其中，抗體是識(shí)別包含SLC38A4蛋白質(zhì)中的序列號(hào)2所記載的氨基酸序列的區(qū)域的抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的組合物，其中，食道癌是早期的食道癌。
8.權(quán)利要求5所述的組合物的制造方法，其中，包括以下工序 (a)免疫SLC38A4蛋白質(zhì)或者其有免疫原性的一部分的工序，以及 (b)分離和/或純化與SLC38A4蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體的工序。
9.權(quán)利要求6所述組合物的制造方法，其中，包括以下工序 (a)免疫包含SLC38A4蛋白質(zhì)中的序列號(hào)2所記載的氨基酸序列的肽的工序，以及 (b)分離和/或純化與包含SLC38A4蛋白質(zhì)中的序列號(hào)2所記載的氨基酸序列的區(qū)域結(jié)合的抗體的工序。
10.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的制造方法，其中，組合物是早期的食道癌的檢測(cè)用組合物。
11.食道癌檢測(cè)用試劑盒，其中，包含權(quán)利要求5 7所述的組合物。
12.食道癌治療藥的篩選方法，其中，包括以下工序 (a)提供SLC38A4蛋白質(zhì)或其一部分的工序， (b)使候選化合物與SLC38A4蛋白質(zhì)或其一部分接觸的工序，以及 (c)選擇與SLC38A4蛋白質(zhì)或其一部分結(jié)合的化合物的工序。
13.食道癌治療藥的篩選方法，其中，包括以下工序 (a)對(duì)食道癌模型動(dòng)物(除人以外)施與候選化合物或者對(duì)照的工序， (b)采集該模型動(dòng)物的食道部的組織的工序，以及 (c)檢測(cè)采集的組織中的SLC38A4蛋白質(zhì)的表達(dá)，與對(duì)照比較，選擇降低SLC38A4蛋白質(zhì)的表達(dá)的化合物的工序。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的篩選方法，其中，治療藥是早期的食道癌的治療藥。
全文摘要
對(duì)于各種標(biāo)志物候選進(jìn)行針對(duì)人癌病理切片和正常組織切片的免疫組織染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在自行開發(fā)的針對(duì)80種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抗原特異性抗體中，針對(duì)SLC38A4蛋白質(zhì)的抗體與食道癌組織特異性地反應(yīng)，特別是在處于早期的高分化階段的食道癌組織中顯示高反應(yīng)性。
文檔編號(hào)G01N33/50GK102803968SQ201180006719
公開日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2011年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月22日
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