專利名稱：光學(xué)分析裝置、光學(xué)分析方法和用于光學(xué)分析的計(jì)算機(jī)程序的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)來自分散或溶解于溶液中的原子、分子或團(tuán)聚體(在下文中，這些均稱作“粒子”)的光進(jìn)行檢測(cè)以用于分析溶液中的粒子的狀態(tài)的光學(xué)分析裝置、光學(xué)分析方法和用于光學(xué)分析的計(jì)算機(jī)程序，更具體地，本發(fā)明涉及如下的光學(xué)分析裝置、光學(xué)分析方法和用于光學(xué)分析的計(jì)算機(jī)程序其能夠通過使用諸如共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)等能對(duì)來自溶液中的微小區(qū)域的光進(jìn)行檢測(cè)的光學(xué)系統(tǒng)來獲取對(duì)分析例如蛋白質(zhì)、肽、核酸、脂質(zhì)、糖鏈、氨基酸或其團(tuán)聚體等生物分子以及例如病毒、細(xì)胞或非生物粒子等粒狀物等等各種粒子的狀態(tài)(相互作用、結(jié)合或離解狀態(tài)，等等)有用的信息。
背景技術(shù)：
根據(jù)近年來在光學(xué)測(cè)量技術(shù)上的發(fā)展，通過使用共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和能夠?qū)庾佑?jì)數(shù)(單光子檢測(cè))的超高靈敏度光檢測(cè)技術(shù)，使得單光子或單熒光分子水平的微弱光的檢測(cè)和/或測(cè)量成為可能。因此，提出了借助于這種微弱光檢測(cè)技術(shù)對(duì)生物分子等的分子間相互作用、結(jié)合或離解反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)的各種裝置或方法。例如，在熒光相關(guān)光譜分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy :FCS,參見例如專利文獻(xiàn)I和2以及非專利文獻(xiàn)1-3)中，借助于激光共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)技術(shù)，對(duì)樣品溶液中的微小區(qū)域(顯微鏡的激光會(huì)聚的聚焦區(qū)域，稱作“共聚焦體積”)內(nèi)進(jìn)出的熒光分子或熒光標(biāo)記分子(熒光分子等)的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)量，并且基于由測(cè)得的熒光強(qiáng)度的自相關(guān)函數(shù)值所確定的熒光分子等在微小區(qū)域中的平均駐留時(shí)間(平移擴(kuò)散時(shí)間)和駐留分子數(shù)的平均值，實(shí)現(xiàn)了熒光分子等的諸如運(yùn)動(dòng)速度、尺寸或濃度等信息的獲取和/或諸如分子的結(jié)構(gòu)或大小的變化、分子的結(jié)合或離解反應(yīng)或者分散和團(tuán)聚等各種現(xiàn)象的檢測(cè)。此外，在熒光強(qiáng)度分布分析(Fluorescence Intensity Distribution Analysis :FIDA,例如專利文獻(xiàn)3)或者光子計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)分析(Photon Counting Histogram :PCH,例如專利文獻(xiàn)4)中，生成了通過與FCS類似的方式測(cè)得的進(jìn)出共聚焦體積的熒光分子等的熒光強(qiáng)度的直方圖，并且通過將統(tǒng)計(jì)模型公式與直方圖的分布擬合來計(jì)算熒光分子等的特征亮度的平均值以及共聚焦體積內(nèi)駐留的分子的平均數(shù)，從而，將基于這些信息估算分子的結(jié)構(gòu)或尺寸變化、結(jié)合或離解狀態(tài)或者分散和團(tuán)聚狀態(tài)。此外，在專利文獻(xiàn)5和6中，提出了基于使用共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)測(cè)得的樣品溶液中熒光信號(hào)的時(shí)間演進(jìn)來檢測(cè)熒光物質(zhì)的方法。專利文獻(xiàn)7提出了一種信號(hào)計(jì)算處理技術(shù)，其利用光子計(jì)數(shù)技術(shù)測(cè)量來自流過流式細(xì)胞儀的熒光微粒或者來自固定在基板上的熒光微粒的微弱光，以檢測(cè)熒光微粒是否存在于流體中或者基板上。特別地，根據(jù)諸如FCS和FIDA等采用了使用共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)技術(shù)來對(duì)微小區(qū)域進(jìn)行熒光測(cè)量的技術(shù)的方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，測(cè)量所需的樣品量可以極少(一次測(cè)量所使用的量最多幾十μ L)且濃度極低，并且測(cè)量時(shí)間也大幅縮短(在一次測(cè)量中，反復(fù)進(jìn)行若干次時(shí)間為秒量級(jí)的測(cè)量)。因此，特別是在對(duì)醫(yī)學(xué)或生物學(xué)研究和開發(fā)領(lǐng)域中常用的稀有或昂貴的樣品進(jìn)行分析時(shí)，或者在諸如疾病臨床診斷或生物活性物質(zhì)的篩選等對(duì)大量的樣本進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，期望這些技術(shù)與傳統(tǒng)的生化方法相比是使得能夠以低成本和/或快速地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或試驗(yàn)的強(qiáng)力的手段?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I :日本特開2005-098876專利文獻(xiàn)2 :日本特開2008-292371
專利文獻(xiàn)3 日本特許第4023523號(hào)專利文獻(xiàn)4 :國際公開2008-080417專利文獻(xiàn)5 :日本特開2007-20565專利文獻(xiàn)6 :日本特開2008-116440專利文獻(xiàn)7 :日本特開平4-337446號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)I :金城政孝，“蛋白質(zhì)，核酸,酵素”，Vol. 44，No. 9,1431 — 1438頁，1999 年。非專利文獻(xiàn)2 F. J.梅耶-阿姆茲(F. J. Meyer-Alms),熒光相關(guān)光譜學(xué)(Fluorescence Correlation Spectroscopy), R.里格爾(R.Rigler)編，施普林格(Springer)，柏林，2000 年,204 — 224 頁。非專利文獻(xiàn)3 :加藤則子外4名，遺傳子醫(yī)學(xué)，Vol. 6，No. 2，271 — 277頁。

發(fā)明內(nèi)容
需要解決的技術(shù)問題在諸如FCS、FIDA和PCH等上述光學(xué)分析技術(shù)中，簡要地說，通過統(tǒng)計(jì)處理算出測(cè)得的熒光強(qiáng)度的時(shí)間波動(dòng)的大小，然后基于波動(dòng)的大小確定在樣品溶液中的微小區(qū)域內(nèi)進(jìn)出的熒光分子等的各種特性。因此，為了在上述光學(xué)分析技術(shù)中獲得顯著的結(jié)果，優(yōu)選的是，以如下方式準(zhǔn)備被用作樣品溶液中的觀測(cè)對(duì)象的熒光分子等的濃度或數(shù)密度使得在平衡狀態(tài)下，在秒量級(jí)長度的一次測(cè)量時(shí)間內(nèi)，有使得統(tǒng)計(jì)處理能夠進(jìn)行的數(shù)量的熒光分子等將進(jìn)出微小區(qū)域，優(yōu)選地使得在微小區(qū)域中將總是存在大約一個(gè)熒光分子等(典型地，由于共聚焦體積的體積為大約lfL，所以優(yōu)選的是熒光分子等的濃度為大約InM以上)。換言之，當(dāng)樣品溶液中被觀測(cè)粒子的濃度或數(shù)密度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于使得統(tǒng)計(jì)處理能夠進(jìn)行的水平(例如，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于InM)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)在測(cè)量時(shí)間內(nèi)很少有被觀測(cè)對(duì)象進(jìn)入到微小區(qū)域內(nèi)的狀態(tài)，因此，熒光強(qiáng)度的測(cè)量結(jié)果會(huì)包括很長一段時(shí)間的在微小區(qū)域內(nèi)完全不存在被觀測(cè)對(duì)象的狀態(tài)，并且顯著的熒光強(qiáng)度的觀測(cè)量也會(huì)減小，因此，不能夠期望在如上所述基于熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)波動(dòng)的光學(xué)分析技術(shù)中有顯著的或精確的分析結(jié)果。在專利文獻(xiàn)5和6中描述的使用共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)熒光物質(zhì)的方法中，在未對(duì)熒光強(qiáng)度波動(dòng)如上所述地進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理的情況下，能夠根據(jù)持續(xù)數(shù)秒的測(cè)量時(shí)間內(nèi)是否產(chǎn)生具有顯著強(qiáng)度的熒光信號(hào)來確定樣品中是否存在被觀測(cè)熒光分子等，并且公開了，已經(jīng)獲得樣品中具有顯著強(qiáng)度的熒光信號(hào)的頻率與熒光分子等的數(shù)量之間的相關(guān)性。特別地，在專利文獻(xiàn)6中啟示，攪動(dòng)樣品溶液的內(nèi)部的隨機(jī)流動(dòng)的發(fā)生改善檢測(cè)敏感度。然而，即使在那些方法中，也僅僅檢測(cè)到是否存在由于擴(kuò)散或隨機(jī)流動(dòng)而隨機(jī)地進(jìn)出微小區(qū)域的熒光分子等，而不能掌握微小區(qū)域內(nèi)的熒光分子等的粒子的行為，所以，例如沒有實(shí)現(xiàn)粒子的計(jì)數(shù)或者粒子的濃度或數(shù)密度的定量計(jì)算。此外，專利文獻(xiàn)7中描述的技術(shù)在于檢測(cè)流式細(xì)胞儀中的流體內(nèi)是否存在單個(gè)熒光微?；蛘邫z測(cè)是否存在固定于基板上的單個(gè)熒光微粒，而不是用于對(duì)在樣品溶液中在通常狀態(tài)下被溶解或分散的諸如分子和膠體等粒子、即在樣品溶液中隨機(jī)移動(dòng)的粒子進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)，因此，沒有實(shí)現(xiàn)定量地算出樣品溶液內(nèi)溶解或分散的粒子的濃度或數(shù)密度。此外，由于專利文獻(xiàn)7的技術(shù)包括諸如流式細(xì)胞儀中的測(cè)量或?qū)晒饬Ｗ庸潭ㄓ诨宓奶幚淼冗^程，所以與諸如FCS、FIDA和PCH等光學(xué)分析技術(shù)的情況相比，大大地增加了試驗(yàn)所需的樣品量，并且對(duì)于進(jìn)行試驗(yàn)的人員可能要求復(fù)雜且先進(jìn)的操作技術(shù)。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種新的光學(xué)分析技術(shù)，該技術(shù)不包括諸如FCS,FIDA和PCH等光學(xué)分析技術(shù)中進(jìn)行的統(tǒng)計(jì)處理，使得能夠在包含的被觀測(cè)粒子的濃度或數(shù)密度比諸如FCS、FIDA和PCH等光學(xué)分析技術(shù)所能夠處理的水平低的樣品溶液中檢測(cè)被觀測(cè)粒子的狀態(tài)或特性。另外，本發(fā)明的另一目的在于提供一種實(shí)現(xiàn)上述新的光學(xué)分析技術(shù)的光學(xué)分析裝 置、方法或用于光學(xué)分析的計(jì)算機(jī)程序，其中，能夠在與諸如FCS、FIDA和PCH等光學(xué)分析技術(shù)相似的短的測(cè)量時(shí)間內(nèi)利用少量樣品(例如，數(shù)十μ L的水平)完成測(cè)量，還能夠定量地確定被觀測(cè)粒子的諸如濃度或數(shù)密度等特性。用于解決問題的方案總的來說，在本發(fā)明中，提出了一種新型光學(xué)分析技術(shù)，該技術(shù)借助于諸如共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)等能夠?qū)碜匀芤褐械奈⑿^(qū)域的光進(jìn)行檢測(cè)的光學(xué)系統(tǒng)對(duì)來自分散在樣品溶液中且在樣品溶液中隨機(jī)地移動(dòng)的發(fā)光的粒子(以下稱為“發(fā)光粒子”)的光進(jìn)行檢測(cè)，該技術(shù)在使微小區(qū)域的位置在樣品溶液中移動(dòng)的同時(shí)(即，在利用微小區(qū)域掃描樣品溶液的內(nèi)部的同時(shí))對(duì)來自微小區(qū)域、即光檢測(cè)區(qū)域的光進(jìn)行檢測(cè)，由此單個(gè)地檢測(cè)橫穿微小區(qū)域的內(nèi)部的發(fā)光粒子，并且使得能夠?qū)Πl(fā)光粒子計(jì)數(shù)和能夠獲取關(guān)于樣品溶液內(nèi)的發(fā)光粒子的濃度或數(shù)密度的信息。根據(jù)本發(fā)明，作為一個(gè)方面，提供一種光學(xué)分析裝置，其通過使用共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)對(duì)來自發(fā)光粒子的光進(jìn)行檢測(cè)，所述發(fā)光粒子分散在樣品溶液中且在所述樣品溶液中隨機(jī)地移動(dòng)，其特征在于，所述光學(xué)分析裝置包括光檢測(cè)區(qū)域移動(dòng)部，其通過改變所述光學(xué)系統(tǒng)的光路來使所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置在所述樣品溶液中移動(dòng)；光檢測(cè)部，其對(duì)來自所述光檢測(cè)區(qū)域的光進(jìn)行檢測(cè)；和信號(hào)處理部，其在由所述光檢測(cè)部在所述光檢測(cè)區(qū)域的位置在所述樣品溶液中移動(dòng)的過程中檢測(cè)到的光中單個(gè)地檢測(cè)來自每個(gè)發(fā)光粒子的光信號(hào)。在該結(jié)構(gòu)中，“分散在樣品溶液中且在樣品溶液中隨機(jī)地移動(dòng)的發(fā)光粒子”是能發(fā)光且分散或溶解在樣品溶液中的諸如原子、分子或其團(tuán)聚體等粒子，并且可以是在溶液中自由地進(jìn)行布朗運(yùn)動(dòng)而未固定于基板的任意微粒物質(zhì)等。該發(fā)光粒子典型地為熒光粒子，但是也可以是通過磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、光散射等發(fā)光的粒子。共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的“光檢測(cè)區(qū)域”是所述顯微鏡中的檢測(cè)光的微小區(qū)域，該區(qū)域與當(dāng)照明光從物鏡發(fā)出時(shí)將照明光會(huì)聚到的區(qū)域?qū)?yīng)(該區(qū)域根據(jù)共聚特別是焦顯微鏡中的物鏡和針孔之間的空間關(guān)系來確定。對(duì)于在沒有照明光的情況下發(fā)光的發(fā)光粒子，例如根據(jù)化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光的粒子，在顯微鏡中不需要照明光。)。在這方面，在本說明書中，“來自發(fā)光粒子的光信號(hào)”是指“表示來自發(fā)光粒子的光的信號(hào)”。如從以上可以理解到的，在本發(fā)明的裝置的基本結(jié)構(gòu)中，首先，在使光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣品溶液中移動(dòng)的同時(shí)，即在利用光檢測(cè)區(qū)域掃描樣品溶液的內(nèi)部的同時(shí)，順次地進(jìn)行光的檢測(cè)。然后，當(dāng)移動(dòng)的光檢測(cè)區(qū)域包括隨機(jī)地移動(dòng)的發(fā)光粒子時(shí)，通過光檢測(cè)部檢測(cè)來自發(fā)光粒子的光，由此，將檢測(cè)到存在一個(gè)發(fā)光粒子。并且裝置的信號(hào)處理部在光檢測(cè)部順次檢測(cè)到的信號(hào)中對(duì)發(fā)光粒子的光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，由此，逐個(gè)地順次地檢測(cè)是否存在單個(gè)的發(fā)光粒子，因此，將獲取關(guān)于溶液內(nèi)的發(fā)光粒子的狀態(tài)的各種信息。具體地，例如，在本發(fā)明的裝置中，信號(hào)處理部可以被設(shè)計(jì)成通過對(duì)單個(gè)地檢測(cè)出的發(fā)光粒子的光信號(hào)的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)、來對(duì)在光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的過程中檢測(cè)到的發(fā)光粒子數(shù)計(jì)數(shù)(發(fā)光粒子的計(jì)數(shù))。根據(jù)該結(jié)構(gòu)，通過將發(fā)光粒子數(shù)與光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)量相關(guān)聯(lián)，將獲取關(guān)于樣品溶液內(nèi)的發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度的信息。特別地，通過用任意方法確定光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡的總體積，例如通過使光檢測(cè)區(qū)域以預(yù)定的速度移動(dòng)，能夠具體地計(jì)算出發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度。當(dāng)然，代替直接確定絕對(duì)的數(shù)密度值或濃度值，可以計(jì)算出數(shù)密度或濃度相對(duì)于多個(gè)樣品溶液或者相對(duì)于作為濃度或數(shù)密度的基準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)溶液的相 對(duì)比率。此外，在上述本發(fā)明中，由于通過改變光學(xué)系統(tǒng)的光路來使光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)，所以在樣品溶液中實(shí)質(zhì)上不發(fā)生機(jī)械振動(dòng)和流體動(dòng)力作用的情況下使光檢測(cè)區(qū)域快速移動(dòng)，所以，能夠在沒有影響待檢測(cè)的發(fā)光粒子的動(dòng)力作用(作用在樣品溶液中的振動(dòng)和流動(dòng)可能會(huì)改變粒子的性能)的、穩(wěn)定的狀態(tài)下進(jìn)行光的測(cè)量。此外，由于不需要用于使樣品溶液流動(dòng)的結(jié)構(gòu)，所以能夠利用與FCS和FIDA等相似的少量的樣品溶液(一至幾十μ L的水平)進(jìn)行測(cè)量和分析。在本發(fā)明的裝置的信號(hào)處理部的處理中，基于從光檢測(cè)部發(fā)送的連續(xù)信號(hào)進(jìn)行的是否有一個(gè)發(fā)光粒子已經(jīng)進(jìn)入到光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的判定，可以基于由光檢測(cè)部檢測(cè)到的時(shí)間序列光信號(hào)的形狀來完成。在實(shí)施方式中，典型地，當(dāng)檢測(cè)到具有比預(yù)定閾值大的強(qiáng)度的光信號(hào)時(shí)，可以檢測(cè)出一個(gè)發(fā)光粒子已經(jīng)進(jìn)入到光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)。此外，在上述本發(fā)明的裝置中，基于發(fā)光粒子的特性或樣品溶液內(nèi)發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度來適當(dāng)?shù)馗淖児鈾z測(cè)區(qū)域的位置在樣品溶液中的移動(dòng)速度。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的，來自發(fā)光粒子的檢測(cè)光的狀態(tài)可以根據(jù)發(fā)光粒子的特性或樣品溶液內(nèi)發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度而改變。特別地，當(dāng)光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度變快時(shí)，從一個(gè)發(fā)光粒子獲得的光量將減小，所以，優(yōu)選的是能夠適當(dāng)?shù)馗淖児鈾z測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度，使得能夠以精確的或足夠的靈敏度測(cè)量來自一個(gè)發(fā)光粒子的光。此外，在本發(fā)明的裝置中，優(yōu)選地，將光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣品溶液中的移動(dòng)速度設(shè)定為比作為待檢測(cè)對(duì)象的發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度(粒子的由于布朗運(yùn)動(dòng)的平均移動(dòng)速度)快。如上所述，當(dāng)光檢測(cè)區(qū)域通過存在發(fā)光粒子的位置時(shí)，本發(fā)明的裝置檢測(cè)到從發(fā)光粒子發(fā)出的光，由此單個(gè)地檢測(cè)發(fā)光粒子。然而，當(dāng)發(fā)光粒子由于布朗運(yùn)動(dòng)而隨機(jī)地移動(dòng)以致多次進(jìn)出光檢測(cè)區(qū)域時(shí)，將多次檢測(cè)到來自一個(gè)發(fā)光粒子的光信號(hào)(表明存在發(fā)光粒子)，所以，使存在一個(gè)發(fā)光粒子與檢測(cè)到的光信號(hào)相關(guān)聯(lián)變得困難。因此，如上所述，將光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度設(shè)定為比發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度快，由此，變得能夠使一個(gè)發(fā)光粒子與一個(gè)光信號(hào)(表明存在發(fā)光粒子)相對(duì)應(yīng)。在這方面，由于擴(kuò)散移動(dòng)速度取決于發(fā)光粒子而不同，所以，優(yōu)選地，如上所述可以將本發(fā)明的裝置設(shè)計(jì)成能夠根據(jù)發(fā)光粒子的特性(特別是擴(kuò)散常數(shù))來適當(dāng)?shù)馗淖児鈾z測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度?？梢砸匀我夥绞絹硗瓿捎糜谑构鈾z測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的光學(xué)系統(tǒng)的光路的改變。例如，可以通過使用激光掃描型光顯微鏡中采用的電流鏡改變光路來改變光檢測(cè)區(qū)域的位置。光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)軌跡可以任意地設(shè)定，例如，該移動(dòng)軌跡可以從圓形、橢圓形、矩形、直線和曲線中選擇。在實(shí)施方式中，可以將使用共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)來對(duì)來自樣品溶液中的發(fā)光粒子的光進(jìn)行檢測(cè)的本發(fā)明的光學(xué)分析裝置設(shè)計(jì)成在通過改變光學(xué)系統(tǒng)的光路使光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域以比樣品溶液內(nèi)發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度快的速度在樣品溶液中移動(dòng)的同時(shí)，對(duì)來自進(jìn)入到光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)部的每個(gè)發(fā)光粒子的光信號(hào)單個(gè)地進(jìn)行檢測(cè)，并且通過對(duì)光信號(hào)計(jì)數(shù)來對(duì)進(jìn)入到光檢測(cè)區(qū)域的發(fā)光粒子數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。在上述本發(fā)明的裝置中與使光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣品溶液中移動(dòng)一起進(jìn)行光檢測(cè)、并且對(duì)來自每個(gè)發(fā)光粒子的光信號(hào)單個(gè)地進(jìn)行檢測(cè)的光學(xué)分析技術(shù)的處理也可以通過通用計(jì)算機(jī)來實(shí)現(xiàn)。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種用于光學(xué)分析的計(jì)算機(jī)程序， 所述光學(xué)分析用于通過使用共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)對(duì)來自發(fā)光粒子的光進(jìn)行檢測(cè)，所述發(fā)光粒子分散在樣品溶液中且在所述樣品溶液中隨機(jī)地移動(dòng)，其特征在于，所述計(jì)算機(jī)程序使計(jì)算機(jī)執(zhí)行如下進(jìn)程改變所述光學(xué)系統(tǒng)的光路以使所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置在所述樣品溶液中移動(dòng)；在使所述光檢測(cè)區(qū)域的位置在所述樣品溶液中移動(dòng)的過程中對(duì)來自所述光檢測(cè)區(qū)域的光進(jìn)行檢測(cè)；和在檢測(cè)到的光中單個(gè)地檢測(cè)來自每個(gè)發(fā)光粒子的光信號(hào)。另外，該計(jì)算機(jī)程序可以包括通過對(duì)單個(gè)地檢測(cè)出的來自發(fā)光粒子的光信號(hào)的數(shù)量計(jì)數(shù)來對(duì)在光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的過程中檢測(cè)到的發(fā)光粒子的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)的進(jìn)程；和/或基于檢測(cè)到的發(fā)光粒子數(shù)來確定樣品溶液內(nèi)的發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度的進(jìn)程。此外，在改變光學(xué)系統(tǒng)的光路以使光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的過程中，可以使光檢測(cè)區(qū)域的位置以預(yù)定的速度或者比發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度快的速度移動(dòng)，并且可以基于發(fā)光粒子的特性或樣品溶液內(nèi)發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度來設(shè)定光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度。此夕卜，在信號(hào)處理過程中，可以基于檢測(cè)到的時(shí)間序列光信號(hào)的形狀來判定一個(gè)發(fā)光粒子是否進(jìn)入到光檢測(cè)區(qū)域中、例如對(duì)具有比預(yù)定閾值大的強(qiáng)度的光信號(hào)的檢測(cè)來判定。光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡可以從圓形、橢圓形、矩形、直線和曲線中選擇。此外，根據(jù)上述本發(fā)明的裝置或計(jì)算機(jī)程序，實(shí)現(xiàn)了新的光學(xué)分析方法，該方法通過與使光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣品溶液中移動(dòng)一起對(duì)光進(jìn)行檢測(cè)，來單個(gè)地檢測(cè)來自每個(gè)發(fā)光粒子的光信號(hào)。因此，本發(fā)明的光學(xué)分析方法，其通過使用共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)對(duì)來自發(fā)光粒子的光進(jìn)行檢測(cè)，所述發(fā)光粒子分散在樣品溶液中且在所述樣品溶液中隨機(jī)地移動(dòng)，其特征在于，所述方法包括如下步驟通過改變所述光學(xué)系統(tǒng)的光路使所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置在所述樣品溶液中移動(dòng)；在使所述光檢測(cè)區(qū)域的位置在所述樣品溶液中移動(dòng)的同時(shí)對(duì)來自所述光檢測(cè)區(qū)域的光進(jìn)行檢測(cè)；和在檢測(cè)到的光中單個(gè)地檢測(cè)來自每個(gè)發(fā)光粒子的光信號(hào)。該方法也可以包括通過對(duì)單個(gè)地檢測(cè)出的來自發(fā)光粒子的光信號(hào)的數(shù)量計(jì)數(shù)來對(duì)在光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的過程中檢測(cè)到的發(fā)光粒子的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)的步驟；和/或基于檢測(cè)到的發(fā)光粒子數(shù)來確定樣品溶液內(nèi)的發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度的步驟。此外，在使光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的步驟中，可以使光檢測(cè)區(qū)域的位置以預(yù)定的速度或比發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度快的速度移動(dòng)，并且可以基于發(fā)光粒子的特性或樣品溶液內(nèi)發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度來設(shè)定光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度。此外，在信號(hào)處理步驟中，可以基于檢測(cè)到的時(shí)間序列光信號(hào)的形狀來判斷一個(gè)發(fā)光粒子是否進(jìn)入到光檢測(cè)區(qū)域中，例如基于對(duì)具有比預(yù)定閾值大的強(qiáng)度的光信號(hào)的檢測(cè)來判定。發(fā)明的技術(shù)效果通過上述本發(fā)明的裝置、方法或計(jì)算機(jī)程序?qū)崿F(xiàn)的光學(xué)分析技術(shù)為自身的光檢測(cè)機(jī)構(gòu)采用了如下結(jié)構(gòu)與諸如FCS、FIDA和PCH等光學(xué)分析技術(shù)的情況類似，對(duì)來自共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡中的光檢測(cè)區(qū)域的光進(jìn)行檢測(cè)，因此，樣品溶液的量可以同樣地少。然而，由于在本發(fā)明中未進(jìn)行計(jì)算熒光強(qiáng)度波動(dòng)的統(tǒng)計(jì)處理，所以本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)適用于發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度大大地低于諸如FCS、FIDA和PCH等光學(xué)分析技術(shù)所需的水平的樣品溶液。 此外，由于在本發(fā)明中對(duì)分散或溶解在溶液中的每個(gè)發(fā)光粒子單個(gè)地進(jìn)行檢測(cè)，所以通過使用關(guān)于粒子的信息能夠定量地進(jìn)行發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)、樣品溶液中發(fā)光粒子的濃度或數(shù)密度的計(jì)算或者獲取關(guān)于濃度或數(shù)密度的信息。例如，雖然專利文獻(xiàn)5和6能夠獲取在預(yù)定時(shí)間內(nèi)強(qiáng)度超過預(yù)定閾值的熒光信號(hào)的頻率的總數(shù)與樣品溶液中熒光分子等的粒子數(shù)之間的相關(guān)性，但是不能掌握通過測(cè)量區(qū)域的粒子的動(dòng)態(tài)行為(粒子是徑直通過測(cè)量區(qū)域或是駐留在測(cè)量區(qū)域內(nèi))，因此，強(qiáng)度比預(yù)定閾值高的熒光信號(hào)與通過測(cè)量區(qū)域的粒子之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系不清楚，從而發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)從理論上講是不可能的，從而難以精確地確定樣品溶液內(nèi)粒子的濃度。然而，根據(jù)本發(fā)明，由于使得通過光檢測(cè)區(qū)域的發(fā)光粒子與檢測(cè)到的光信號(hào)以I對(duì)I的方式相關(guān)聯(lián)，使得一次將檢測(cè)一個(gè)發(fā)光粒子，對(duì)分散在溶液中且在溶液中隨機(jī)地移動(dòng)的發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)成為可能，并且與傳統(tǒng)技術(shù)相比能夠確定樣品溶液中粒子的濃度或數(shù)密度。此外，根據(jù)通過改變光學(xué)系統(tǒng)的光路而利用光檢測(cè)區(qū)域掃描樣品溶液內(nèi)部的方式，由于將在樣品溶液沒有受到機(jī)械振動(dòng)和流體動(dòng)力學(xué)作用、而機(jī)械地穩(wěn)定的均勻的狀態(tài)下觀測(cè)樣品溶液的內(nèi)部，所以，與例如使得在樣品中產(chǎn)生流動(dòng)的情況(當(dāng)給定流動(dòng)時(shí)，難以給定總是均勻的流動(dòng)速度，并且裝置結(jié)構(gòu)變得復(fù)雜，另外，需要的樣品量大大地增加并且溶液中的粒子或物質(zhì)可能由于流動(dòng)所產(chǎn)生的動(dòng)力作用而劣化或變質(zhì)。)相比，改善了定量檢測(cè)的結(jié)果的可靠性，并且能夠在沒有與樣品溶液中作為待檢測(cè)對(duì)象的發(fā)光粒子相對(duì)的動(dòng)力作用的影響或偽像的狀態(tài)下進(jìn)行測(cè)量。本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)典型地用于生物微粒對(duì)象的溶液的狀態(tài)分析，其中生物微粒對(duì)象為例如蛋白質(zhì)、肽、核酸、脂質(zhì)、糖鏈、氨基酸或者其團(tuán)聚體等生物分子，以及病毒和細(xì)胞等，但是也可以用于溶液中非生物粒子(例如原子、分子、膠束、金屬膠體等)的狀態(tài)分析，并且應(yīng)當(dāng)理解的是，這些情況也都包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點(diǎn)將通過對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式的以下說明變得清楚。


圖I的(A)是根據(jù)本發(fā)明的光學(xué)分析裝置的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的示意圖。圖I的(B)是共聚焦體積(共聚焦顯微鏡的觀測(cè)區(qū)域)的示意圖。圖I的(C)是用于改變鏡7的方向以使光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣品溶液中移動(dòng)的機(jī)構(gòu)的示意圖。圖2的(A)是說明通過本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)來檢測(cè)光的原理的示意圖，圖2的(B )是測(cè)得的光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化而變化的示意圖。圖3的(A)是發(fā)光粒子由于布朗運(yùn)動(dòng)而橫穿光檢測(cè)區(qū)域的情況下的模型圖，圖3的(B)是示出在該情況下光子數(shù)(光強(qiáng)度)隨時(shí)間的變化而變化的示例的圖。圖4的(A)是使得光檢測(cè)區(qū)域的位置以比發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度快的速度在樣 品溶液內(nèi)移動(dòng)時(shí)發(fā)光粒子橫穿光檢測(cè)區(qū)域的情況下的模型圖，圖4的(B)是示出在該情況下光子數(shù)(光強(qiáng)度)隨時(shí)間的變化而變化的示例的圖。圖5是說明包括檢測(cè)出的信號(hào)的二值化處理的、根據(jù)通過本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)測(cè)得的光子數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化執(zhí)行發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)的信號(hào)處理步驟的一個(gè)示例的圖。圖6是說明包括檢測(cè)出的信號(hào)的微分處理的、根據(jù)通過本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)測(cè)得的光子數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化執(zhí)行發(fā)光粒子數(shù)的計(jì)數(shù)的信號(hào)處理步驟的一個(gè)示例的圖。圖7是對(duì)通過本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)來檢測(cè)發(fā)光粒子以及對(duì)發(fā)光粒子計(jì)數(shù)的計(jì)算實(shí)驗(yàn)用模型進(jìn)行說明的圖。圖8的(A)示出通過本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)測(cè)得的時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)的示例；圖8的(B)示出經(jīng)過平滑處理的時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)(通過對(duì)時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)實(shí)施平滑處理而獲取的數(shù)據(jù));圖8的(C)示出對(duì)經(jīng)過平滑處理的時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合的高斯函數(shù)曲線。圖8的(D)示出用于確定經(jīng)過平滑處理的時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)中脈沖存在區(qū)域的處理。圖9示出通過本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)測(cè)得的光子數(shù)數(shù)據(jù)(棒狀線)、通過對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑處理而獲得的曲線(虛線)和對(duì)存在峰值的區(qū)域擬合的高斯函數(shù)(實(shí)線)的示例。圖中，附有“噪聲”的信號(hào)作為由噪聲或雜質(zhì)產(chǎn)生的信號(hào)而被忽視。圖10的(A)示出根據(jù)本發(fā)明的發(fā)光粒子數(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；圖10的(B)示出利用平板讀取器進(jìn)行的發(fā)光粒子的熒光強(qiáng)度測(cè)量實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖中，縱向條均表示三次測(cè)量的平均值，而誤差條示出三次測(cè)量的SD值。圖10的(C)是標(biāo)出與發(fā)光粒子對(duì)應(yīng)的脈沖信號(hào)的數(shù)量(脈沖數(shù))以及與各樣品溶液中的發(fā)光粒子濃度相關(guān)的光子總數(shù)(光子數(shù))的圖表，其中，在根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行發(fā)光粒子數(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)而獲得的時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)中檢測(cè)所述脈沖信號(hào)的數(shù)量，并且在同一時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)中檢測(cè)所述光子總數(shù)。
圖11示出在計(jì)算熒光強(qiáng)度波動(dòng)的傳統(tǒng)光學(xué)分析技術(shù)中獲得的光子數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化的示例，其中，圖11的(A)示出粒子濃度處于在測(cè)量中提供足夠精度的水平的情況，圖11的(B)示出樣品中的粒子濃度顯著地低于情況(A)時(shí)的情況。附圖標(biāo)記說明I—光學(xué)分析裝置(共聚焦顯微鏡)2光源3單模光纖4準(zhǔn)直透鏡5分色鏡 6、7、11反射鏡8物鏡9 顯微感光板10—井(樣品溶液容器)12聚光透鏡 13—針孔14阻斷濾片15---多模光纖16光電檢測(cè)器17鏡偏轉(zhuǎn)器17a載物臺(tái)位置改變裝置
18 計(jì)算機(jī)
具體實(shí)施例方式在下文中，詳細(xì)地描述本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式。
_2] 光學(xué)分析裝置的結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)的光學(xué)分析裝置的基本結(jié)構(gòu)可以是如圖I的(A)中示意性地示出的那樣通過將能夠被用來進(jìn)行FSC、FIDA等的共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)與光電檢測(cè)器組合而形成的裝置。參照附圖，光學(xué)分析裝置I由光學(xué)系統(tǒng)2-17和計(jì)算機(jī)18構(gòu)成，該計(jì)算機(jī)18用于獲取和分析數(shù)據(jù)并且控制光學(xué)系統(tǒng)的各部件的操作。光學(xué)分析裝置I的光學(xué)系統(tǒng)可以與通常的共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)相同，其中，從光源2發(fā)出并通過單模光纖3的內(nèi)部傳輸?shù)募す?Ex)在光纖的發(fā)射端形成以固有NA所決定的角度放射的發(fā)散光；并且在利用準(zhǔn)直透鏡4形成平行光束之后，光在分色鏡5和反射鏡6、7上反射，從而進(jìn)入到物鏡8中。典型地，在物鏡8的上方放置被分注了一至數(shù)十μ L的樣品溶液的樣品容器或者其上配置有井10的顯微感光板9，并且從物鏡8發(fā)出的激光在樣品容器或井10中的樣品溶液內(nèi)聚焦，從而形成具有強(qiáng)的光強(qiáng)度的區(qū)域(激發(fā)區(qū)域)。熒光粒子或者附有諸如熒光染料等發(fā)光標(biāo)記的粒子等作為被觀測(cè)對(duì)象的發(fā)光粒子在樣品溶液中分散或溶解，并且當(dāng)發(fā)光粒子進(jìn)入到激發(fā)區(qū)域時(shí)，發(fā)光粒子在駐留于激發(fā)區(qū)域中的過程中被激發(fā)，從而發(fā)出光。在通過物鏡8和分色鏡5之后,發(fā)出的光(Em)在鏡11上反射并且被聚光透鏡12會(huì)聚,然后光通過針孔13、透過阻斷濾片14 (在這里僅選擇處于特定波長帶區(qū)域的光分量)并被導(dǎo)入多模光纖15中，從而到達(dá)光電檢測(cè)器16，并且在轉(zhuǎn)換為時(shí)間序列電信號(hào)之后，該信號(hào)被輸入到計(jì)算機(jī)18中，在計(jì)算機(jī)18中以稍后說明的方式執(zhí)行用于光學(xué)分析的處理。在這方面，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的，在上述結(jié)構(gòu)中，針孔13位于物鏡8的聚焦位置的共軛位置處，因此，僅從如圖I的(B)中示意性地示出的激光的聚焦區(qū)域、即激發(fā)區(qū)域發(fā)出的光通過針孔13，而來自激發(fā)區(qū)域之外的其他區(qū)域的光被阻擋。圖I的(B)中示出的激光的聚焦區(qū)域是該光學(xué)分析裝置中的有效體積通常為大約I-IOfL的光檢測(cè)區(qū)域(典型地，光強(qiáng)度與在區(qū)域的中央具有峰值的高斯分布一致地展開。有效體積是以光強(qiáng)度減小至峰值強(qiáng)度的Ι/e2的表面為邊界的近似橢球的體積)，該有效體積稱作“共聚焦體積”。此外，由于在本發(fā)明中對(duì)來自一個(gè)發(fā)光粒子的光、例如來自一個(gè)熒光染料分子的微弱光進(jìn)行檢測(cè)，所以，優(yōu)選地，光電檢測(cè)器16使用能夠用于光子計(jì)數(shù)的超高靈敏度光電檢測(cè)器。此外，在顯微鏡的載物臺(tái)(未示出)上，可以設(shè)置用于使顯微感光板9的水平位置移動(dòng)的載物臺(tái)位置改變裝置17a，以便改變被觀測(cè)的井10。載物臺(tái)位置改變裝置17a的操作可以由計(jì)算機(jī)18控制。根據(jù)該結(jié)構(gòu)，即使存在兩個(gè)以上的樣本也能夠?qū)崿F(xiàn)快速測(cè)量。此外，在上述光學(xué)分析裝置的光學(xué)系統(tǒng)中，設(shè)置有用于改變光學(xué)系統(tǒng)的光路以利用檢測(cè)區(qū)域、即聚焦區(qū)域掃描樣品溶液的內(nèi)部，也就是使光檢測(cè)區(qū)域在樣品溶液內(nèi)移動(dòng)的 機(jī)構(gòu)。對(duì)于用于使光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的該機(jī)構(gòu)，例如，如圖I的(C)中示意性地示出的那樣，可以采用改變反射鏡7的方向的鏡偏轉(zhuǎn)器17。該鏡偏轉(zhuǎn)器17可以與配備在通常的激光掃描型顯微鏡上的電流鏡裝置中的鏡偏轉(zhuǎn)器相同。另外，為了得到光檢測(cè)區(qū)域的位置期望的移動(dòng)圖形，在計(jì)算機(jī)18的控制下與光電檢測(cè)器16的光檢測(cè)協(xié)調(diào)一致地驅(qū)動(dòng)鏡偏轉(zhuǎn)器17。光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡可以從圓形、橢圓形、矩形、直線和曲線中以單個(gè)或組合的形式任意地選擇(在計(jì)算機(jī)18中的程序中，可以設(shè)計(jì)成能夠選擇多種移動(dòng)圖形。)。如所指出的那樣，根據(jù)改變光學(xué)系統(tǒng)的光路以使光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)而不是使樣品溶液移動(dòng)的結(jié)構(gòu)，在樣品溶液中實(shí)質(zhì)上既不會(huì)發(fā)生機(jī)械振動(dòng)也不會(huì)發(fā)生流體動(dòng)力作用，使得能夠消除動(dòng)力作用對(duì)被觀測(cè)對(duì)象的影響，從而實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的測(cè)量。在這方面，待使用的物鏡典型地為浸水式物鏡，不過也可以是浸油式物鏡、浸硅膠式物鏡或干式(浸空氣式)物鏡。在浸水式物鏡的情況下，雖然未示出，但是可以通過上下移動(dòng)物鏡8而使光檢測(cè)區(qū)域的位置在上下方向上移動(dòng)。在用作被觀測(cè)對(duì)象的發(fā)光粒子通過多光子吸收而發(fā)光的情況下，上述光學(xué)系統(tǒng)被用作多光子顯微鏡。在那種情況下，由于光僅從激發(fā)光的聚焦區(qū)域(光檢測(cè)區(qū)域)發(fā)出，所以可以移除針孔13。此外，在用作被觀測(cè)對(duì)象的發(fā)光粒子不是由于激發(fā)光而是由于化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光現(xiàn)象而發(fā)光的情況下，可以省略用于產(chǎn)生激發(fā)光的光學(xué)系統(tǒng)2-5。當(dāng)發(fā)光粒子由于磷光或散射光而發(fā)光時(shí)，照原樣使用上述共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)。此外，如圖所示，在光學(xué)分析裝置I中，可以設(shè)置兩個(gè)以上的激發(fā)光源2，使得能夠根據(jù)發(fā)光粒子的激發(fā)波長適當(dāng)?shù)剡x擇激發(fā)光的波長。類似地，也可以設(shè)置兩個(gè)以上的光電檢測(cè)器16，使得當(dāng)樣品包含波長彼此不同的兩種以上的發(fā)光粒子時(shí)，能夠根據(jù)波長對(duì)分別來自這些發(fā)光粒子的光分開地進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)的原理諸如FCS和FIDA等光譜分析技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于，與傳統(tǒng)的生化分析技術(shù)相比，需要的樣品量極少并且能夠迅速地進(jìn)行試驗(yàn)。然而，在諸如FCS和FIDA等這些光譜分析技術(shù)中，從原理上講是基于熒光強(qiáng)度波動(dòng)來計(jì)算被觀測(cè)粒子的濃度和特性，所以，為了獲得精確的測(cè)量結(jié)果，樣品溶液中的被觀測(cè)粒子的濃度或數(shù)密度應(yīng)當(dāng)處于如圖11的(A)所示意性地繪出的那樣在測(cè)量熒光強(qiáng)度的過程中光檢測(cè)區(qū)域CV內(nèi)總是存在大約一個(gè)被觀測(cè)粒子的水平，使得如圖中右手側(cè)所示出的那樣在測(cè)量時(shí)間內(nèi)總是能夠檢測(cè)到顯著的光強(qiáng)度(光子數(shù))。當(dāng)被觀測(cè)粒子的濃度或數(shù)密度低于上述水平、例如處于如圖11的(B)所繪出的、被觀測(cè)粒子很少進(jìn)入到光檢測(cè)區(qū)域CV內(nèi)的水平時(shí)，如圖中右手側(cè)所示，在一部分測(cè)量時(shí)間中將不會(huì)出現(xiàn)顯著的光強(qiáng)度(光子數(shù))，因此，精確地計(jì)算光強(qiáng)度波動(dòng)會(huì)變得困難。另外，當(dāng)被觀測(cè)粒子的濃度顯著地低于在測(cè)量過程中光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)總是存在大約一個(gè)被觀測(cè)粒子的水平時(shí)，光強(qiáng)度波動(dòng)的計(jì)算會(huì)受到背景的影響，為了獲得足夠用于計(jì)算的顯著數(shù)量的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)(光子數(shù))，應(yīng)當(dāng)延長測(cè)量時(shí)間。為此，在本發(fā)明中，提出了一種基于新的原理的光學(xué)分析技術(shù)，即使當(dāng)被觀測(cè)粒子的濃度低于諸如FCS和FIDA等上述光譜分析技術(shù)中所要求的水平時(shí)，該光學(xué)分析技術(shù)也能 夠檢測(cè)被觀測(cè)粒子的諸如數(shù)密度或濃度等特性。在本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)中，簡要地說，在進(jìn)行處理時(shí)，與通過驅(qū)動(dòng)用于使光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的機(jī)構(gòu)(鏡偏轉(zhuǎn)器17)以改變光路從而如圖2中所示意性地繪出的那樣使得光檢測(cè)區(qū)域CV的位置在樣品溶液中移動(dòng)、即利用光檢測(cè)區(qū)域掃描樣品溶液的內(nèi)部一起進(jìn)行光檢測(cè)。因此，例如，如在圖2的(A)中，在使光檢測(cè)區(qū)域CV移動(dòng)的過程中(圖中，時(shí)間t0至t2)，當(dāng)光檢測(cè)區(qū)域CV通過存在一個(gè)發(fā)光粒子(圖中為熒光染料)的區(qū)域時(shí)(tl)，如圖2的(B)所示將檢測(cè)到顯著的光強(qiáng)度(Em)。因此，通過在如上所述執(zhí)行使光檢測(cè)區(qū)域CV的位置移動(dòng)和光檢測(cè)的過程中逐個(gè)地檢測(cè)如圖2的(B)所示的那樣出現(xiàn)的各顯著的光強(qiáng)度，而單個(gè)地檢測(cè)發(fā)光粒子，并且通過對(duì)發(fā)光粒子數(shù)計(jì)數(shù)，能夠獲取關(guān)于測(cè)量區(qū)域內(nèi)存在的發(fā)光粒子的數(shù)量、濃度或數(shù)密度的信息。應(yīng)當(dāng)理解的是，在本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)的原理中，沒有執(zhí)行諸如計(jì)算熒光強(qiáng)度波動(dòng)等統(tǒng)計(jì)計(jì)算處理，而是逐個(gè)地檢測(cè)發(fā)光粒子，因此，即使在發(fā)光粒子(被觀測(cè)粒子)的濃度處于在FCS和FIDA中不能夠進(jìn)行足夠精確的分析的低的水平的樣品溶液中，也能夠獲取關(guān)于發(fā)光粒子的濃度或數(shù)密度的信息。本發(fā)明的光學(xué)分析裝置的操作和操作過程具體地，在利用如圖I的(A)所示的本發(fā)明的光學(xué)分析裝置I的光學(xué)分析中，執(zhí)行
(I)測(cè)量包含發(fā)光粒子(被觀測(cè)粒子)的樣品溶液的光強(qiáng)度的過程和(2)分析測(cè)得的光強(qiáng)度的過程。( I)樣品溶液的光強(qiáng)度的測(cè)量在本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)中用作被觀測(cè)對(duì)象的粒子可以是任意粒子，只要該粒子分散在樣品溶液中并且在樣品溶液中隨機(jī)地移動(dòng)即可、諸如溶解的分子等，例如，粒子可以是生物分子，即蛋白質(zhì)、肽、核酸、脂質(zhì)、糖鏈、氨基酸等或者這些生物分子的團(tuán)聚體，也可以是病毒、細(xì)胞、金屬膠體或其他非生物分子。當(dāng)用作被觀測(cè)對(duì)象的粒子不是發(fā)光粒子時(shí)，使用以任意方式將發(fā)光標(biāo)記(突光分子、磷光分子、化學(xué)發(fā)光分子或生物發(fā)光分子)貼附于被觀測(cè)粒子而制備的粒子。樣品溶液典型地為水溶液，然而不限于此，也可以使用有機(jī)溶劑和其他任意液體。除了在測(cè)量過程中驅(qū)動(dòng)鏡偏轉(zhuǎn)器17以使光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣品溶液內(nèi)移動(dòng)(以在樣品溶液內(nèi)部掃描)之外，可以以與FCS或FIDA中的光強(qiáng)度測(cè)量過程相同的方式在本發(fā)明的光學(xué)分析中進(jìn)行光強(qiáng)度的測(cè)量。在操作過程中，典型地，在將樣品溶液分注到顯微感光板9的井10內(nèi)并且將其放在顯微鏡的載物臺(tái)上之后，當(dāng)使用者向計(jì)算機(jī)18輸入測(cè)量開始的命令時(shí)，計(jì)算機(jī)18執(zhí)行存儲(chǔ)在存儲(chǔ)裝置(未示出)中的程序(改變光路以使光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣品溶液內(nèi)移動(dòng)的進(jìn)程，和在使光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的過程中從光檢測(cè)區(qū)域檢測(cè)光的進(jìn)程)，因此將啟動(dòng)利用激發(fā)光對(duì)樣品溶液中的光檢測(cè)區(qū)域的照明和測(cè)量光強(qiáng)度。在該測(cè)量過程中，根據(jù)程序在計(jì)算機(jī)18的操作過程的控制下，鏡偏轉(zhuǎn)器17驅(qū)動(dòng)鏡7 (電流鏡)以使光檢測(cè)區(qū)域的位置在井10內(nèi)移動(dòng)，與此同時(shí)，光電檢測(cè)器16順次地將檢測(cè)到的光轉(zhuǎn)換成電信號(hào)并將該電信號(hào)傳輸至計(jì)算機(jī)18，計(jì)算機(jī)18將傳輸?shù)墓庑盘?hào)生成時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)并且以任意方式將該時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)存儲(chǔ)起來。在這方面，光電檢測(cè)器16典型地為能夠檢測(cè)單個(gè)光子的到達(dá)的超高靈密度光電檢測(cè)器，因此，時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)可以是時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)。在測(cè)量光強(qiáng)度的過程中光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度可以是例如通過實(shí)驗(yàn)或者為了滿足分析的目的而任意設(shè)定的預(yù)定速度。在基于檢測(cè)到的發(fā)光粒子數(shù)來獲取關(guān)于數(shù)密度和濃度的信息的情況下，需要知道光檢測(cè)區(qū)域通過的區(qū)域的尺寸或體積，因此，以使得能夠掌握移動(dòng)距離的方式進(jìn)行光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)。在這方面，因?yàn)槿绻?jīng)過時(shí)間與光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)距離基本上成比例，則測(cè)量結(jié)果的解釋將變得容易，所以，優(yōu)選的是移動(dòng)速度恒定，然而不限于此。順便提一句，關(guān)于光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度，為了根據(jù)測(cè)得的時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)或者對(duì)發(fā)光粒子數(shù)的計(jì)數(shù)來定量地、精確地、單個(gè)地檢測(cè)發(fā)光粒子，優(yōu)選的是，將移動(dòng)速度設(shè)定為比發(fā)光粒子的隨機(jī)運(yùn)動(dòng)、即布朗運(yùn)動(dòng)中的移動(dòng)速度快的值。由于本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)中的被觀測(cè)粒子是分散或溶解到溶液中并且自由地隨機(jī)移動(dòng)的粒子，所以其位置由于布朗運(yùn)動(dòng)而隨時(shí)間移動(dòng)。因此，當(dāng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度比粒子的由于布朗運(yùn)動(dòng)而移動(dòng)的速度慢時(shí)，粒子將如圖3的(A)中所示意性地繪出的那樣在區(qū)域中隨機(jī)地移動(dòng)，從而如圖3的(B)所示，光強(qiáng)度隨機(jī)地變化(如已經(jīng)指出的，光檢測(cè)區(qū)域中的激發(fā)光強(qiáng)度從區(qū)域的中央處的峰值朝向外側(cè)降低)，使得確定與各發(fā)光粒子對(duì)應(yīng)的顯著的光強(qiáng)度變化變得困難。因此，優(yōu)選地，如圖4的(A)所繪出的那樣，光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度被設(shè)定為比粒子的由于布朗運(yùn)動(dòng)而移動(dòng)的平均移動(dòng)速度(擴(kuò)散移動(dòng)速度)快，使得粒子將近似直線地橫穿光檢測(cè)區(qū)域，并且如圖4的(B)所示，與各個(gè)發(fā)光粒子對(duì)應(yīng)的光強(qiáng)度的變化的輪廓在時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中變得幾乎一致(當(dāng)發(fā)光粒子近似直線地通過光檢測(cè)區(qū)域時(shí)，光強(qiáng)度變化的輪廓與激發(fā)光強(qiáng)度分布類似)，并且能夠容易地確定各發(fā)光粒子與光強(qiáng)度之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。具體地，擴(kuò)散系數(shù)為D的發(fā)光粒子由于布朗運(yùn)動(dòng)而通過半徑為Wo的光檢測(cè)區(qū)域(共聚焦體積)所需的時(shí)間At由均方位移關(guān)系的表達(dá)式 (2ffo) 2=6D · At(I)給出，為At=(2ffo)2/6D — (2)因此，發(fā)光粒子由于布朗運(yùn)動(dòng)而移動(dòng)的速度(擴(kuò)散移動(dòng)速度)Vdif近似為Vdif=2ffo/At=3D/ffo(3)因此，參照該公式，可以將光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度設(shè)定為比Vdif充分快的值。例如，假設(shè)Wo為大約O. 62 μ m,當(dāng)被觀測(cè)粒子的擴(kuò)散系數(shù)預(yù)計(jì)大約為D=2. OX 10_1(lm2/S時(shí)，Vdif將為I. OX 10_3m/s，因此，可以將光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度設(shè)定為Vdif的10倍以上，例如15mm/s。在這方面，當(dāng)被觀測(cè)粒子的擴(kuò)散系數(shù)未知時(shí)，可以通過設(shè)定光檢測(cè)區(qū)域的位置的各種移動(dòng)速度而反復(fù)地執(zhí)行預(yù)備試驗(yàn)以找出光強(qiáng)度變化的輪廓變成期望的輪廓(典型地，與激發(fā)光強(qiáng)度分布類似)的條件，以此來確定光檢測(cè)區(qū)域的位置的適當(dāng)?shù)囊苿?dòng)速度。(2)光強(qiáng)度的分析當(dāng)通過上述過程獲得了樣品溶液的時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)時(shí)，通過根據(jù)存儲(chǔ)在存儲(chǔ)裝置中的程序的處理(從檢測(cè)到的光中對(duì)各發(fā)光粒子的光信號(hào)單個(gè)地進(jìn)行檢測(cè)的進(jìn)程)，可以在計(jì)算機(jī)18中進(jìn)行如下所述的光強(qiáng)度的分析。(i) 一個(gè)發(fā)光粒子的檢測(cè)
當(dāng)一個(gè)發(fā)光粒子通過光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的軌跡如圖4的(A)中所示近似為直線時(shí)，在時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中與該發(fā)光粒子對(duì)應(yīng)的光強(qiáng)度變化具有如圖5的(A)中所示意性地繪出的、反映光檢測(cè)區(qū)域(由光學(xué)系統(tǒng)確定)中的光強(qiáng)度分布的輪廓(通常近似為鐘形)。因此，在用于檢測(cè)發(fā)光粒子的一個(gè)方法中，為光強(qiáng)度設(shè)置閾值Ιο，當(dāng)超過閾值的光強(qiáng)度持續(xù)的時(shí)間寬度△ τ在預(yù)定范圍內(nèi)時(shí)，可以判定光強(qiáng)度的輪廓與已經(jīng)通過光檢測(cè)區(qū)域的一個(gè)發(fā)光粒子對(duì)應(yīng)，由此檢測(cè)到一個(gè)發(fā)光粒子?；趶南鄬?duì)于光檢測(cè)區(qū)域以預(yù)定的速度移動(dòng)的發(fā)光粒子發(fā)出的光的強(qiáng)度的期望的輪廓來確定光強(qiáng)度的閾值Io和時(shí)間寬度△ τ的預(yù)定范圍，具體數(shù)值可以任意地或通過實(shí)驗(yàn)來設(shè)定，也可以根據(jù)被觀測(cè)粒子的特性選擇性地確定。此外，在檢測(cè)發(fā)光粒子的另一個(gè)方法中，當(dāng)光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的光強(qiáng)度分布可以假設(shè)為高斯分布時(shí)I=A · exp (_2t2/a2) ---(4)并且，當(dāng)通過將表達(dá)式(4)與顯著的光強(qiáng)度的輪廓(能夠清楚地判定為不是背景的輪廓)擬合而算出的強(qiáng)度A和寬度a均在預(yù)定的范圍內(nèi)時(shí)，判定光強(qiáng)度輪廓與已經(jīng)通過光檢測(cè)區(qū)域的一個(gè)發(fā)光粒子對(duì)應(yīng)，由此完成一個(gè)發(fā)光粒子的檢測(cè)(強(qiáng)度A和寬度a在預(yù)定范圍之外的輪廓在分析中可以作為噪聲或雜質(zhì)而忽略)。(ii)發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)可以通過以任意方式對(duì)由上述發(fā)光粒子的檢測(cè)方法檢測(cè)到的發(fā)光粒子數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)來完成發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)。然而，對(duì)于大量的發(fā)光粒子，例如可以以下面示出的方式完成該過程。參照?qǐng)D5的(B)，在根據(jù)時(shí)間序列光強(qiáng)度(光子數(shù))數(shù)據(jù)對(duì)發(fā)光粒子數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)的方法的一個(gè)示例中，首先，對(duì)檢測(cè)出的時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)(上欄)進(jìn)行平滑處理(中欄)。由于光從發(fā)光粒子隨機(jī)地發(fā)出，因而在微小時(shí)間內(nèi)的數(shù)據(jù)值中產(chǎn)生落差，通過平滑處理可以忽視數(shù)據(jù)值中的該落差。例如可以通過移動(dòng)平均法來完成平滑處理。隨后，通過在平滑處理后的時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)中對(duì)強(qiáng)度在預(yù)定閾值以上的數(shù)據(jù)點(diǎn)(時(shí)間)分配I并且對(duì)強(qiáng)度小于閾值的數(shù)據(jù)點(diǎn)分配0，來對(duì)時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行二值化處理(下欄)。因此，在所有數(shù)據(jù)中，通過計(jì)算那些數(shù)值從I變?yōu)镺或從O變?yōu)镮的部分的數(shù)量來計(jì)算測(cè)量過程中橫穿光檢測(cè)區(qū)域的發(fā)光粒子的數(shù)量。在根據(jù)時(shí)間序列光強(qiáng)度(光子數(shù))數(shù)據(jù)對(duì)發(fā)光粒子數(shù)計(jì)數(shù)的方法的又一個(gè)示例中，對(duì)如圖5的(B)的情況那樣應(yīng)用了平滑處理的時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)(圖6的(A))應(yīng)用微分處理(圖6的(B))。在已經(jīng)應(yīng)用了微分處理的該數(shù)據(jù)中，因?yàn)樵趶?qiáng)度峰值點(diǎn)處、其值沿時(shí)間增加的方向減小并且值為O或者其二次微分值為O，所以將通過對(duì)這些點(diǎn)計(jì)數(shù)來對(duì)測(cè)量過程中橫穿光檢測(cè)區(qū)域的發(fā)光粒子數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。(iii)發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度的確定當(dāng)已經(jīng)完成了發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)時(shí)，可以使用光檢測(cè)區(qū)域通過的總區(qū)域的體積來確定發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度。然而，光檢測(cè)區(qū)域的有效體積取決于激發(fā)光或檢測(cè)出的光的波長、透鏡的數(shù)值孔徑以及光學(xué)系統(tǒng)的調(diào)整狀態(tài)而變化，因此，難以從設(shè)計(jì)參數(shù)值來計(jì)算光檢測(cè)區(qū)域的有效體積。因此，在本實(shí)施方式中，在與測(cè)量待試驗(yàn)樣品溶液的條件相同的條件下、利用發(fā)光粒子濃度已知的溶液(對(duì)照溶液)按照上述說明來進(jìn)行光強(qiáng)度測(cè)量、發(fā)光粒子的檢測(cè)以及發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)，然后，根據(jù)檢測(cè)出的發(fā)光粒子的數(shù)量和對(duì)照溶液中發(fā)光粒子的濃度，可以確定光檢測(cè)區(qū)域通過的總區(qū)域的體積、即檢測(cè)出的發(fā)光粒子的數(shù)量與發(fā)光粒子的濃度之間的關(guān)系。優(yōu)選地，對(duì)照溶液的發(fā)光粒子可以是波長特征與被觀測(cè)粒子相同的發(fā)光標(biāo)記(熒光染料等)。具體地，例如，假設(shè)在發(fā)光粒子濃度為C的對(duì)照溶液中檢測(cè)出的發(fā) 光粒子的數(shù)量為N，那么光檢測(cè)區(qū)域通過的總區(qū)域的體積Vt由下式給出Vt=N/C(5)可替代地，制備發(fā)光粒子濃度不同的多種溶液作為對(duì)照溶液，并且對(duì)各溶液進(jìn)行測(cè)量，然后，將計(jì)算出的Vt的平均值確定為光檢測(cè)區(qū)域通過的總區(qū)域的體積vt。因此，當(dāng)給定Vt時(shí)，發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)結(jié)果為η的樣品溶液的發(fā)光粒子的數(shù)密度C由下式給出c=n/Vt ---(6)在這方面，光檢測(cè)區(qū)域的體積和光檢測(cè)區(qū)域通過的總區(qū)域的體積可以通過任意方法給出，例如代替上述方法而采用FCS和FIDA。此外，在本實(shí)施方式的光學(xué)分析裝置中，對(duì)于假設(shè)的光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)圖形，可以將與各種標(biāo)準(zhǔn)發(fā)光粒子的濃度C與發(fā)光粒子數(shù)N之間的關(guān)系(表達(dá)式(5))有關(guān)的信息預(yù)先存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)18的存儲(chǔ)裝置中，使得裝置的使用者在進(jìn)行光學(xué)分析時(shí)能夠適當(dāng)?shù)厥褂门c該關(guān)系有關(guān)的存儲(chǔ)信息。計(jì)算實(shí)驗(yàn)為了確認(rèn)根據(jù)本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)的原理獲得了與樣品溶液中的發(fā)光粒子的數(shù)密度對(duì)應(yīng)的發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)結(jié)果，進(jìn)行如下計(jì)算實(shí)驗(yàn)。圖7示出對(duì)計(jì)算實(shí)驗(yàn)中假設(shè)的模型進(jìn)行說明的圖。參照該圖，在計(jì)算實(shí)驗(yàn)中，首先設(shè)想如下模型在該模型中，邊長為L的正方體以正方體的中心成為坐標(biāo)系的原點(diǎn)的方式放置在X-Y-Z坐標(biāo)系中，并且正如發(fā)光粒子在樣品溶液中自由地隨機(jī)移動(dòng)那樣，使得擴(kuò)散系數(shù)為D的8個(gè)粒子的位置在正方體內(nèi)每隔時(shí)間寬度At=IOy秒沿隨機(jī)的方向發(fā)生移位。正方體的邊長L根據(jù)粒子濃度來設(shè)定例如，當(dāng)粒子濃度設(shè)定為IOpM時(shí)，正方體的邊長被設(shè)定為L=Il. Oym0在這方面，為了使得正方體中總是存在8個(gè)粒子從而維持初始設(shè)定的濃度，進(jìn)行如下設(shè)計(jì)當(dāng)粒子移動(dòng)超過正方體的界面(X，Y，Z=土L/2的平面)時(shí)，使粒子從相對(duì)的界面再次進(jìn)入到正方體中(例如，當(dāng)某粒子超過X=L/2的平面時(shí)，使粒子從X=_L/2的平面進(jìn)入到正方體中)。此外，典型地，期望的是，從樣品溶液中實(shí)際的發(fā)光粒子獲得的光強(qiáng)度根據(jù)高斯分布從光檢測(cè)區(qū)域的中央處的峰值沿徑向變化，因此，在正方體中，以原點(diǎn)為中心的光強(qiáng)度分布被設(shè)定為
I=A · exp[-2 (X2+Y2+Z2) /ffo2] — (7)從而假設(shè)在正方體中位于坐標(biāo)點(diǎn)(X，Y，Z)的粒子發(fā)出由表達(dá)式(7)給定的光。在表達(dá)式(7 )中，A是中心處的強(qiáng)度，其中設(shè)定A=I，Wo是光束束腰，其被設(shè)定為Wo=620nm。半徑為Wo的球體與有效光檢測(cè)區(qū)域?qū)?yīng)，該有效光檢測(cè)區(qū)域的體積被設(shè)定為大約lfL。此外，在本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)中，使得光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣品溶液中移動(dòng)。即，也可以說成樣品溶液的空間相對(duì)于光檢測(cè)區(qū) 域移動(dòng)。因此，在模型中，為了對(duì)光檢測(cè)區(qū)域以移動(dòng)速度V在空間(樣品溶液)內(nèi)沿-X方向移動(dòng)進(jìn)行建模，設(shè)計(jì)成將V · At沿X方向加到正方體內(nèi)的各粒子的每隔At=IOy秒的位移。圖5的(B)的上欄是在粒子濃度為IOpM的正方體中的粒子根據(jù)上述模型以光檢測(cè)區(qū)域的15mm/s的移動(dòng)速度移位了 2ms的情況下獲得的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，并且從該圖可以直觀地理解，確認(rèn)兩個(gè)粒子通過了光檢測(cè)區(qū)域并且各強(qiáng)度變化的輪廓幾乎形成高斯分布。此外，在假設(shè)具有各種濃度的正方體中的粒子根據(jù)上述模型的設(shè)定對(duì)于任意的時(shí)間產(chǎn)生位移并發(fā)光的情況下,通過依次計(jì)算該時(shí)間內(nèi)從空間發(fā)出的光強(qiáng)度的總量,產(chǎn)生了時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，并且根據(jù)上述發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)方法在獲取的時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中對(duì)發(fā)光粒子數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。在上述模型中，在粒子濃度設(shè)定為IOpM或O. ΙρΜ、光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度設(shè)定為15mm/s并且測(cè)量時(shí)間(粒子的移位執(zhí)行的時(shí)間)為10秒的條件下，在重復(fù)進(jìn)行的5次發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)中，粒子的計(jì)數(shù)值的平均值和CV值(標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值)如下濃度IOpMO. IpM計(jì)數(shù)值3668個(gè)粒子 35. 6個(gè)粒子CV 值 1.7% 13. 3%如從該結(jié)果可以理解到的，獲得了幾乎與設(shè)定的粒子濃度成比例的粒子的計(jì)數(shù)值。即，該結(jié)果表明，通過在給定的測(cè)量時(shí)間、給定的光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度、利用給定強(qiáng)度的激發(fā)光對(duì)發(fā)光粒子進(jìn)行激發(fā)的條件下對(duì)諸如染料等具有特定的特性的發(fā)光粒子進(jìn)行計(jì)數(shù)，能夠獲得與發(fā)光粒子的濃度在數(shù)量上對(duì)應(yīng)的計(jì)數(shù)值，并且能夠確定發(fā)光粒子的濃度。此夕卜，除了光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度設(shè)定為60mm/s之外，當(dāng)以與上述方法相同的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，粒子的計(jì)數(shù)值的平均值或CV值(標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值)如下濃度IOpMO. IpM計(jì)數(shù)值11499個(gè)粒子 126個(gè)粒子CV 值 1.1%9. 4%根據(jù)該結(jié)果，表明了，如果增大光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度，則CV值減小，從而能夠減小對(duì)發(fā)光粒子計(jì)數(shù)時(shí)的分散。此外，在粒子濃度為IfM并且光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度為100mm/s時(shí)進(jìn)行的類似實(shí)驗(yàn)中，粒子的計(jì)數(shù)值的平均值和CV值(標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值)分別變成11. 6個(gè)粒子和7. 7%。根據(jù)該結(jié)果，啟示了，在本發(fā)明中，即使被觀測(cè)粒子的濃度顯著地低于在FCS和FIDA中通常使用的濃度，也能夠進(jìn)行發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)。因此，根據(jù)不包括FCS、FIDA等中進(jìn)行的諸如熒光強(qiáng)度波動(dòng)的計(jì)算等統(tǒng)計(jì)處理的上述本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)，通過使微小區(qū)域、即光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣品溶液中移動(dòng)，也就是掃描樣品溶液的內(nèi)部，并且對(duì)橫穿光檢測(cè)區(qū)域的發(fā)光粒子單個(gè)地進(jìn)行檢測(cè)或者對(duì)發(fā)光粒子進(jìn)行計(jì)數(shù)，能夠?qū)Ρ挥^測(cè)粒子的濃度或數(shù)密度比FCS、FIDA等中使用的水平低的樣品溶液中的被觀測(cè)粒子的狀態(tài)和特性進(jìn)行檢測(cè)。在這方面，由于本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)基本上使用與FCS、FIDA等相同的光學(xué)系統(tǒng)，所以可以與FCS、FIDA等一起進(jìn)行。例如，在檢測(cè)包含兩種以上的物質(zhì)的溶液中的這些物質(zhì)之間的相互作用等的情況下，當(dāng)物質(zhì)之間的濃度差異大時(shí)，例如當(dāng)一種物質(zhì)的濃度是nM數(shù)量級(jí)而另一物質(zhì)的濃度是pM數(shù)量級(jí)時(shí)，能夠以如下方式進(jìn)行測(cè)量和分析對(duì)于高濃度的物質(zhì)采用FCS或FIDA來進(jìn)行測(cè)量和分析，而對(duì)于低濃度的物質(zhì)采用本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)來進(jìn)行測(cè)量和分析。在這樣的情況下，如圖I的(A)所示，準(zhǔn)備兩個(gè)以上的光電檢測(cè)器是有利的。為了驗(yàn)證上述本發(fā)明的有效性，進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)。在這方面，應(yīng)當(dāng)理解的是，以下實(shí)施例僅說明本發(fā)明的有效性，并非試圖限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I
使用熒光染料ΑΤΤ0633 (西格瑪奧德里奇公司(Sigma Aldrich)Cat. No. 18620)作為發(fā)光粒子來檢驗(yàn)?zāi)軌蚶帽景l(fā)明測(cè)量的樣品溶液中的發(fā)光粒子的濃度范圍。在這方面，作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，也測(cè)量發(fā)光粒子濃度的范圍，該發(fā)光粒子濃度的范圍能夠根據(jù)熒光強(qiáng)度來測(cè)量，而熒光強(qiáng)度利用平板讀取器測(cè)得。對(duì)于樣品溶液，制備ATT0633的濃度分別為OfM (不含染料)、10fM、100fM、ΙρΜ、10pM、100pM和InM的包含ATT0633的磷酸鹽緩沖液(包含O. 05%的吐溫20)。在這方面，還為對(duì)照實(shí)驗(yàn)制備了包含濃度為IOnM和IOOnM的ATT0633的溶液。在根據(jù)本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)的測(cè)量中，使用配備有共聚焦熒光顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)系統(tǒng)的單分子熒光測(cè)量裝置MF-20 (奧林巴斯公司)作為光學(xué)分析裝置，并且根據(jù)上述“(I)樣品溶液的光強(qiáng)度的測(cè)量”中說明的方式來獲取上述各樣品溶液的時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)。對(duì)于物鏡，使用浸水式物鏡(40X，NA=L 15，WD=O. 26)。為此，光電檢測(cè)器16使用能夠檢測(cè)單個(gè)光子的到達(dá)的超高靈敏度光電檢測(cè)器，因此光檢測(cè)是以對(duì)在每個(gè)預(yù)定的單位時(shí)間(BIN TIME)內(nèi)到達(dá)光電檢測(cè)器的光子數(shù)進(jìn)行測(cè)量的方式在預(yù)定時(shí)間內(nèi)順次地對(duì)光子進(jìn)行計(jì)數(shù)。因此，時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)是時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)。此外，激發(fā)光使用633nm的激光，并且利用帶通濾波器將檢測(cè)到的光波長設(shè)定為從660nm到710nm。進(jìn)行3次每次2秒的測(cè)量，其中光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣品溶液中的移動(dòng)速度設(shè)定為15mm/秒并且BIN TIME設(shè)定為10μ秒。圖8的(A)中示出通過2秒的測(cè)量而獲得的時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)的示例。在上述光強(qiáng)度測(cè)量之后，對(duì)于各樣品溶液根據(jù)以下處理過程對(duì)在獲取的時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)中檢測(cè)出的光信號(hào)進(jìn)行計(jì)數(shù)(a)時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)的平滑處理一通過移動(dòng)平均法對(duì)時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑處理。一次平均的數(shù)據(jù)點(diǎn)為9個(gè)點(diǎn)，并且重復(fù)進(jìn)行5次移動(dòng)平均處理。圖8的(B)示出對(duì)圖8的(A)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑處理的結(jié)果。(b)時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)中的脈沖狀信號(hào)存在區(qū)域的檢測(cè)——確定出在通過(a)處理獲得的平滑處理之后在時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)中各脈沖狀信號(hào)的起始點(diǎn)和終止點(diǎn)，并且限定出脈沖狀信號(hào)存在的區(qū)域。具體地，首先，對(duì)于平滑處理之后的全部時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)，計(jì)算出相對(duì)于時(shí)間的一次微分值，以準(zhǔn)備時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)的微分值數(shù)據(jù)。然后，參照時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)的微分值數(shù)據(jù)的數(shù)值，如圖8的(D)中所示意性地示出的那樣，將脈沖狀信號(hào)的微分值的變化變大時(shí)的點(diǎn)選作脈沖狀信號(hào)的起始點(diǎn)，而將脈沖狀信號(hào)的微分值的變化變小時(shí)的點(diǎn)選作脈沖狀信號(hào)的終止點(diǎn)，從而將起始點(diǎn)和終止點(diǎn)之間的區(qū)域限定為脈沖狀信號(hào)存在區(qū)域。對(duì)于全部時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行脈沖狀信號(hào)存在區(qū)域的限定。(C)鐘形函數(shù)的擬合一作為鐘形函數(shù)，將高斯函數(shù)的表達(dá)式(4)與過程(b)中限定的各脈沖狀信號(hào)存在區(qū)域擬合。通過最小二乘法進(jìn)行擬合，其中確定峰值強(qiáng)度A、峰值寬度(最大值的一半時(shí)的全寬度)a以及(高斯函數(shù)中的)相關(guān)系數(shù)。圖8的(C)示出與圖8的
(B)的數(shù)據(jù)擬合了的函數(shù)。(d)發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)——參照擬合的函數(shù)的峰值強(qiáng)度、峰值寬度和相關(guān)系數(shù)，僅將滿足以下條件20 μ秒<峰值寬度<40(^秒峰值強(qiáng)度> I (光子/10 μ秒)一(A) 相關(guān)系數(shù)>0.95的脈沖狀信號(hào)判定為與發(fā)光粒子對(duì)應(yīng)的光信號(hào)，而不滿足上述條件的脈沖狀信號(hào)作為噪聲而被忽視，對(duì)被判定為與發(fā)光粒子對(duì)應(yīng)的光信號(hào)的信號(hào)的數(shù)量作為“脈沖數(shù)”進(jìn)行計(jì)數(shù)。圖9示出被判定為發(fā)光粒子的光信號(hào)的信號(hào)的示例和被判定為噪聲的信號(hào)的示例。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，利用平板讀取器SH_80001ab (Corona公司)對(duì)上述各樣品溶液測(cè)量熒光強(qiáng)度。激發(fā)光波長設(shè)定為633nm ;檢測(cè)到的光的波長為657nm ;激發(fā)側(cè)和檢測(cè)側(cè)的帶寬均設(shè)定為12nm。在測(cè)量熒光強(qiáng)度時(shí)，進(jìn)行3次測(cè)量，每次測(cè)量應(yīng)用50次激發(fā)光激發(fā)，并且將3次測(cè)量的平均值作為最終的熒光強(qiáng)度值。圖10的(A)和(B)分別示出在各個(gè)濃度的樣品溶液中檢測(cè)出的上述本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)的測(cè)量結(jié)果(脈沖數(shù))和對(duì)照實(shí)驗(yàn)中的測(cè)量結(jié)果(熒光強(qiáng)度)(各值分別為三次測(cè)量的平均值)。首先參照?qǐng)D10的(A)，根據(jù)本發(fā)明測(cè)得的脈沖數(shù)(被算作發(fā)光粒子的光信號(hào)的信號(hào)數(shù))在發(fā)光粒子濃度為IOOfM以上的范圍內(nèi)幾乎與發(fā)光粒子濃度成比例地增大。根據(jù)該結(jié)果，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)使得能夠逐個(gè)地檢測(cè)發(fā)光粒子，并且發(fā)現(xiàn)，通過根據(jù)本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)對(duì)單個(gè)發(fā)光粒子進(jìn)行計(jì)數(shù)，能夠定量地確定發(fā)光粒子的濃度。此外，雖然在圖10的(B)的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中不能辨別出在發(fā)光粒子濃度為OM情況下的熒光強(qiáng)度和發(fā)光粒子濃度為IOOpM情況下的熒光強(qiáng)度之間存在顯著差異，但是，在圖10的(A)的本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)中，可以看出發(fā)光粒子為OM情況下的脈沖數(shù)和發(fā)光粒子為IOOfM情況下的脈沖數(shù)之間存在著顯著的差異。這些結(jié)果的原因被認(rèn)為如下在利用平板讀取器測(cè)量的熒光強(qiáng)度中，由于噪聲或雜質(zhì)而產(chǎn)生的光信號(hào)被重疊，因此，在噪聲或雜質(zhì)對(duì)熒光強(qiáng)度的貢獻(xiàn)相對(duì)大的低濃度范圍內(nèi)，S/N比變差。另一方面，在本發(fā)明的情況下，判定時(shí)間序列光信號(hào)數(shù)據(jù)中的各脈沖狀信號(hào)是否與發(fā)光粒子相對(duì)應(yīng)，并且忽視被判定為噪聲或雜質(zhì)的信號(hào)(見圖9)，因此，即使在噪聲或雜質(zhì)對(duì)熒光強(qiáng)度的貢獻(xiàn)相對(duì)大的低濃度區(qū)域中，S/N比也維持得比較良好。實(shí)際上，如圖10的(C)所示，關(guān)于根據(jù)本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)對(duì)各樣品溶液測(cè)量2秒而測(cè)得的時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)中的總光子數(shù)，在發(fā)光粒子濃度小于IOOpM的范圍內(nèi)，未觀測(cè)到與發(fā)光粒子濃度為OM的情況相比有顯著差異。即，已經(jīng)表明，根據(jù)本發(fā)明，代替對(duì)時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)中的光子數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，通過從時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)檢測(cè)發(fā)光粒子的光信號(hào)并且計(jì)算其數(shù)量，顯著地改善了濃度檢測(cè)的靈敏度(在本實(shí)施例的情況下，能夠測(cè)量兩位數(shù)的低濃度。)。因此，已經(jīng)表明，根據(jù)本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)，對(duì)于比利用熒光強(qiáng)度的傳統(tǒng)方法所能夠測(cè)量的數(shù)密度或濃度的極限低的濃度范圍，能夠確定發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度。此外，雖然諸如FCS、FIDA和PCH等包括例如熒光強(qiáng)度波動(dòng)的計(jì)算等統(tǒng)計(jì)處理的光學(xué)分析技術(shù)中能夠測(cè)量的粒子濃度的下限為大約InM，但是本實(shí)施例中能夠測(cè)量的粒子濃度的下限為 IOOfM,因此也表明，根據(jù)本發(fā)明，也能夠?qū)舛缺戎T如FCS、FIDA和PCH等光學(xué)分析技術(shù)的情況的濃度顯著低的范圍內(nèi)的粒子進(jìn)行測(cè)量。實(shí)施例2確認(rèn)的是，可以利用干式物鏡實(shí)現(xiàn)利用本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)檢測(cè)發(fā)光粒子。除了物鏡使用干式物鏡(40X，NA=O. 95，WD=O. 18)之
權(quán)利要求
1.一種光學(xué)分析裝置，其通過使用共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)對(duì)來自發(fā)光粒子的光進(jìn)行檢測(cè)，所述發(fā)光粒子分散在樣品溶液中且在所述樣品溶液中隨機(jī)地移動(dòng)，其特征在于，所述光學(xué)分析裝置包括 光檢測(cè)區(qū)域移動(dòng)部，其通過改變所述光學(xué)系統(tǒng)的光路來使所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置在所述樣品溶液中移動(dòng)； 光檢測(cè)部，其對(duì)來自所述光檢測(cè)區(qū)域的光進(jìn)行檢測(cè)；和 信號(hào)處理部，其在由所述光檢測(cè)部在所述光檢測(cè)區(qū)域的位置在所述樣品溶液中移動(dòng)的過程中檢測(cè)到的光中單個(gè)地檢測(cè)來自每個(gè)發(fā)光粒子的光信號(hào)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的裝置，其特征在于，所述信號(hào)處理部對(duì)單個(gè)地檢測(cè)到的來自所述發(fā)光粒子的所述光信號(hào)的數(shù)量計(jì)數(shù)，以對(duì)在所述光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的過程中檢測(cè)到的所述發(fā)光粒子的數(shù)量計(jì)數(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的裝置，其特征在于，所述光檢測(cè)區(qū)域移動(dòng)部使所述光檢測(cè)區(qū)域的位置以預(yù)定的速度移動(dòng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3中的任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述光檢測(cè)區(qū)域移動(dòng)部使所述光檢測(cè)區(qū)域的位置以比所述發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度快的速度移動(dòng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4中的任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述信號(hào)處理部基于由所述光檢測(cè)部檢測(cè)到的時(shí)間序列光信號(hào)的形狀來檢測(cè)是否有一個(gè)發(fā)光粒子進(jìn)入到所述光檢測(cè)區(qū)域中。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至5中的任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，當(dāng)強(qiáng)度比預(yù)定閾值大的光信號(hào)被檢測(cè)到時(shí)，所述信號(hào)處理部檢測(cè)到一個(gè)發(fā)光粒子進(jìn)入到所述光檢測(cè)區(qū)域中。
7.根據(jù)權(quán)利要求I至6中的任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述信號(hào)處理部基于檢測(cè)到的發(fā)光粒子的數(shù)量來確定所述樣品溶液中的所述發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度。
8.根據(jù)權(quán)利要求I至7中的任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，能夠基于所述發(fā)光粒子的特性、所述樣品溶液中的所述發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度來改變所述光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度。
9.根據(jù)權(quán)利要求I至9中的任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡能夠從圓形、橢圓形、矩形、直線和曲線中選擇。
10.一種光學(xué)分析方法，其通過使用共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)對(duì)來自發(fā)光粒子的光進(jìn)行檢測(cè)，所述發(fā)光粒子分散在樣品溶液中且在所述樣品溶液中隨機(jī)地移動(dòng)，其特征在于，所述方法包括如下步驟 通過改變所述光學(xué)系統(tǒng)的光路使所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置在所述樣品溶液中移動(dòng)； 在使所述光檢測(cè)區(qū)域的位置在所述樣品溶液中移動(dòng)的同時(shí)對(duì)來自所述光檢測(cè)區(qū)域的光進(jìn)行檢測(cè)；和 在檢測(cè)到的光中單個(gè)地檢測(cè)來自每個(gè)發(fā)光粒子的光信號(hào)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述方法還包括如下步驟對(duì)單個(gè)地檢測(cè)到的來自所述發(fā)光粒子的所述光信號(hào)的數(shù)量計(jì)數(shù)，以對(duì)在所述光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的過程中檢測(cè)到的所述發(fā)光粒子的數(shù)量計(jì)數(shù)。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的方法，其特征在于，在使所述光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的步驟中，使所述光檢測(cè)區(qū)域的位置以預(yù)定的速度移動(dòng)。
13.根據(jù)權(quán)利要求10至12中的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在使所述光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的步驟中，使所述光檢測(cè)區(qū)域的位置以比所述發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度快的速度移動(dòng)。
14.根據(jù)權(quán)利要求10至13中的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在單個(gè)地檢測(cè)來自每個(gè)所述發(fā)光粒子的光信號(hào)的步驟中，基于由所述光檢測(cè)部檢測(cè)到的時(shí)間序列光信號(hào)的形狀來檢測(cè)是否有一個(gè)發(fā)光粒子進(jìn)入到所述光檢測(cè)區(qū)域中。
15.根據(jù)權(quán)利要求10至14中的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，當(dāng)強(qiáng)度比預(yù)定閾值大的光信號(hào)被檢測(cè)到時(shí)，檢測(cè)到一個(gè)發(fā)光粒子進(jìn)入到所述光檢測(cè)區(qū)域中。
16.根據(jù)權(quán)利要求10至15中的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法還包括如下步驟基于檢測(cè)到的所述發(fā)光粒子的數(shù)量來確定所述樣品溶液中的所述發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度。
17.根據(jù)權(quán)利要求10至16中的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，基于所述發(fā)光粒子的特性、所述樣品溶液中的所述發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度來設(shè)定所述光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度。
18.一種用于光學(xué)分析的計(jì)算機(jī)程序，所述光學(xué)分析用于通過使用共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)對(duì)來自發(fā)光粒子的光進(jìn)行檢測(cè)，所述發(fā)光粒子分散在樣品溶液中且在所述樣品溶液中隨機(jī)地移動(dòng)，其特征在于，所述計(jì)算機(jī)程序使計(jì)算機(jī)執(zhí)行如下進(jìn)程 改變所述光學(xué)系統(tǒng)的光路以使所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置在所述樣品溶液中移動(dòng)； 在使所述光檢測(cè)區(qū)域的位置在所述樣品溶液中移動(dòng)的過程中對(duì)來自所述光檢測(cè)區(qū)域的光進(jìn)行檢測(cè)；和 在檢測(cè)到的光中單個(gè)地檢測(cè)來自每個(gè)發(fā)光粒子的光信號(hào)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的計(jì)算機(jī)程序，其特征在于，所述計(jì)算機(jī)程序還包括如下進(jìn)程對(duì)單個(gè)地檢測(cè)到的來自所述發(fā)光粒子的所述光信號(hào)的數(shù)量計(jì)數(shù)，以對(duì)在所述光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的過程中檢測(cè)到的所述發(fā)光粒子的數(shù)量計(jì)數(shù)。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的計(jì)算機(jī)程序，其特征在于，在改變所述光學(xué)系統(tǒng)的光路的進(jìn)程中，使所述光檢測(cè)區(qū)域的位置以預(yù)定的速度移動(dòng)。
21.根據(jù)權(quán)利要求18至20中的任一項(xiàng)所述的計(jì)算機(jī)程序，其特征在于，在改變所述光學(xué)系統(tǒng)的光路的進(jìn)程中，使所述光檢測(cè)區(qū)域的位置以比所述發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度快的速度移動(dòng)。
22.根據(jù)權(quán)利要求18至21中的任一項(xiàng)所述的計(jì)算機(jī)程序，其特征在于，在單個(gè)地檢測(cè)來自每個(gè)發(fā)光粒子的所述光信號(hào)的進(jìn)程中，基于由所述光檢測(cè)部檢測(cè)到的時(shí)間序列光信號(hào)的形狀來檢測(cè)是否有一個(gè)發(fā)光粒子進(jìn)入到所述光檢測(cè)區(qū)域中。
23.根據(jù)權(quán)利要求18至22中的任一項(xiàng)所述的計(jì)算機(jī)程序，其特征在于，當(dāng)強(qiáng)度比預(yù)定閾值大的光信號(hào)被檢測(cè)到時(shí)，檢測(cè)到一個(gè)發(fā)光粒子進(jìn)入到所述光檢測(cè)區(qū)域中。
24.根據(jù)權(quán)利要求18至23中的任一項(xiàng)所述的計(jì)算機(jī)程序，其特征在于，所述計(jì)算機(jī)程序還包括如下進(jìn)程基于檢測(cè)到的所述發(fā)光粒子的數(shù)量來確定所述樣品溶液中的所述發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度。
25.根據(jù)權(quán)利要求18至24中的任一項(xiàng)所述的計(jì)算機(jī)程序，其特征在于，基于所述發(fā)光粒子的特性、所述樣品溶液中的所述發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度來設(shè)定所述光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度。
26.根據(jù)權(quán)利要求18至25中的任一項(xiàng)所述的計(jì)算機(jī)程序，其特征在于，所述光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡能夠從圓形、橢圓形、矩形、直線和曲線中 選擇。
全文摘要
提供一種光學(xué)分析技術(shù)，其能夠?qū)σ缘偷臐舛然驍?shù)密度包含于樣品溶液中的被觀測(cè)粒子的狀態(tài)或特性進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)使用諸如共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)等能夠?qū)碜匀芤褐械奈⑿^(qū)域的光進(jìn)行檢測(cè)的光學(xué)系統(tǒng)，以在使微小區(qū)域的位置在樣品溶液中移動(dòng)的同時(shí)(在利用微小區(qū)域掃描樣品溶液的內(nèi)部的同時(shí))對(duì)來自被觀測(cè)發(fā)光粒子的光進(jìn)行檢測(cè)，由此對(duì)橫穿微小區(qū)域的內(nèi)部的發(fā)光粒子單個(gè)地進(jìn)行檢測(cè)，以使得能夠?qū)Πl(fā)光粒子計(jì)數(shù)或能夠獲取關(guān)于發(fā)光粒子的濃度或數(shù)密度的信息。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102782480SQ20118001164
公開日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2011年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月1日
發(fā)明者堀邦夫, 山口光城, 田邊哲也, 近藤圣二 申請(qǐng)人:奧林巴斯株式會(huì)社