專利名稱：用于泌尿道感染的分子標(biāo)記物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于測定作為診斷標(biāo)記物的血漿和尿中的降鈣素原水平以鑒定患有泌尿道感染的患者的體外方法、用于執(zhí)行所述測定的體外方法、用于診斷患有泌尿道感染的患者的試劑盒、以及降鈣素原在診斷泌尿道感染中的有用性。
背景技術(shù)：
泌尿道感染(UTI)是一個(gè)非常常見的問題，往往與尿?qū)Ч艿氖褂孟嚓P(guān)(Hooton TM 等.Clin Infect Dis. 2010Mar 1，50 (5) : 625-63)，并且通常是由腸和外生殖器中的腐生菌引起的，而在不太常見的情況下是由真菌和病毒引起的。這些有機(jī)體在某些條件下可以經(jīng)由尿道定植到泌尿道中，直至到達(dá)膀胱。在臨床上，泌尿系感染表現(xiàn)有發(fā)熱、排尿困難、痛性尿淋浙、尿頻、尿急、和中度下背痛。
所述臨床癥狀未必足以提供診斷，尤其是在重癥監(jiān)護(hù)病房中，在重癥監(jiān)護(hù)病房中， 患者往往無法交流他們的癥狀,并且各種合并癥往往會(huì)掩蓋感染的準(zhǔn)確起源。
因此，對(duì)于分離所涉及的病原體以及評(píng)估任何并發(fā)癥并鑒定出特異性療法兩者來說，都需要實(shí)驗(yàn)室檢測。
用于診斷泌尿道感染的可選技術(shù)的代表為尿培養(yǎng)。該檢測使得能夠分離引起感染的細(xì)菌，并通過抗菌譜評(píng)估對(duì)抗生素的敏感性或抗性。獲得尿培養(yǎng)結(jié)果所需要的時(shí)間取決于所涉及的微生物種類，在24至48小時(shí)之間不等。
在等待結(jié)果期間，往往執(zhí)行僅根據(jù)臨床觀察結(jié)果的經(jīng)驗(yàn)性治療，這會(huì)導(dǎo)致抗生素療法的不恰當(dāng)使用，以及進(jìn)行了完全沒有必要的(陰性的)尿培養(yǎng)的患者。
因此，非常重要的是需要鑒定出用于UTI早期診斷的新工具，所述新工具能夠預(yù)測可能的并發(fā)癥并改善結(jié)果，尤其是在某些“棘手”的情況下，例如在危重新生兒或患者中。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及用于診斷和/或監(jiān)測泌尿道感染的體外方法和試劑盒。本文所述發(fā)明是基于這一發(fā)現(xiàn)，即患者尿樣品中的降鈣素原濃度具有用于診斷泌尿道感染的預(yù)測性數(shù)值。此外，本發(fā)明人還觀察到，在患有泌尿道感染的患者中，尿中的降鈣素原濃度大于血漿的降鈣素原濃度，而在未受泌尿道感染影響的患者中，尿中的降鈣素原濃度低于血漿的降鈣素原濃度。測定尿中的降鈣素原濃度可用于診斷泌尿道感染的存在，所述診斷是通過將患者尿中的濃度值與標(biāo)準(zhǔn)值進(jìn)行比較和/或根據(jù)血漿降鈣素原濃度與尿中的降鈣素原濃度之間的比例關(guān)系。
因此，本發(fā)明的主題是用于診斷和/或監(jiān)測泌尿道感染的體外方法，所述方法包括這樣的階段，即其中測定患者的尿樣品中的降鈣素原濃度。
本發(fā)明的主題還是上述方法，所述方法還包括這樣的階段，即其中還測定了所述患者的血漿降鈣素原的濃度。
本發(fā)明的主題也是用于泌尿道感染的體外診斷和/或監(jiān)測和/或嚴(yán)重性評(píng)估的試劑盒，所述試劑盒包含用于測定尿樣品和任選的血漿樣品中的降鈣素原濃度所必需的試劑的等分試樣。
本發(fā)明的主題也是降鈣素原用于診斷和/或監(jiān)測泌尿道感染的應(yīng)用。
本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)是，能夠使用非常簡單的非侵入性方法以及比在被稱為尿培養(yǎng)的技術(shù)中使用的那些方法更快的方法來診斷和/或監(jiān)測患有泌尿道感染的患者。根據(jù)以下對(duì)某些實(shí)施方式的詳細(xì)描述，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)、特點(diǎn)和使用方法是顯而易見的，所述實(shí)施方式是作為實(shí)施例，而不是限制性的。


圖I.尿培養(yǎng)陽性的人群。該圖顯示了 10名患有泌尿道感染的患者的PCTur (尿的降鈣素原)和PCTpl (血漿的降鈣素原)的值。
圖2.尿培養(yǎng)陰性的人群。該圖顯示了 10名無泌尿道感染的患者的PCTur (尿的降鈣素原)和PCTpl (血漿的降鈣素原)的值。
圖I和2顯示，在尿培養(yǎng)陽性的人群中，10例中有9例的PCTur值大于PCTpl值， 而在屬于尿培養(yǎng)陰性人群的患者中，沒有I例患者的PCTur值大于PCTpl值。
發(fā)明詳述
本說明書提供了用于診斷和/或監(jiān)測泌尿道感染的體外方法。本發(fā)明的方法使得有可能診斷和/或監(jiān)測泌尿道感染。本發(fā)明的方法使得有可能診斷泌尿道感染的存在或不存在、根據(jù)單次測定來評(píng)估(診斷)感染的嚴(yán)重性(即，降鈣素原的濃度越高，感染就越嚴(yán)重， 第一次測定時(shí)的風(fēng)險(xiǎn)分級(jí))、以及在治療感染的過程中監(jiān)測感染的進(jìn)展。
本說明書中的術(shù)語“泌尿道感染”是指大量微生物(細(xì)菌、真菌和/或病毒)入侵正常情況下為無菌的泌尿道，如此決定了泌尿道上皮的炎性反應(yīng)。
可引起泌尿道感染的微生物的實(shí)例是大腸埃希桿菌(E.Coli)、奇異變形桿菌(Proteus Mirabilis)、幾腸球菌(Ε· Faecalis)、Saprophyticus、葡萄球菌屬 (Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、假單胞菌屬 (Pseudomonas)、白色念珠菌(Candida albicans)等。流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明，在三分之一的病例中，泌尿道感染與尿?qū)Ч艿氖褂孟嚓P(guān)。本發(fā)明可適用于帶有永久性或臨時(shí)性泌尿醫(yī)療裝置(導(dǎo)管、腎造瘺、膀胱造瘺)的患者和沒有這些裝置的所有年齡的患者兩種。
本發(fā)明的方法包括這樣的階段，即其中測定患者的尿樣品中的降鈣素原濃度。降鈣素原(PCT)是降鈣素的前體，降鈣素是由甲狀腺的髓質(zhì)神經(jīng)內(nèi)分泌C細(xì)胞產(chǎn)生的、負(fù)責(zé)鈣穩(wěn)態(tài)的激素。
有利的是，本發(fā)明的方法還包括這樣的階段，即在此期間，還測定了所述患者的血漿樣品中的降鈣素原濃度。不僅測定了尿中的降鈣素原，而且還測定了血漿中的降鈣素原， 這可以在已對(duì)其尿和血漿進(jìn)行分析的患者中更準(zhǔn)確地診斷泌尿道感染的存在或不存在。事實(shí)上，由本發(fā)明人執(zhí)行的臨床研究已經(jīng)表明，在患有泌尿道感染的所有患者中，尿中的降鈣素原的值大于血漿中的降鈣素原的值，而在陰性患者中，該值是較低的。該實(shí)施方式可用于，例如其尿降鈣素原的值不足以給出關(guān)于泌尿道感染存在或不存在的明確指征的患者， 或者呈現(xiàn)出復(fù)雜的臨床情況(例如，可能存在泌尿道感染和全身感染兩種)的患者。
一般來說，為了測定尿和/或血漿中的降鈣素原的濃度，本領(lǐng)域?qū)＜夜?、能夠用于測定生物流體中的降鈣素原濃度的任何方法，均可以被認(rèn)為適合于本說明書的目的。 例如，定量和半定量的商品化的免疫分析，例如LUMItest PCT化學(xué)發(fā)光、LIAISON BRAHMS PCT 、TRACE: KRYPTOR 、BRAHMS PCT、PCT -Q?？梢孕薷姆治鰲l件，以避免由尿基質(zhì)的組分造成的可能干擾。
測定待檢測的尿和/或血漿樣品中的降鈣素原的濃度是通過將樣品與對(duì)降鈣素原特異性的一級(jí)抗體在適當(dāng)?shù)臏囟认路跤m當(dāng)長的時(shí)間，所述一級(jí)抗體以合適的濃度懸浮在適當(dāng)?shù)木彌_液中。本說明書中的術(shù)語抗體是指完整的抗體或抗體的片段；抗體片段包括但不限于片段？(&13’)2和？&13’或單鏈抗體。
對(duì)于本說明書的目的而言，術(shù)語“對(duì)降鈣素原特異性的一級(jí)抗體”是指能夠與降鈣素原的任何部分選擇性結(jié)合的任何抗體。
目前，特定蛋白質(zhì)的選擇性抗體的開發(fā)是使用實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中教導(dǎo)的常規(guī)技術(shù)來執(zhí)行的，并且許多公司還提供了開發(fā)所述抗體的服務(wù)。因此，沒有必要在本說明書中提供關(guān)于抗體的產(chǎn)生的更多詳情，所述抗體還可以訂購自合適的公司。
因此，為了產(chǎn)生對(duì)降鈣素原特異性的一級(jí)抗體，任何標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將足以用于開發(fā)多克隆和單克隆兩種抗體。此外，對(duì)降鈣素原特異性的抗體還可以在市場上獲得(例如商業(yè)抗體，可以使用的商業(yè)抗體是Abcam公司的代碼為ab53897 (兔多克隆)、ab90489 (小鼠單克隆)、ab24454 (連接了 HRP的小鼠單克隆)、abl4817 (連接了 HRP的小鼠單克隆)的商業(yè)抗體)，并且可以用于本發(fā)明的目的，而無需在本說明書 中提供更多的詳情。關(guān)于一級(jí)抗體孵育方案的詳情是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且如果使用商業(yè)抗體，則供應(yīng)商的說明書中給出了詳情。這些孵育方案包括使用合適的緩沖液，例如PBS (磷酸鹽緩沖鹽溶液)或者如果使用商業(yè)抗體，則為制造商特別推薦的緩沖液。
為了檢測一級(jí)抗體，一級(jí)抗體可以標(biāo)記有選自以下的在抗體標(biāo)記中常用的任何化合物，并且在特定情況下，可以使用熒光團(tuán)羥基香豆素、氨基香豆素、甲氧基香豆素、銪、 釤、FITC、Cy3、Cy5、Cy2、Cy7、XL665或酶例如堿性磷酸酶或過氧化物酶。
可選地，如果使用了未直接標(biāo)記的一級(jí)抗體，則可以使用任何標(biāo)記的第二抗體來檢測一級(jí)抗體，第二抗體選擇性地識(shí)別所述一級(jí)抗體。正如在文獻(xiàn)中已知的，第二抗體是對(duì)一級(jí)抗體的恒定區(qū)、也稱為Fe部分特異性的，而恒定區(qū)又取決于開發(fā)一級(jí)抗體本身時(shí)所用的動(dòng)物的類型。換言之，正是用所涉及的表位(一級(jí)抗體)免疫時(shí)所用的動(dòng)物的類型限定了第二抗體的性質(zhì)，因此，例如，如果一級(jí)抗體是從兔中獲得的，那么第二抗體就是抗兔的；如果被免疫的動(dòng)物是羊，那么第二抗體就是抗羊的；如果一級(jí)抗體是在小鼠中開發(fā)出來的，那么第二抗體就是抗小鼠的第二抗體；等等。
第二抗體可以標(biāo)記有選自以下的在抗體標(biāo)記中常用的任何化合物，并且在特定情況下，可以使用熒光團(tuán)羥基香豆素、氨基香豆素、甲氧基香豆素、銪、釤、FITC、Cy3, Cy5, Cy2、Cy7、XL665或酶例如堿性磷酸酶或過氧化物酶。
在一個(gè)實(shí)施方式中，可以使用抗降鈣素原的一級(jí)抗體和抗降鈣素原的第二抗體來測定降鈣素原的濃度，所述抗降鈣素原的一級(jí)抗體例如與熒光標(biāo)記物如銪連接的多克隆抗體，所述抗降鈣素原的第二抗體識(shí)別與一級(jí)抗體識(shí)別的表位不同的表位，例如與熒光標(biāo)記物如XL665連接的單克隆抗體。
可以通過手動(dòng)執(zhí)行本發(fā)明的方法，或者可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的能夠自動(dòng)執(zhí)行所述方法的任何儀器例如實(shí)驗(yàn)室儀器如KryptorBRAHMS來執(zhí)行本發(fā)明的方法，或者，可以使用用于測定血漿降鈣素原的其它方法(例如 LUMItest PCT-LIAISON 、BRAHMS PCT -Q)。
在一個(gè)實(shí)施方式中，將尿中的降鈣素原濃度的值與指示泌尿道感染存在或不存在的一個(gè)或多個(gè)值比較，因?yàn)樾∮贠. 05ng/mL的濃度預(yù)測不存在泌尿道感染，和/或大于O.3ng/mL的濃度預(yù)測存在泌尿道感染。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法可以包括這樣的附加步驟，即其中將尿中的降鈣素原濃度的值與血漿中的降鈣素原濃度的值比較，因?yàn)槟蛑械慕碘}素原濃度與血漿中的降鈣素原濃度之比大于I預(yù)測存在泌尿道感染。
本發(fā)明的主題也是用于體外診斷和/或預(yù)測泌尿道感染的試劑盒，所述試劑盒包含用于測定尿樣品和任選的血漿樣品中的降鈣素原濃度所必需的試劑的等分試樣。
因此，第一次提供了可用于鑒定患有泌尿系感染的患者和/或從特定治療方案的角度監(jiān)測感染過程的快速工具。
試劑盒在其最簡單的形式中含有特異性的抗降鈣素抗體的一個(gè)或多個(gè)等分試樣以及隨附的活頁，所述活頁例如含有關(guān)于對(duì)診斷結(jié)果的解釋、以及任選的用于收集和儲(chǔ)存尿和/或血漿樣品的方法的說明。對(duì)于本說明書的目的來說，可以在本文要求保護(hù)的試劑盒中包含可以與降鈣素原選擇性結(jié)合的任何抗體。具體來說，試劑盒可含有一種或多種抗降鈣素原的抗體，所述抗體是各自針對(duì)例如蛋白質(zhì)的不同表位開發(fā)的，并且所述抗體有可能可以與常見抗體標(biāo)記物例如熒光團(tuán)或酶連接。在適當(dāng)?shù)那闆r下，試劑盒可包括使用市場上的單克隆和/或多克隆的抗降鈣素原的抗體。試劑盒還可以含有隨附的活頁。這些活頁可以指示試劑盒的組分和推薦的方案。此外，說明書還可以含有關(guān)于對(duì)所分析的尿和血漿樣品所獲得的降鈣素原值的解釋的信息，并且更具體地，如上所述，小于O. 05ng/mL的尿降鈣素原濃度預(yù)測不存在泌尿道感染，大于O. 3ng/mL的濃度預(yù)測存在泌尿道感染，并且 PCTur/PCTpl之比>1預(yù)測存在泌尿道感染，其中PCTur是患者的尿降鈣素原，而PCTpl是血漿降鈣素原。
試劑盒還可以含有對(duì)一級(jí)抗體特異性的第二抗體的一個(gè)或多個(gè)等分試樣。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且如上所述，第二抗體必須能夠特異性識(shí)別所用一級(jí)抗體的恒定部分；因此，選擇要使用的第二抗體，將取決于用相關(guān)表位所免疫的動(dòng)物。第二抗體可以標(biāo)記有抗體標(biāo)記中常用的任何化合物。
試劑盒還可以含有陰性和/或陽性對(duì)照的一個(gè)或多個(gè)等分試樣。陰性對(duì)照是指沒有泌尿道感染的患者的任何尿或血漿樣品。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，陰性對(duì)照可以用降鈣素原濃度小于O. 05ng/mL的尿樣品代表。
陽性對(duì)照能夠用于檢驗(yàn)所執(zhí)行的程序的正確性和所用方法的可能的有效性，因?yàn)樗梢院谢加忻谀虻栏腥镜幕颊叩难獫{或尿樣品。具體來說，最適合的、但本發(fā)明不受此限制的陽性對(duì)照是降鈣素原濃度大于O. 3ng/mL的尿樣品。
試劑盒還可以含有用于檢測尿和/或血漿中的降鈣素原的試劑的一個(gè)或多個(gè)等分試樣。這些試劑由可用于執(zhí)行各種不同步驟的任何溶液組成，所述步驟導(dǎo)致鑒定出分析樣品中的降鈣素原濃度的值。具體來說，可以使用緩沖溶液，例如但不限于PBS (磷酸鹽緩沖鹽溶液)；封閉液，例如補(bǔ)充有牛血清白蛋白的PBS。
本發(fā)明的主題也是降鈣素原在泌尿道感染的診斷、監(jiān)測、和嚴(yán)重性評(píng)估中的應(yīng)用， 所述泌尿道感染例如與尿?qū)Ч艿氖褂孟嚓P(guān)的感染。
下面所報(bào)告的是用于闡述包含在本說明書中的報(bào)告的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和實(shí)施例不能將這些實(shí)施例認(rèn)為是對(duì)上述說明和權(quán)利要求的限制。
關(guān)于在懷疑患有泌尿道感染的患者的臨床研究中使用的人群的說明
將住在I⑶的、懷疑患有泌尿道感染的患者招募在臨床研究中。各患者冋時(shí)接受以下檢測
標(biāo)準(zhǔn)的尿分析(化學(xué)和物理檢查)和尿培養(yǎng)；
血漿PCT ；
尿PCT。
根據(jù)尿培養(yǎng)結(jié)果，接收了 10名尿培養(yǎng)陽性的對(duì)象和10名尿培養(yǎng)陰性的對(duì)象。
接收了共20名患者(9名女性和11名男性)，平均年齡為70歲。所選擇的患者的年齡從33到91歲不等。
每個(gè)患者必須表現(xiàn)出以下納入標(biāo)準(zhǔn)中的至少一項(xiàng)
-發(fā)熱或體溫過低；
-白細(xì)胞增多/白細(xì)胞減少；
-下背痛和/或排尿困難；
-其他無法解釋的SIRS體征；
-FUO ；
_ 復(fù)發(fā)的 UTI。
排除標(biāo)準(zhǔn)包括
I.少尿/無尿；
2.存在輸尿管乙狀結(jié)腸吻合術(shù)；
3.阻礙獲得足夠尿樣品的腎功能異常；
4.肝功能衰竭。
如果不超過兩種的微生物具有105CFU/mL的發(fā)展(在14_30%的情況下為多種微生物的病因)，則認(rèn)為尿培養(yǎng)是陽性的。在念珠菌(Candida spp.)的情況下,認(rèn)為顯著性閾值為104CFU/mL。對(duì)于革蘭氏陽性菌(特別是凝固酶陰性的腸球菌和葡萄球菌)來說也是如此， 而在抗菌治療的情況下，傾向于認(rèn)為小于105CFU/mL的計(jì)數(shù)是顯著性的。_4] 臨床研究的結(jié)果
尿培養(yǎng)陽性的人群顯示出，在10例中有9例的尿PCT高于血漿PCT (圖I)。
尿PCT平均值為I. 4ng/mL,而血漿PCT平均值為O. 4ng/mL。尿PCT的范圍在O. 36 和2. 54ng/mL之間，而血漿PCT的范圍在O. 06和I. 22ng/mL之間。
尿PCT值的中值為I. 25ng/mL,而血漿PCT值的中值為O. 24ng/mL。
尿PCT與血漿PCT之比具有在O. 8和25. 33ng/mL之間的值，平均值為7. 32ng/mL， 中值為 4. 86ng/mL。
對(duì)象的平均溫度為37. 02°C，其中I名患者的溫度<35°C，3名患者彡36 °C并 <37°C，4名患者彡37°C并<38°C，以及彡2名患者38°C。
白血細(xì)胞值(正常值4. 50至10. 00X IO3/μ L)的范圍在5. 37和22. 12X IO3/μ L之間，其中平均值為12. 22X 103/yL，中值為11. 55X IO3/μ L。
嗜中性粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(正常值40. O至75. 0%)在67. 3至88. 4%的范圍內(nèi)，平均值為 78. 8%ο
對(duì)象的肌酐(正常值O. 50至O. 90mg/dL)范圍從最小的O. 3到最大的2. 85mg/dL, 平均值為O. 78mg/dL。
為了計(jì)算肌酐清除率的值,使用以下Cockcroft-Gault公式
男性[(140-年齡)X體重(kg) / (血清肌酐X 72)]
女性[(140-年齡)X體重(kg) X O. 85/ (血清肌酐 X 72) ]
在研究對(duì)象中，清除率在27至226. 8ml/分鐘的范圍內(nèi)，其中平均值為129. 16ml/ 分鐘，中值為115. 4ml/分鐘。
尿培養(yǎng)陰性的人群顯示，在所有患者中，尿PCT低于血漿PCT。
尿PCT平均值為O. 6ng/mL，而血漿PCT平均值為4. 44ng/mL。尿PCT的范圍在O. 13 和I. 38ng/mL之間，而血漿PCT的范圍在O. 35和25. 72ng/mL之間。
尿PCT值的中值為O. 36ng/mL,而血漿PCT值的中值為I. 36ng/mL。
尿PCT和血漿PCT之比具有在O. 03和O. 9ng/mL之間的值，平均值為O. 40ng/mL, 中值為 O. 37ng/mL。
對(duì)象的平均溫度為37. 7°C，其中I名患者的溫度彡36°C并<37°C，I名患者彡37°C 并<38°C，以及8名患者彡38°C。
白血細(xì)胞值的范圍在4. 27和39. 2 X IO3/μ L之間，其中平均值為12. 86 X IO3/μ L， 中值為 8. 61 X IO3/μ Lo
嗜中性粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的范圍在65. 5和93. 9%之間，平均值為85. 5%。
對(duì)象的肌酐范圍從最小的O. 55到最大的I. 61mg/dL,平均值為O. 97mg/dL。
使用Cockcroft-Gault公式,肌酐清除率在38. 4至169. 4ml/分鐘的范圍內(nèi)，其中平均值為78. 72ml/分鐘，中值為76. Iml/分鐘。
在尿培養(yǎng)陰性患者的人群中，在尿培養(yǎng)陰性人群中的所有10名患者中均觀察到PCTur值低于PCTpl值，而在尿培養(yǎng)陽性的人群中，只有I例患者的PCTur值低于 PCTpl值(圖2)。后者是所接收的唯一一名具有嚴(yán)重腎功能障礙的對(duì)象，該患者表現(xiàn)出，用 Cockcroft-Gault公式估算的肌酐清除率值為27ml/分鐘。因此，有可能的是，在患有嚴(yán)重腎功能障礙的對(duì)象中，PCT蓄積在血漿中，而沒有適當(dāng)?shù)嘏判沟侥蛑?，這導(dǎo)致盡管培養(yǎng)陽性， 但PCTpl值大于PCTur值。
在尿培養(yǎng)陽性的人群中，PCTur值的中值為I. 25ng/mL，而在尿培養(yǎng)陰性的人群中，該值為O. 36ng/mL，這顯示了兩組之間的明顯差異。
PCTpl的中值也顯示出顯著性差異在尿培養(yǎng)陽性的人群中，該值(O. 24ng/mL)表示大多數(shù)對(duì)象沒有任何其他感染；而在尿培養(yǎng)陰性的人群中，該值(I. 36ng/mL)表示大多數(shù)患者具有細(xì)菌感染(圖24)。
為了評(píng)估PCT測定的準(zhǔn)確性是否受到尿用作樣品基質(zhì)的影響，將不能檢測到PCT 的健康個(gè)體的尿和血清樣品各5份摻入重組的PCT，并在KRYPTOR PCT分析中進(jìn)行測定。尿中PCT的回收比血清中PCT的回收低20-30%。因此，尿中回收降低的程度是相對(duì)小的，并且，即使尿和血清中的回收不相同，上面所得出的結(jié)論仍然有效。在本發(fā)明臨床樣品中測得8的尿PCT值可以通過將它們乘以I. 25進(jìn)行校正，以計(jì)入尿基質(zhì)中降低的回收。
統(tǒng)計(jì)分析
將從臨床研究結(jié)果推算出的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以評(píng)估是否PCTur/PCTpl比率>1 能夠以一定的靈敏度和特異性診斷泌尿道感染。
患有感染的患者無感染的患者合計(jì)檢測+AbA+b檢測+CdC+d合計(jì)A+cB+d
患有感染的患者無感染的患者合計(jì)檢測+9O9檢測+I1011合計(jì)101020
靈敏度是感染的患者對(duì)檢測呈陽性的概率，在我們的實(shí)例中
靈敏度=a/a+c=9/(9+1) =0. 9,即 90%。
另一方面，特異性是健康對(duì)象對(duì)檢測呈陰性的概率，在我們的實(shí)例中
特異性=d/b+d=10/(0+10) =1，即 100%
我們還可以計(jì)算陽性預(yù)測值(PPV)，PPV相當(dāng)于患有感染并因此被正確診斷為感染的檢測呈陽性的對(duì)象的比例
PPV=a/a+b 的=9/ (9+0) =1，即 100%。
實(shí)施例I測定血■漿的降鈣素原
使用BRAHMS PCT靈敏KRYPTOR從患者收集用于分析的血液樣品，BRAHMS PCT靈敏KRYPTOR是為人血清或血漿樣品(EDTA，肝素)的自動(dòng)免疫熒光分析中的降鈣素原劑量設(shè)計(jì)的試劑盒。該定量方法使用連接了熒光標(biāo)記物的抗降鈣素原的羊多克隆抗體、銪穴狀化合物和其他物質(zhì)例如包含牛血清白蛋白、未免疫小鼠的免疫球蛋白、和氟化鉀的緩沖液；也連接了熒光標(biāo)記物XL665的抗降鈣素的小鼠單克隆抗體，以及緩沖液、牛血清白蛋白、小鼠免疫球蛋白、氟化鉀；最后，準(zhǔn)備使用時(shí)，可利用由人血清、Kathon、EDTA形成的稀釋液。
該分析中的PCT測定是基于TRACE技術(shù)(時(shí)間分辨擴(kuò)增爭奪發(fā)射(Time-Resolved Amplifed scramble Emission)),所述技術(shù)測定從免疫復(fù)合物延時(shí)發(fā)射出的信號(hào)。用氮激光器在337nm處激發(fā)樣品，供體(穴狀化合物)發(fā)射出620nm的長壽命的在毫秒范圍內(nèi)的熒光信號(hào)，而受體(XL665)產(chǎn)生665nm的短壽命的在納秒范圍內(nèi)的信號(hào)。如果形成了免疫復(fù)合物，則在665nm處同時(shí)出現(xiàn)受體信號(hào)的信號(hào)放大和壽命延長，并且可以以微秒測定該信號(hào)。
PCT分子被夾在兩種抗體之間，通過測定信號(hào)長度，獲得了 PCT值，PCT值與信號(hào)的9發(fā)射時(shí)間成正比。
實(shí)施例2測定尿的降鈣素原
在夾緊流出口并消毒后，用注射器從尿?qū)Ч艿倪m當(dāng)引流位置取出尿樣品。將約4mL 尿轉(zhuǎn)移到合適的管中，并運(yùn)送到分析實(shí)驗(yàn)室。一旦取出樣品后，就根據(jù)如實(shí)施例I所述為血漿PCT提供的方案執(zhí)行尿PCT的測定。_6] 參考文獻(xiàn)
Hooton TM等.美國傳染病學(xué)會(huì)的2009年國際臨床實(shí)踐指南與尿?qū)Ч芟嚓P(guān)的成人泌尿道感染的診斷、預(yù)防、和治療(Diagnosis, prevention, and treatment of catheter-associated urinary tract infection in adults:2009International Clinical Practice Guidelines from the Infectious Diseases Society of America). Clin Infect Dis. 2010Mar I;50 (5):625-63。
權(quán)利要求
1.用于診斷和/或監(jiān)測泌尿道感染的體外方法，其包括測定患者尿樣品中降鈣素原濃度的步驟。
2.權(quán)利要求I的方法，其還包括測定所述患者血漿中降鈣素原濃度的步驟。
3.權(quán)利要求I或2的方法，其中通過對(duì)降鈣素原特異性的一級(jí)抗體來測定降鈣素原濃度。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述一級(jí)抗體用選自以下的熒光染料直接標(biāo)記羥基香豆素、氨基香豆素、甲氧基香豆素、銪、釤、FITC、Cy3、Cy5、Cy2、Cy7、XL665。
5.權(quán)利要求3的方法，其中通過用選自以下的化合物標(biāo)記的第二抗體來測定降鈣素原濃度輕基香豆素、氨基香豆素、甲氧基香豆素、銪、衫、FITC、Cy3、Cy5、Cy2、Cy7、XL665。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述第二抗體是對(duì)所述一級(jí)抗體特異性的。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，其中所述泌尿道感染與尿?qū)Ч艿氖褂孟嚓P(guān)。
8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其還包括將尿中的所述降鈣素原濃度與一個(gè)或多個(gè)值進(jìn)行比較的步驟，由此，低于O. 05ng/ml的濃度預(yù)測不存在泌尿道感染，和/或大于O. 3ng/ ml的濃度預(yù)測存在泌尿道感染。
9.權(quán)利要求2-8任一項(xiàng)的方法，其還包括將尿中的所述降鈣素原濃度的值與血漿中的所述降鈣素原濃度的值進(jìn)行比較的步驟，由此，尿中的所述降鈣素原濃度與血漿中的所述降鈣素原濃度之間的比大于I預(yù)測存在泌尿道感染。
10.用于體外診斷和/或監(jiān)測泌尿道感染的試劑盒，其包含用于測定尿樣品和任選的血漿樣品中降鈣素原濃度所需要的試劑的等分試樣。
11.權(quán)利要求10的試劑盒，其包含對(duì)降鈣素原特異性的一級(jí)抗體的一個(gè)或多個(gè)等分試樣。
12.權(quán)利要求11的試劑盒，其中所述一級(jí)抗體是用選自以下的化合物直接標(biāo)記的抗體輕基香豆素、氨基香豆素、甲氧基香豆素、銪、衫、FITC、Cy3、Cy5、Cy2、Cy7、XL665。
13.權(quán)利要求12的試劑盒，其還包含用選自以下的化合物的標(biāo)記的第二抗體的一個(gè)或多個(gè)等分試樣羥基香豆素、氨基香豆素、甲氧基香豆素、銪、釤、FITC、Cy3, Cy5, Cy2, Cy7, XL665。
14.權(quán)利要求10-13任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述試劑包括緩沖溶液的一個(gè)或多個(gè)等分試樣和/或結(jié)合溶液的一個(gè)或多個(gè)等分試樣和/或用于檢測標(biāo)記的抗體的試劑的一個(gè)或多個(gè)等分試樣。
15.權(quán)利要求10-14任一項(xiàng)的試劑盒，其還包含陰性對(duì)照的一個(gè)或多個(gè)等分試樣和/或陽性對(duì)照的一個(gè)或多個(gè)等分試樣。
16.權(quán)利要求15的試劑盒，其中所述陰性對(duì)照是降鈣素原濃度低于O.05ng/ml的尿樣品，并且所述陽性對(duì)照是降鈣素原濃度大于O. 3ng/ml的尿樣品。
17.降鈣素原用于診斷和/或監(jiān)測泌尿道感染的應(yīng)用。
18.權(quán)利要求17的降鈣素原的應(yīng)用，其中所述泌尿道感染與尿?qū)Ч艿氖褂孟嚓P(guān)。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于測定作為診斷標(biāo)記物的血漿和尿中的降鈣素原水平以鑒定患有泌尿道感染的患者的體外方法、用于執(zhí)行所述測定的體外方法、用于診斷患有泌尿道感染的患者的試劑盒、以及降鈣素原在診斷泌尿道感染中的有用性。
文檔編號(hào)G01N33/569GK102939542SQ201180014501
公開日2013年2月20日 申請(qǐng)日期2011年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月18日
發(fā)明者弗朗切斯科·瓊塔, 弗朗切斯科·福爾弗里, 加達(dá)·瑟里 申請(qǐng)人:B.R.A.H.M.S 有限公司