專利名稱：肺腺癌的預(yù)后預(yù)測方法、肺腺癌的檢測試劑盒以及用于治療肺腺癌的醫(yī)藥組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種肺腺癌的預(yù)后預(yù)測方法、肺腺癌的檢測試劑盒以及用于治療肺腺癌的醫(yī)藥組合物。
背景技術(shù)：
肺腺癌的臨床病期I期為沒有發(fā)現(xiàn)向原發(fā)性以外的部位擴(kuò)散的早期病變。在現(xiàn)行的分類中，I期肺腺癌進(jìn)一步分為IA期(腫瘤直徑不到3cm)和IB期(腫瘤直徑為3cm以上)。在非專利文獻(xiàn)I中報(bào)告有，肺腺癌的臨床病期I期的術(shù)后五年生存率為85%，術(shù)后化學(xué)治療法(替加氟尿嘧啶(UFT) 二年內(nèi)服)對I期中的預(yù)后的改善作有意義地貢獻(xiàn)?，F(xiàn)在，相對于I期肺腺癌癥病例雖然推薦進(jìn)行術(shù)后化學(xué)治療法，但是并不是I期肺腺癌的全體都可以通過術(shù)后化學(xué)治療法獲益。因此，可以認(rèn)為如果能夠進(jìn)行I期的術(shù)后預(yù)后預(yù)測，對預(yù)后 良好的患者群就可以減輕進(jìn)行不必要的化學(xué)治療法的風(fēng)險(xiǎn)。在這里，α -輔肌動蛋白-4是一種作為參與癌細(xì)胞的浸潤、擴(kuò)散的肌動蛋白結(jié)合蛋白而被分離的分子(參照非專利文獻(xiàn)2)。另外，也報(bào)告有α-輔肌動蛋白-4蛋白質(zhì)的表達(dá)參與細(xì)胞運(yùn)動和浸潤性(參照非專利文獻(xiàn)3)。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)I Kato H. et al. , N. Engl. J. Med.，2004 Apr 22 ；350(17) :1713-21非專利文獻(xiàn)2 Honda et al.，J Cell Biol. 1998 Mar 23 ；140 (6) :1383-93非專利文獻(xiàn)3 :Honda et al. , Gastroenterology. 2005 Jan ；128 (I) :51_62。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的問題本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)1期肺腺癌組織中的α -輔肌動蛋白_4(ACTN4)蛋白質(zhì)表達(dá)增強(qiáng)的病例，與并非如此的病例相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的有意義差且總生存期(OS)短。另外，本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)1期肺腺癌組織的細(xì)胞中的α-輔肌動蛋白-4基因(ACTN4)的基因組上的復(fù)制數(shù)增加了的群，與非增加群相比OS短。進(jìn)一步，本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)通過ACTN4基因的基因組的復(fù)制數(shù)和α-輔肌動蛋白-4蛋白質(zhì)表達(dá)水平的組合，與基因復(fù)制數(shù)或者蛋白質(zhì)表達(dá)各自的單獨(dú)解析相比，可以精密地預(yù)測I期肺腺癌的OS。本發(fā)明是基于這些見解而完成的發(fā)明。因此，本發(fā)明的目的在于提供一種肺腺癌的預(yù)后預(yù)測方法、肺腺癌的檢測試劑盒以及用于肺腺癌治療的醫(yī)藥組合物。解決問題的手段根據(jù)本發(fā)明第一方式的肺腺癌的預(yù)后預(yù)測方法，是通過檢測在哺乳動物中的預(yù)后不良的I期肺腺癌來預(yù)測預(yù)后的預(yù)后預(yù)測方法，其特征在于，
包括測定由所述哺乳動物得到的I期肺腺癌組織的細(xì)胞中的α -輔肌動蛋白-4基因(ACTN4)的復(fù)制數(shù)的步驟，當(dāng)所述基因的復(fù)制數(shù)超過4時，預(yù)測來自所述哺乳動物的I期肺腺癌為預(yù)后不良的I期肺腺癌。根據(jù)本發(fā)明第二方式的肺腺癌的檢測試劑盒，是用于檢測在哺乳動物中的預(yù)后不良的I期肺腺癌的檢測試劑盒，其特征在于，含有能夠測定細(xì)胞中的ACTN4基因的復(fù)制數(shù)的試劑而成。根據(jù)本發(fā)明第三方式的肺腺癌的預(yù)后預(yù)測方法，是通過檢測在哺乳動物中的預(yù)后不良的I期肺腺癌來預(yù)測預(yù)后的預(yù)后預(yù)測方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟(a)在由所述哺乳動物而得到的I期肺腺癌的組織或者細(xì)胞中，測定ACTN4基因表達(dá)量；以及步驟(b)將步驟(a)得到的表達(dá)量與對應(yīng)的正常組織或者細(xì)胞中的ACTN4基因表達(dá)量相比較，相對于所述正常組織或者細(xì)胞，當(dāng)所述I期肺腺癌的組織或者細(xì)胞中的所述基因表達(dá)增強(qiáng)時，預(yù)測來自所述哺乳動物的I期肺腺癌為預(yù)后不良的I期肺腺癌。根據(jù)本發(fā)明第四方式的肺腺癌的檢測試劑盒，是用于檢測在哺乳動物中的預(yù)后不良的I期肺腺癌的檢測試劑盒，其特征在于，含有能夠測定組織或者細(xì)胞內(nèi)的ACTN4基因表達(dá)量的試劑。根據(jù)本發(fā)明第五方式的用于治療肺腺癌的醫(yī)藥組合物，其特征在于，含有α -輔肌動蛋白-4抑制劑和醫(yī)藥上允許的載體而成。根據(jù)本發(fā)明第六方式的肺腺癌的檢測試劑盒，是用于測定人體細(xì)胞中的ACTN4基因的復(fù)制數(shù)的檢測試劑盒，其特征在于，含有可利用于FISH法中的、對基因組上的所述基因具有特異性的探針而成，該特異性探針由人體第19號染色體上第43. 81Mb 第44. 02Mb區(qū)域的核苷酸序列構(gòu)成。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，可以預(yù)測I期肺腺癌的預(yù)后，選擇適宜的治療方法。例如，在本發(fā)明中，當(dāng)判斷該I期肺腺癌為預(yù)后不良時，推薦在其摘出手術(shù)后進(jìn)行使用了替加氟 尿嘧啶混合劑、順鉬等藥劑的化學(xué)治療法。而另一方面，在本發(fā)明中判斷該I期肺腺癌為非預(yù)后不良時，可以避開不必要的化學(xué)治療法。進(jìn)一步，根據(jù)本發(fā)明提供治療I期肺腺癌、例如預(yù)后不良的I期肺腺癌的方法。


圖I為顯示對于在肺腺癌組織(I期和IA期)(隊(duì)列I)中α -輔肌動蛋白_4蛋白質(zhì)表達(dá)亢進(jìn)的陽性病例和陰性病例的2群根據(jù)Kaplan-Meier法而繪制的生存曲線圖。圖2為顯示對于在肺腺癌組織(I期和IA期)(隊(duì)列2)中的α -輔肌動蛋白_4蛋白質(zhì)表達(dá)亢進(jìn)的陽性病例和陰性病例的2群根據(jù)KapIan-Meier法而繪制的生存曲線圖。圖3為，將I期肺腺癌患者分為接下來的3群血清CEA5ng/mL以下且輔肌動蛋白-4陰性的群；血清CEA超過5ng/mL或者α -輔肌動蛋白_4蛋白質(zhì)陽性的群；以及血清CEA超過5ng/mL且α-輔肌動蛋白-4蛋白質(zhì)陽性的群,顯示對于各群根據(jù)Kaplan-Meier法而繪制的生存曲線圖。圖4為將I期肺腺癌患者分為接下來的3群ACTN4擴(kuò)增(-)且輔肌動蛋白_4蛋白質(zhì)表達(dá)陰性的群；ACTN4基因擴(kuò)增(_)且α-輔肌動蛋白-4蛋白質(zhì)表達(dá)陽性的群；以及ACTN4基因擴(kuò)增(+)且α-輔肌動蛋白-4蛋白質(zhì)表達(dá)陽性的群，顯示在各自的群中的根據(jù)Kaplan-Meier法而繪制的生存曲線圖。圖5為顯示因免疫組織化學(xué)染色的表達(dá)狀態(tài)的肺腺癌細(xì)胞的顯微鏡照片。圖6為顯示對于在肺腺癌組織(I III期和I期)(隊(duì)列I和2)中的α -輔肌動蛋白-4蛋白質(zhì)表達(dá)亢進(jìn)的陽性病例和陰性病例的2群根據(jù)Kaplan-Meier法而繪制的生存曲線圖。圖7為通過熒光原位雜交(FISH)法標(biāo)識的肺腺癌細(xì)胞的顯微鏡照片?！?br> 圖8為，顯示對于在肺腺癌組織(I期)中的組織微陣列的陽性病例和陰性病例的2群根據(jù)Kaplan-Meier法而繪制的生存曲線圖。圖9為顯示對于在肺腺癌組織(I期和IA期)(隊(duì)列I和2)中的、α -輔肌動蛋白-4蛋白質(zhì)表達(dá)亢進(jìn)、以及組織微陣列的陽性病例和陰性病例的群根據(jù)Kaplan-Meier法而繪制的生存曲線圖。
具體實(shí)施例方式成為本發(fā)明對象的癌是I期肺腺癌。肺癌大致分為非小細(xì)胞癌和小細(xì)胞癌。肺腺癌分類在非小細(xì)胞癌中。I期肺腺癌是肺腺癌中的最早期的癌，為還沒有向淋巴結(jié)或其它的內(nèi)臟器官轉(zhuǎn)移的肺腺癌。根據(jù)由本發(fā)明的方法，可以判斷哺乳動物所患的I期肺腺癌是否為預(yù)后不良。另外，本發(fā)明中的治療對象為I期肺腺癌，優(yōu)選為預(yù)后不良的I期肺腺癌。在其它的優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明中的治療對象為在其癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了 ACTN4基因的擴(kuò)增或表達(dá)增強(qiáng)的I期肺腺癌，特別是根據(jù)本發(fā)明的預(yù)后預(yù)測方法而被判斷為預(yù)后不良的I期肺腺癌。在本說明書中，「預(yù)后不良」的用語意味著，例如，在癌的切除5年后中的生存率不到90%，優(yōu)選為不到85%，更優(yōu)選為不到70%，最優(yōu)選為不到60 %。另外，本說明書中「預(yù)后不良」是指，癌的切除后需要化學(xué)治療法。因此，根據(jù)本發(fā)明的其它方式，本發(fā)明的方法為檢測在哺乳動物中需要術(shù)后的化學(xué)治療法的I期肺腺癌的方法，或者判斷I期肺腺癌的患者是否需要術(shù)后的化學(xué)治療法的方法。在本發(fā)明中，作為預(yù)測(診斷)的標(biāo)的物、成為治療的標(biāo)的的「α-輔肌動蛋白_4」或者「ACTN4」可以是來自成為診斷或者治療被檢物的哺乳動物的α -輔肌動蛋白-4(ACTN4基因產(chǎn)物)。ACTN4基因的序列以及由其編碼的氨基酸序列為在本領(lǐng)域公知的，可以舉出例如，序列號 I 以及序列號 2 (Ensembl ID ENSG00000130402 以及 ENST00000252699)所示的來自人體的ACTN4序列。另外,來自人體的ACTN4序列也登錄在NCBI中(Naional Centerfor Biotechnology Information)登錄號NM_004924 和 NP_004915。另外，ACTN4 基因的基因座也為本領(lǐng)域公知的，例如，人體的ACTN4基因是位于第19染色體的第43，830，167 43，913，010堿基。對于人體以外的哺乳動物，可以利用與來自人體的ACTN4對應(yīng)的同樣的基因以及蛋白質(zhì)。
在本說明書中，ACTN4基因的擴(kuò)增(基因組上的復(fù)制數(shù)增加)以及作為其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的α-輔肌動蛋白-4蛋白質(zhì)的表達(dá)增強(qiáng)被證實(shí)為I期肺腺癌的預(yù)后不良因素。進(jìn)一步，在癌細(xì)胞內(nèi)的ACTN4基因的擴(kuò)增與蛋白質(zhì)的表達(dá)增強(qiáng)的組合，與各自單獨(dú)的預(yù)后預(yù)測I期肺腺癌的預(yù)后相比被證實(shí)為能更嚴(yán)密地預(yù)測預(yù)后的預(yù)后不良因素。因此，通過調(diào)查由成為被檢物的哺乳動物(人體或者除了人體以外的哺乳動物)而得到的I期肺腺癌組織的細(xì)胞中的ACTN4基因的復(fù)制數(shù)，能夠預(yù)測(診斷)該I期肺腺癌是否為預(yù)后不良。另外，通過調(diào)查由所述哺乳動物而得到的I期肺腺癌的組織或者細(xì)胞中的α -輔肌動蛋白-4蛋白質(zhì)的表達(dá)增強(qiáng)，能夠預(yù)測(診斷)該I期肺腺癌是否為預(yù)后不良。成為診斷對象的I期肺腺癌的組織或者細(xì)胞可以是來自患者的由外科手術(shù)而被摘出的手術(shù)樣品，也可以是由內(nèi)視鏡等而得到的生檢樣品。在根據(jù)本發(fā)明的第一方式的方法中，通過調(diào)查I期肺腺癌組織的細(xì)胞中的ACTN4基因的復(fù)制數(shù)，來判斷該I期肺腺癌是否為預(yù)后不良，由此來檢測預(yù)后不良的I期肺腺癌。該方法包括測定I期肺腺癌組織的細(xì)胞中的ACTN4基因復(fù)制數(shù)的步驟，在該復(fù)制數(shù)超過4 時，判斷(診斷)作為被檢物的哺乳動物的I期肺腺癌為預(yù)后不良。在測定ACTN4基因復(fù)制數(shù)時，可以使用在本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)的方法。關(guān)于ACTN4基因的序列以及由其編碼氨基酸序列如上述所述，只要是本領(lǐng)域的技術(shù)人員就可以通過參照這些序列，使用標(biāo)準(zhǔn)的方法來測定ACTN4基因的復(fù)制數(shù)。作為基因復(fù)制數(shù)的測定方法，特別是可以舉出基于雜交和擴(kuò)增的試驗(yàn)。作為基于雜交的試驗(yàn)有印跡雜交法。在該方法中，使基因組DNA片斷化，用電泳進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)錄到膜上，使其雜交在ACTN4的特異性探針上。通過比較來自該特異性探針的雜交信號的強(qiáng)度和沒有復(fù)制數(shù)增加的相同的基因組區(qū)域進(jìn)行雜交的來自對照探針的信號強(qiáng)度，得到相對的ACTN4基因的復(fù)制數(shù)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式，ACTN4基因復(fù)制數(shù)的測定是通過對基因組上的該基因使用特異性探針的熒光原位雜交(FISH)法(參照Angerer，Meth. Enzymol. 152,649,1987)來進(jìn)行的。一般，原味雜交主要是通過以下來進(jìn)行的，即使被分析的組織或者細(xì)胞固定化，將該組織或者細(xì)胞進(jìn)行預(yù)雜交處理，使相對于該組織或者細(xì)胞中的核酸的特異性探針進(jìn)行雜交，進(jìn)行清洗以除去沒有結(jié)合的特異性探針，檢測雜交的特異性探針。在這樣的用途中使用的特異性探針由熒光指示器進(jìn)行標(biāo)識。通過計(jì)算在I個細(xì)胞核內(nèi)的熒光數(shù)，能夠得到在該細(xì)胞中的ACTN4基因的復(fù)制數(shù)。根據(jù)本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方式，在FISH法中使用的所述特異性探針由人體第19號染色體上的第43. SlMb 第44. 02Mb區(qū)域的核苷酸序列構(gòu)成。在這里，由該區(qū)域的核昔酸序列構(gòu)成的探針在測定基因組上的ACTN4基因的復(fù)制數(shù)上特別有效，是能夠以聞感度正確的測定的探針。因此，根據(jù)本發(fā)明的其它方式，提供一種用于測定人體細(xì)胞中的α -輔肌動蛋白-4基因復(fù)制數(shù)的試劑盒，該試劑盒含有可利用于FISH法的、在基因組上的所述基因中的特異性的探針，該特異性探針由人體第19號染色體上的第43. SlMb 第44. 02Mb區(qū)域的核苷酸序列構(gòu)成。該特異性探針也可以由一條核苷酸分子構(gòu)成，也可以為覆蓋人體第19號染色體上的第43. 81Mb 第44. 02Mb區(qū)域的2條以上(優(yōu)選為2條)的核苷酸分子的組合。作為基于雜交的其它的試驗(yàn)也可以利用比較基因組雜交(CGH)法。就CGH法而言，從被分析的被檢驗(yàn)細(xì)胞和成為對照的正常細(xì)胞中提取各自的DNA，以不同顏色的熒光顏料標(biāo)識各自的DNA，調(diào)制由這些等量標(biāo)識DNA構(gòu)成的混合溶液，將該混合溶液保存在37°C、暗處2 3天。由此，相對于染色體的全部部位，在被檢驗(yàn)DNA和對照DNA之間，產(chǎn)生競爭性的結(jié)合。該結(jié)果為，在被檢驗(yàn)DNA中如果存在基因復(fù)制數(shù)的增加，載玻片的與該基因相對應(yīng)的位置上，強(qiáng)烈地觀察到標(biāo)識了被檢驗(yàn)DNA的顏色的熒光，相反的，在被檢驗(yàn)DNA中如果存在基因復(fù)制數(shù)的減少，載玻片上的與該基因相對應(yīng)的位置上，強(qiáng)烈地觀察到標(biāo)識了對照DNA的顏色的熒光。作為基于擴(kuò)增的試驗(yàn)有定量的核酸擴(kuò)增法。在該方法中，由于基因組中的ACTN4基因成為擴(kuò)增反應(yīng)的模板，因此能夠得到與該復(fù)制數(shù)相應(yīng)量的擴(kuò)增產(chǎn)物。作為具體的核酸擴(kuò)增法，可以舉出定量的PCR法，例如，實(shí)時定量PCR法等。在由本發(fā)明第二方式的方法中，通過調(diào)查I期肺腺癌的組織或者細(xì)胞中的α -輔肌動蛋白-4蛋白質(zhì)的表達(dá)增強(qiáng)，來判斷該I期肺腺癌是否為預(yù)后不良，由此，檢測預(yù)后不良的I期肺腺癌。該方法包括測定所述I期肺腺癌的組織或者細(xì)胞中的ACTN4基因的表達(dá)量 的步驟，其表達(dá)量比對應(yīng)的正常的組織或者細(xì)胞的表達(dá)量多時，即、α -輔肌動蛋白-4蛋白質(zhì)的表達(dá)增強(qiáng)時，判斷(診斷)作為被檢物的哺乳動物的I期肺腺癌為預(yù)后不良。就ACTN4基因表達(dá)量的測定而言，可以使用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)的方法。一般基因表達(dá)量典型的是將mRNA量或者蛋白質(zhì)量作為標(biāo)的物來測定。在本發(fā)明中也可以同樣將ACTN4的mRNA量或者蛋白質(zhì)量作為標(biāo)的物來測定α -輔肌動蛋白_4蛋白質(zhì)的表達(dá)量。對于ACTN4基因的序列以及由其編碼的氨基酸序列如上所述，只要是本領(lǐng)域的技術(shù)人員就可以通過參照這些序列，使用標(biāo)準(zhǔn)的方法來測定α -輔肌動蛋白-4蛋白質(zhì)的表達(dá)量。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，測定基因表達(dá)量的步驟包括測定所述組織或者細(xì)胞內(nèi)的α -輔肌動蛋白-4蛋白質(zhì)量。α-輔肌動蛋白-4蛋白質(zhì)量可以通過本領(lǐng)域公知的方法來進(jìn)行測定。例如可以舉出以序列號2所表示的序列作為α-輔肌動蛋白-4蛋白質(zhì)的氨基酸序列，只要是本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過參照該序列，就可以適宜地測定同蛋白質(zhì)的量。α -輔肌動蛋白-4蛋白質(zhì)的量例如可以通過使用與同蛋白質(zhì)相結(jié)合的抗體來適宜地進(jìn)行測定。像這樣的抗體優(yōu)選為對α-輔肌動蛋白-4蛋白質(zhì)有特異性的抗體?？贵w可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體。α -輔肌動蛋白-4蛋白質(zhì)的定量優(yōu)選通過使用這樣的抗體的免疫組織化學(xué)染色而進(jìn)行。或者也可以使用將從所述組織或者細(xì)胞而得到的蛋白質(zhì)提取物進(jìn)行電泳后使用抗體將其進(jìn)行定量的免疫印跡法。根據(jù)本發(fā)明的其它的優(yōu)選實(shí)施方式，測定基因表達(dá)量的步驟包括將所述組織或者細(xì)胞內(nèi)的ACTN4的mRNA進(jìn)行定量而成。例如可以舉出含有以序列號I表示的核苷酸序列(只是，序列中的t變換成u)作為ACTN4的mRNA，只要是本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過參照該序列，就可以適宜地定量ACTN4的mRNA。作為用于定量的具體的方法，例如可以舉出，在通過使用特異性的引物的RT-PCR而進(jìn)行的擴(kuò)增后進(jìn)行電泳的方法等。成為比較對照的正常的組織或者細(xì)胞可以是來自成為被檢物的同一個體的正常的組織或者細(xì)胞，也可以是來自不同的個體的正常的組織或者細(xì)胞。另外，就來自不同的多個個體的正常的組織或者細(xì)胞而言，可以測定α-輔肌動蛋白-4蛋白質(zhì)的表達(dá)量，將其平均值作為比較對照。進(jìn)一步，由預(yù)先測定的多個正常的組織或者細(xì)胞中的表達(dá)量的數(shù)據(jù)出發(fā)，預(yù)先設(shè)定平均值+標(biāo)準(zhǔn)偏差等合理值，當(dāng)被檢驗(yàn)組織或者細(xì)胞的表達(dá)量比該合理值高時，可以判斷為有ACTN4基因的表達(dá)增強(qiáng)。作為“對應(yīng)的正常的組織或者細(xì)胞”可以舉出正常的肺組織或者細(xì)胞。在本說明書中，與α -輔肌動蛋白-4蛋白質(zhì)的表達(dá)增強(qiáng)一起確認(rèn)出該被檢驗(yàn)哺乳動物的血清CEA濃度上升時，證實(shí)具有更顯著的有意義差從而可以判斷該I期肺腺癌為預(yù)后不良的I期肺腺癌。因此，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，由本發(fā)明的第二方式的診斷法進(jìn)一步包括以下步驟而成步驟(c)在由所述哺乳動物而得到的血清中，測定癌胚抗原(CEA)的濃度；以及步驟(D)將在步驟(c)中得到的濃度與正常的血清中的癌胚抗原(CEA)的濃度進(jìn)行比較步驟。在該診斷法中，相對于所述正常的組織或者細(xì)胞，所述I期肺腺癌的組織或者細(xì)胞中的α-輔肌動蛋白-4蛋白質(zhì)的表達(dá)增強(qiáng)，且相對于所述正常的血清，從所述哺乳動物得到的血清中的癌胚抗原(CEA)濃度為有意義地高時，表示來自所述哺乳動物的I期肺腺癌為預(yù)后不良的I期肺腺癌。就測定CEA的血清濃度的方法而言，可以使用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)的方法。CEA為眾所周知的腫瘤標(biāo)記，作為該血清濃度的測定方法，已知有ELISA法或CLEIA法等各種各樣的方法，而用于實(shí)施這樣的各自方法的試劑盒在市場上也有售。成為比較對照的正常的血清可以是來自成為被檢物的同一個體的正常的血清，也可以是來自不同個體的正常的血清。另外，對于來自不同的多個個體的正常的血清，可以測定CEA的濃度，將其平均值作為比較對照。進(jìn)一步，由預(yù)先測定的多個正常的血清中的CEA濃度的數(shù)據(jù)出發(fā)，預(yù)先設(shè)定平均值+標(biāo)準(zhǔn)偏差等合理值，當(dāng)被檢驗(yàn)血清的CEA濃度比該合理值高時，可以判斷為有CEA血清濃度的上升。例如，就人體血清而言，CEA濃度超過5. Ong/mL時，可以判斷相對于正常的血清為有意義地聞。·根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，根據(jù)本發(fā)明的第二方式的方法是組合本發(fā)明的第一方式的方法來進(jìn)行的。即、在該實(shí)施方式中，本發(fā)明的由第二方式的方法進(jìn)一步包括以下的步驟而成(e)測定從所述哺乳動物而得到的I期肺腺癌組織的細(xì)胞中的ACTN4基因的基因組上的復(fù)制數(shù)的步驟。在該方法中，相對于所述正常的組織或者細(xì)胞，所述I期肺腺癌的組織或者細(xì)胞中的α-輔肌動蛋白-4蛋白質(zhì)的表達(dá)增強(qiáng)、且ACTN4基因的復(fù)制數(shù)超過4時，表示來自所述哺乳動物的I期肺腺癌為預(yù)后不良的I期肺腺癌。為了實(shí)施以上這樣的根據(jù)本發(fā)明的檢測/診斷法，可以將必要的試劑匯集在一起來制成試劑盒。由此，根據(jù)本發(fā)明提供一種用于在哺乳動物中檢測預(yù)后不良的I期肺腺癌的試劑盒，該試劑盒含有可以測定細(xì)胞中的ACTN4的基因組上的復(fù)制數(shù)的試劑。根據(jù)要實(shí)施的具體的方法來選擇這樣的試劑，優(yōu)選為在FISH法中可使用的、對于基因組上的該基因?yàn)樘禺愋缘奶结槨Ｋ鎏禺愋蕴结槂?yōu)選由人體第19號染色體上的第43. SlMb 第44. 02Mb的區(qū)域的核苷酸序列構(gòu)成。根據(jù)本發(fā)明的其它方式的試劑盒為用于檢測哺乳動物中預(yù)后不良的I期肺腺癌的試劑盒，含有能測定組織或者細(xì)胞內(nèi)的ACTN4基因或α -輔肌動蛋白-4蛋白質(zhì)的表達(dá)量的試劑。作為像這樣的試劑可以適宜地使用用于定量所述組織或者細(xì)胞內(nèi)的α-輔肌動蛋白-4蛋白質(zhì)的試劑，例如，特異性結(jié)合α-輔肌動蛋白-4蛋白質(zhì)的抗體?；蛘呦襁@樣的試劑也可以為用于定量所述組織或者細(xì)胞內(nèi)的ACTN4的mRNA的試劑，例如可以是，將ACTN4的mRNA作為模板的在RT-PCR中使用的特異性引物以及RT-PCR用的其它試劑。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，該試劑盒為進(jìn)一步含有能測定血清中的癌胚抗原(CEA)濃度的試劑的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的其它優(yōu)選實(shí)施方式，該試劑盒為進(jìn)一步含有能測定細(xì)胞中的ACTN4基因的復(fù)制數(shù)的試劑的試劑盒，像這樣的試劑優(yōu)選為能在FISH法使用的、對基因組上的該基因?yàn)樘禺愋缘奶结樀脑噭Ｋ鎏禺愋蕴结槂?yōu)選由人體第19號染色體上的第43. SlMb 第44. 02Mb區(qū)域的核苷酸序列構(gòu)成。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，根據(jù)要實(shí)施的具體方法，還可以進(jìn)一步含有其它試劑類、反應(yīng)容器、說明書等。根據(jù)本發(fā)明提供一種含有向被檢驗(yàn)者投入有效的治療量的ACTN4抑制劑而成的、治療或者予防I期肺腺癌的方法。進(jìn)一步根據(jù)本發(fā)明提供一種在制造用于治療I期肺腺癌的藥劑中ACTN4抑制劑的使用。成為治療或者予防對象的被檢驗(yàn)者優(yōu)選是哺乳動物，例如為人體或者非人體哺乳動物。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，ACTN4抑制劑為藥物等小分子。像這樣的小分子可以通過將ACTN4的阻害活性作為標(biāo)的物，根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行篩選而得到。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，ACTN4抑制劑為特異性地結(jié)合在α _輔肌動蛋白_4蛋白質(zhì)上的抗體?？贵w可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體，優(yōu)選是單克隆抗體。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，ACTN4抑制劑為特異性地抑制ACTN4基因表達(dá)的反義核酸分子。反義法是用于抑制特定的基因表達(dá)的公知技術(shù)。在一個具體例中，所述反義核酸分子為基于ACTN4基因的5’編碼區(qū)域的序列而設(shè)計(jì)成的大約10 40堿基長的反義RNA0在其它的具體例中，所述反義核酸分子設(shè)計(jì)成與參與ACTN4基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)域的序列為互補(bǔ)的DNA寡核苷酸。像這樣的反義核酸分子可以基于序列號I所示的ACTN4基因的序列而容易地進(jìn)行設(shè)計(jì)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，ACTN4抑制劑為特異性地抑制ACTN4基因表達(dá)的siRNA核酸分子。在本說明書中，“ siRNA核酸分子”并不僅僅是siRNA其本身，也意味著能在標(biāo)的細(xì)胞中導(dǎo)入siRNA的更長的兩條鏈RNA分子。siRNA核酸分子為通過RNA干擾(RNAi)能抑制特定基因表達(dá)的公知的工具(參照Elbashir，S. M. et al.，Nature 411,494-498，2001)。siRNA典型的為，含有與標(biāo)的基因的mRNA上特異性序列相同的19 21堿基對的核苷酸序列。上述兩條鏈RNA分子典型的為含有與標(biāo)的基因mRNA上特異性序列相同的更長的核苷酸序列。像這樣的siRNA核酸分子可以基于序列號I所示的ACTN4基因的序列而容易地進(jìn)行設(shè)計(jì)。進(jìn)一步，所述siRNA核酸分子可以通過傳達(dá)到細(xì)胞中的適宜的專用載體來使其表達(dá)。因此，ACTN4抑制劑可以是特異性抑制ACTN4基因表達(dá)的使siRNA核酸分子進(jìn)行表達(dá)的載體。像這樣的載體可以通過本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)程序而容易地構(gòu)建(參照Bass，B.L，Cell 101，235-238，2000 ；Tavernarakis, N. et al.，Nat. Genet. 24，180-183，2000 ；Malagon，F(xiàn). et al.，Mol. Gen. Genet. 259,639-644，1998 ；Parrish, S. et al.，Mol. Cell 6，1077-1087，2000)。ACTN4抑制劑可以通過局部、靜脈內(nèi)、皮下、筋肉內(nèi)、經(jīng)口、直腸、粘膜等適宜的途徑來給藥。另外，其治療上的有效量依照癥狀的病勢危急程度、被檢驗(yàn)者的年齡、使用的具體藥物的有效性、給藥途徑、給藥頻度等，由醫(yī)生或者獸醫(yī)來適宜決定。一般，所述治療上有效量每一天為約O. 001 約IOOOmg/體重kg,優(yōu)選大約O. 01 大約IOmg/體重kg,更優(yōu)選為大約O. 01 大約Img/體重kg。
ACTN4抑制劑可以與醫(yī)藥上允許的載體一起給藥。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供一種含有ACTN4抑制劑和醫(yī)藥上允許的載體的、用于治療I期肺腺癌治療的醫(yī)藥組合物。醫(yī)藥上允許的載體，例如，媒介物、賦形劑、稀釋劑等由本領(lǐng)域的技術(shù)人員按照給藥途徑、所使用的具體藥物的性質(zhì)等來適宜選擇。進(jìn)一步，根據(jù)本發(fā)明提供一種治療I期肺腺癌的方法，包括以下步驟而成，即通過根據(jù)本發(fā)明的第一方式的方法或者根據(jù)第二方式的方法或者這些方法的組合，對判斷為預(yù)后不良的I期肺腺癌的患者給藥有效治療量的化學(xué)治療法制劑。作為該化學(xué)治療法制劑可以使用上述ACTN4抑制劑，也可以使用替加氟.5-氟脲嘧啶混合劑或順鉬等其它的抗癌劑。實(shí)施例以下、通過實(shí)施例更具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限定于這些?！?br> 實(shí)施例I :1期肺腺癌和α -輔肌動蛋白-4基因的表達(dá)亢進(jìn)的關(guān)聯(lián)作為樣品使用被甲醛固定石蠟包埋的來自1997年12月到2001年3月在國立癌中心中央醫(yī)院(日本)實(shí)施了 I期肺腺癌切除手術(shù)的372名患者的切除樣體(以下稱為“隊(duì)列I”)。在這些樣品中，通過免疫組織化學(xué)分析來討論α-輔肌動蛋白-4蛋白質(zhì)的表達(dá)。在免疫組織化學(xué)分析中所使用的一次抗體是在國立癌中心研究所(日本)所制造的抗人體α-輔肌動蛋白-4兔多克隆抗體。免疫染色通過使用生物素·親合素復(fù)合體(Avidin-Biotin Complex)的 ABC 法來進(jìn)行。作為α-輔肌動蛋白-4蛋白質(zhì)表達(dá)的評價，與同一切片上的血管內(nèi)皮相比，將癌部的表達(dá)為亢進(jìn)，且其亢進(jìn)部分的面積占腫瘤整體面積的30%以上的樣品定義為陽性例，其以外的樣品定義為陰性例。接下來，通過Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型的單變量解析和多變量解析來分析關(guān)于α _輔肌動蛋白-4蛋白質(zhì)表達(dá)的上述分類、以及各種臨床病理學(xué)上的因素相對于I期肺腺癌患者生存期間的危險(xiǎn)率。作為變量除了 α-輔肌動蛋白-4蛋白質(zhì)表達(dá)(陽性/陰性)之外，使用性別(男性/女性)、年齡(65以上/不到65)、吸煙(無/有)、階段(ΙΑ/ΙΒ)、血清CEA(超過5ng/mL/5ng/mL以下)、淋巴管侵襲(陽性/陰性)以及靜脈侵襲(陽性/陰性)。以下表I顯示該結(jié)果。表I :使用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型的I期肺腺癌的臨床病理學(xué)上的預(yù)后因素解析(隊(duì)列I : α -輔肌動蛋白-4蛋白質(zhì)表達(dá)解析)
權(quán)利要求
1.一種肺腺癌的預(yù)后預(yù)測方法，是通過檢測在哺乳動物中的預(yù)后不良的I期肺腺癌來預(yù)測預(yù)后的預(yù)后預(yù)測方法，其特征在于， 包括測定由所述哺乳動物得到的I期肺腺癌組織的細(xì)胞中的α -輔肌動蛋白-4基因(ACTN4)的復(fù)制數(shù)的步驟而成， 當(dāng)所述基因的復(fù)制數(shù)超過4時，預(yù)測來自所述哺乳動物的I期肺腺癌為預(yù)后不良的I期肺腺癌。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的肺腺癌的預(yù)后預(yù)測方法，其特征在于，所述基因的復(fù)制數(shù)的測定是通過對基因組上的該基因使用特異性的探針的FISH法來進(jìn)行的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的肺腺癌的預(yù)后預(yù)測方法，其特征在于，所述特異性探針由人體第19號染色體上的第43. 81Mb 第44. 02Mb區(qū)域的核苷酸序列構(gòu)成。
4.一種肺腺癌的檢測試劑盒，其為用于檢測在哺乳動物中的預(yù)后不良的I期肺腺癌的檢測試劑盒，其特征在于，含有能夠測定細(xì)胞中的ACTN4基因的復(fù)制數(shù)的試劑而成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的肺腺癌的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑對基因組上的所述基因?yàn)樘禺愋缘奶结槨?br> 6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的肺腺癌的檢測試劑盒，其特征在于，所述特異性探針由人體第19號染色體上的第43. 81Mb 第44. 02Mb區(qū)域的核苷酸序列構(gòu)成。
7.一種肺腺癌的預(yù)后預(yù)測方法，是通過檢測在哺乳動物中的預(yù)后不良的I期肺腺癌來預(yù)測預(yù)后的預(yù)后預(yù)測方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟(a)在由所述哺乳動物而得到的I期肺腺癌的組織或者細(xì)胞中，測定ACTN4基因表達(dá)量；以及 步驟(b)將步驟(a)得到的表達(dá)量與對應(yīng)的正常組織或者細(xì)胞中的ACTN4基因表達(dá)量相比較， 相對于所述正常組織或者細(xì)胞，當(dāng)所述I期肺腺癌的組織或者細(xì)胞中的所述基因表達(dá)增強(qiáng)時，預(yù)測來自所述哺乳動物的I期肺腺癌為預(yù)后不良的I期肺腺癌。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的肺腺癌的預(yù)后預(yù)測方法，其特征在于，在所述步驟(a)中，檢測所述組織或者細(xì)胞內(nèi)的α -輔肌動蛋白-4蛋白質(zhì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的肺腺癌的預(yù)后預(yù)測方法，其特征在于，α-輔肌動蛋白-4蛋白質(zhì)含有以序列號2表示的氨基酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的肺腺癌的預(yù)后預(yù)測方法，其特征在于，α-輔肌動蛋白-4蛋白質(zhì)的檢測是通過使用特異性抗體的免疫組織化學(xué)染色來進(jìn)行的。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的肺腺癌的預(yù)后預(yù)測方法，其特征在于，在所述步驟(a)中，檢測所述組織或者細(xì)胞內(nèi)的α -輔肌動蛋白-4的mRNA。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的肺腺癌的預(yù)后預(yù)測方法，其特征在于，α-輔肌動蛋白-4的mRNA含有以序列號I表示的核苷酸序列(只是，序列中的t變換成u)。
13.根據(jù)權(quán)利要求7所述的肺腺癌的預(yù)后預(yù)測方法，其特征在于，進(jìn)一步包括以下步驟 步驟(c)測定由所述哺乳動物而得到的血清中的癌胚抗原(CEA)濃度；以及 步驟⑷將步驟(c)中得到的濃度與正常的血清中的癌胚抗原(CEA)的濃度相比較， 相對于所述正常的組織或者細(xì)胞，所述I期肺腺癌的組織或者細(xì)胞中的所述基因表達(dá)增強(qiáng)，且相對于所述正常的血清由所述哺乳動物而得到的血清中的癌胚抗原(CEA)濃度為有意義高時，則預(yù)測來自所述哺乳動物的I期肺腺癌為預(yù)后不良的I期肺腺癌。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的肺腺癌的預(yù)后預(yù)測方法，其特征在于，當(dāng)由所述步驟(c)得到的濃度超過5. Ong/mL時，判斷相對于所述正常的血清為有意義地高。
15.根據(jù)權(quán)利要求7所述的肺腺癌的預(yù)后預(yù)測方法，其特征在于，進(jìn)一步包括以下的步驟 步驟(e)測定由所述哺乳動物而得到的I期肺腺癌組織的細(xì)胞中的ACTN4基因的復(fù)制數(shù)的步驟， 相對于所述正常的組織或者細(xì)胞，所述I期肺腺癌的組織或者細(xì)胞中所述基因的表達(dá)增強(qiáng)，且所述基因的復(fù)制數(shù)超過4時，則預(yù)測來自所述哺乳動物的I期肺腺癌為預(yù)后不良的I期肺腺癌。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的肺腺癌的預(yù)后預(yù)測方法，其特征在于，所述基因的復(fù)制數(shù)的測定是通過對基因組上的該基因使用特異性探針的FISH法來進(jìn)行的。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的肺腺癌的預(yù)后預(yù)測方法，其特征在于，所述特異性探針由人體第19號染色體上的第43. 81Mb 第44. 02Mb區(qū)域的核苷酸序列構(gòu)成。
18.一種肺腺癌的檢測試劑盒，是用于檢測在哺乳動物中的預(yù)后不良的I期肺腺癌的檢測試劑盒，其特征在于，含有能夠測定組織或者細(xì)胞內(nèi)的ACTN4基因表達(dá)量的試劑。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的肺腺癌的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑為用于定量所述組織或者細(xì)胞內(nèi)的α -輔肌動蛋白-4蛋白質(zhì)的試劑。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的肺腺癌的檢測試劑盒，其中，用于定量α-輔肌動蛋白-4蛋白質(zhì)的試劑為特異性地結(jié)合在α-輔肌動蛋白-4蛋白質(zhì)的抗體。
21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的肺腺癌的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑為用于定量所述組織或者細(xì)胞內(nèi)的α -輔肌動蛋白-4的mRNA的試劑。
22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的肺腺癌的檢測試劑盒，其特征在于，進(jìn)一步含有能測定血清中的癌胚抗原(CEA)濃度的試劑。
23.根據(jù)權(quán)利要求18所述的肺腺癌的檢測試劑盒，其特征在于，進(jìn)一步含有能測定細(xì)胞中的ACTN4基因的復(fù)制數(shù)的試劑。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的肺腺癌的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑對基因組上的所述基因?yàn)樘禺愋缘奶结槨?br> 25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的肺腺癌的檢測試劑盒，其特征在于，所述特異性探針由人體第19號染色體上的第43. 81Mb 第44. 02Mb區(qū)域的核苷酸序列構(gòu)成。
26.一種用于治療肺腺癌的醫(yī)藥組合物，其特征在于，含有α-輔肌動蛋白-4抑制劑和醫(yī)藥上允許的載體而成。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的用于治療肺腺癌的醫(yī)藥組合物，其特征在于，α-輔肌動蛋白-4抑制劑為小分子。
28.根據(jù)權(quán)利要求26所述的用于治療肺腺癌的醫(yī)藥組合物，其特征在于，α-輔肌動蛋白-4抑制劑為特異性地結(jié)合在α -輔肌動蛋白-4蛋白質(zhì)上的抗體。
29.根據(jù)權(quán)利要求26所述的用于治療肺腺癌的醫(yī)藥組合物，其特征在于，α-輔肌動蛋白-4抑制劑為特異性地抑制ACTN4基因表達(dá)的反義核酸分子。
30.根據(jù)權(quán)利要求26所述的用于治療肺腺癌的醫(yī)藥組合物，其特征在于，α-輔肌動蛋白-4抑制劑為特異性地抑制ACTN4基因表達(dá)的siRNA核酸分子。
31.根據(jù)權(quán)利要求26所述的用于治療肺腺癌的醫(yī)藥組合物，其特征在于，α-輔肌動蛋白-4抑制劑為對特異性地抑制ACTN4基因表達(dá)的siRNA核酸分子進(jìn)行表達(dá)的媒介物。
32.—種肺腺癌的檢測試劑盒，是用于測定人體細(xì)胞中的ACTN4基因的復(fù)制數(shù)的檢測試劑盒，其特征在于，含有可利用于FISH法中的、對基因組上的所述基因具有特異性的探針而成，該特異性探針由人體第19號染色體上第43. SlMb 第44. 02Mb區(qū)域的核苷酸序列構(gòu)成。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種肺腺癌的預(yù)后預(yù)測方法、肺腺癌的檢測試劑盒以及用于治療肺腺癌的醫(yī)藥組合物，所述肺腺癌的預(yù)后預(yù)測方法為通過檢測在哺乳動物中的預(yù)后不良的I期肺腺癌來預(yù)測預(yù)后的預(yù)后預(yù)測方法，測定由所述哺乳動物得到的I期肺腺癌組織的細(xì)胞中的ACTN4的復(fù)制數(shù)。當(dāng)所述基因的復(fù)制數(shù)超過4時，預(yù)測為來自所述哺乳動物的I期肺腺癌為預(yù)后不良的I期肺腺癌。
文檔編號G01N33/53GK102947446SQ20118001542
公開日2013年2月27日 申請日期2011年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月30日
發(fā)明者本田一文, 山田哲司, 野呂林太郎, 廣橋說雄 申請人:日本健康科學(xué)財(cái)團(tuán)