專利名稱：血紅蛋白類的分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用液相色譜法分離血紅蛋白類的血紅蛋白類的分析方法。
背景技術(shù)：
目前，利用高效液相色譜法(HPLC)的血紅蛋白類的分析被廣泛進行，其在糖尿病診斷中用于糖化血紅蛋白之一種的血紅蛋白Alc的定量或異常血紅蛋白的分析等。例如，已知如下液相色譜法 通過陽離子交換法，利用各血紅蛋白成分不同的帶電狀態(tài)，分離將血液檢體溶血稀釋來制備的測定試樣中的血紅蛋白類。隨著近年的糖尿病患者的增加，血紅蛋白Alc的測定病例數(shù)也傾向于增加，在用HPLC的測定中，也要求高精度測定和測定時間的縮短。在生物體內(nèi)，在血紅蛋白類中存在結(jié)合有氧的氧合血紅蛋白、結(jié)合二氧化碳的脫氧血紅蛋白、血紅素中所包含的鐵被氧化成三價鐵離子的高鐵血紅蛋白。在使用陽離子交換色譜法的HPLC中，根據(jù)分離柱上的保留力的不同，而產(chǎn)生氧合血紅蛋白、脫氧血紅蛋白、高鐵血紅蛋白的溶出時間的差異，檢測到的溶出峰寬化或者顯示雙峰性，因此分離精度有時變差。此外已知，在高鐵血紅蛋白與疊氮化物或氰化物共存的情況下，疊氮化物或氰化物與高鐵血紅蛋白的三價鐵離子結(jié)合，形成疊氮高鐵血紅蛋白或氰化高鐵血紅蛋白(以下，將它們也稱為穩(wěn)定型高鐵血紅蛋白)而進行穩(wěn)定化，但該穩(wěn)定型高鐵血紅蛋白也在分離柱上的保留力與氧合血紅蛋白或脫氧血紅蛋白稍微不同，因此由于穩(wěn)定型高鐵血紅蛋白的存在，檢測到的溶出峰有時寬化或者顯示雙峰性。使用了 HPLC的血紅蛋白類的分析除了糖尿病診斷之外還用于主要引起貧血的異常血紅蛋白癥或地中海貧血之類的診斷。其中，血紅蛋白S為最多見的異常血紅蛋白，其是引起嚴重貧血癥狀的鐮狀紅細胞癥的原因物質(zhì)，因此，分離、檢測的必要性高。此外，對作為糖尿病的指標的血紅蛋白Alc進行測定時，理想的是，將以血紅蛋白S為首的異常血紅蛋白以尖銳的溶出峰形式分離。如果血紅蛋白類的溶出峰寬化或形成雙峰，則異常血紅蛋白與正常血紅蛋白之間的分離變得困難，并且有可能對測定值產(chǎn)生不良影響。另外，與新鮮血相t匕，變質(zhì)血有更易于產(chǎn)生寬或雙峰性的溶出峰的傾向。該原因是，通過變質(zhì)產(chǎn)生的高鐵血紅蛋白增加。因此，在通過再檢查等對保存檢體進行分析的情況下，有可能對測定值產(chǎn)生不良影響。作為用于防止血紅蛋白類的變質(zhì)或改性的方法，已知添加公知的抗菌劑的方法和添加糖類的方法，除此之外，例如還公開了下述方法在專利文獻I中，公開了使白蛋白與血紅蛋白類共存的方法；在專利文獻2中，公開了使血紅蛋白類與酪蛋白、硼酸等共存的方法；在專利文獻3中，公開了使血紅蛋白類與亞氨基羧酸及其鹽共存的方法。然而，即使使用專利文獻I 3中所公開的方法,在血液檢體中混雜氧合血紅蛋白、脫氧血紅蛋白、高鐵血紅蛋白等各種血紅蛋白類的情況下，用HPLC測定時，溶出峰有時寬化或者顯示雙峰性。此外，在通常的HPLC裝置中，雖然組裝有用于去除洗脫(溶離)液中的氣體的脫氣機，但是脫氣機在啟動后一定時間氣體去除能力不穩(wěn)定，有時血紅蛋白的洗脫時間變動、或者對分離造成不良影響。特別是，在HPLC裝置剛剛啟動后或洗脫液溫度不穩(wěn)定的情況下，血紅蛋白類的溶出時間變動、或者容易導(dǎo)致定量性變差。由于這在要求迅速性的以血紅蛋白Alc為指標的糖尿病檢查中，與第一次報告為止的時間較長有關(guān)，因此需要從剛剛啟動HPLC裝置后就能夠穩(wěn)定地測定的技術(shù)。另外，在各種血紅蛋白類的檢測、定量中，通常使用基于分光光度計的吸光度，但由于氧合血紅蛋白、脫氧血紅蛋白、聞鐵血紅蛋白、置氣聞鐵血紅蛋白、氛化聞鐵血紅蛋白各自的吸收光譜不同，因此如果它們混雜在一起，則有時不能測定正確的血紅蛋白量。
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現(xiàn)有技術(shù)文獻專利文獻專利文獻I :日本特開2003-194825號公報專利文獻2 :日本特開平11-166932號公報專利文獻3 :日本特開2009-97956號公報

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題本發(fā)明的目的在于提供一種利用液相色譜法在短時間內(nèi)能夠高精度地分離血紅蛋白類的血紅蛋白類的分析方法。解決課題的手段本發(fā)明是使用了液相色譜法的血紅蛋白類的分析方法，是預(yù)先用氧化劑和三價血紅素鐵的結(jié)合劑對檢體進行處理的血紅蛋白類的分析方法。下面，對本發(fā)明進行詳述。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過預(yù)先用氧化劑和三價血紅素鐵的結(jié)合劑對檢體進行處理，使檢體中的血紅蛋白類全部變?yōu)榉€(wěn)定型高鐵血紅蛋白，統(tǒng)一各血紅蛋白在柱固定相中的保留力，在短時間內(nèi)能夠高精度地分離血紅蛋白類，從而完成了本發(fā)明。在本發(fā)明的血紅蛋白類的分析方法中，預(yù)先用氧化劑和三價血紅素鐵的結(jié)合劑對檢體進行處理。通過用氧化劑和三價血紅素鐵的結(jié)合劑對檢體進行處理，可以提高血紅蛋白類的分離能力，并且可以縮短血紅蛋白類的溶出時間。進而，即使在HPLC裝置的脫氣機在剛剛啟動后氣體去除能力不穩(wěn)定的情況下，血紅蛋白類的溶出時間也不會發(fā)生變動，并且檢測到的溶出峰不會寬化或顯示雙峰性，而高精度地分離血紅蛋白類。需要說明的是，在本發(fā)明中，“預(yù)先用氧化劑和三價血紅素鐵的結(jié)合劑對檢體進行處理”是指，以分離柱分離血紅蛋白類之前，用氧化劑和三價血紅素鐵的結(jié)合劑對檢體進行處理，并不限于在液相色譜法中的測定開始前進行處理。具體地說，例如，在檢體前處理液和/或洗脫液中，以表I所記載的組合中的任一組合，配合氧化劑和三價血紅素鐵的結(jié)合齊U，由此可以在分離血紅蛋白類之前，用氧化劑和三價血紅素鐵的結(jié)合劑對檢體進行處理。表I中，“〇”是指配合，是指不配合。[表 I]
權(quán)利要求
1.一種血紅蛋白類的分析方法，其是使用了液相色譜法的血紅蛋白類的分析方法，其特征在于，預(yù)先用氧化劑和三價血紅素鐵的結(jié)合劑對檢體進行處理。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的血紅蛋白類的分析方法，其特征在于，氧化劑為使血紅蛋白成為高鐵血紅蛋白的物質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的血紅蛋白類的分析方法，其特征在于，氧化劑為亞硝酸鹽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的血紅蛋白類的分析方法，其特征在于，氧化劑為亞硝酸鈉。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的血紅蛋白類的分析方法，其特征在于，三價血紅素鐵的結(jié)合劑為與高鐵血紅蛋白中的三價鐵結(jié)合的物質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的血紅蛋白類的分析方法，其特征在于，三價血紅素鐵的結(jié)合劑為疊氮化物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的血紅蛋白類的分析方法，其特征在于，三價血紅素鐵的結(jié)合劑為疊氮化鈉。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5、6或7所述的血紅蛋白類的分析方法，其特征在于，作為液相色譜法，使用陽離子交換液相色譜法。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種利用液相色譜法在短時間內(nèi)能夠高精度分離血紅蛋白類的血紅蛋白類的分析方法。本發(fā)明是使用了液相色譜法的血紅蛋白類的分析方法，是預(yù)先用氧化劑和三價血紅素鐵的結(jié)合劑對檢體進行處理的血紅蛋白類的分析方法。
文檔編號G01N30/06GK102893147SQ20118001472
公開日2013年1月23日 申請日期2011年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月31日
發(fā)明者太平博曉, 岡孝之 申請人:積水醫(yī)療株式會社