專利名稱：標(biāo)記化探針-水溶性載體復(fù)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在水溶性載體上結(jié)合兩種以上的探針、進(jìn)一步結(jié)合標(biāo)記物而成的標(biāo)記化探針-水溶性載體復(fù)合物的制作方法；利用該方法制作的標(biāo)記化探針-水溶性載體復(fù)合物；及其使用方法。通過使用該標(biāo)記化探針-水溶性載體復(fù)合物，能夠高靈敏度地進(jìn)行穩(wěn)定的檢測和測定。
背景技術(shù)：
在使用跟被測物質(zhì)特異性結(jié)合的探針與標(biāo)記物的結(jié)合物、以被測物質(zhì)與標(biāo)記物藉由探針的結(jié)合量為指標(biāo)來對被測物質(zhì)進(jìn)行檢測和測定的方法中，其靈敏度通常由探針和標(biāo)記物的分子數(shù)來決定。即，標(biāo)記物相對于I分子探針?biāo)Y(jié)合的分子數(shù)是有限的，該比例決定了靈敏度。
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因此，通過對探針本身進(jìn)行聚合化來制作聚合物，由此會(huì)增大分子量，通過增加與該聚合物結(jié)合的標(biāo)記物的分子數(shù)來進(jìn)行反應(yīng)性得到提高的高靈敏度化(專利文獻(xiàn)I)。但是，探針聚合化的調(diào)節(jié)并不容易，尚未達(dá)到實(shí)用化。另外還提出了將酶標(biāo)記物和探針單獨(dú)地共價(jià)鍵合在聚賴氨酸、氨基葡聚糖等載體上所得到的分子量增大、標(biāo)記物的結(jié)合數(shù)多的標(biāo)記物探針復(fù)合物(專利文獻(xiàn)2)。但是，利用該技術(shù)盡管可增加反應(yīng)性，但空白值下的反應(yīng)也會(huì)增加，尚未達(dá)到檢測和測定時(shí)的高靈敏度化。進(jìn)一步提出了下述提案使酶標(biāo)記物結(jié)合在聚賴氨酸等載體上并藉由載體上的標(biāo)記物從而結(jié)合有探針的標(biāo)記物-探針復(fù)合物(專利文獻(xiàn)3);使探針結(jié)合在葡聚糖等載體上，藉由載體上的探針從而結(jié)合有標(biāo)記物的水溶性載體-探針復(fù)合物(專利文獻(xiàn)4);使親水性的中介物結(jié)合在載體上從而在中介物上結(jié)合有探針和檢測標(biāo)記的標(biāo)記物的探針復(fù)合物(專利文獻(xiàn)5);在藉由酶標(biāo)記物結(jié)合有2分子以上的載體的復(fù)合物上結(jié)合有探針的嵌段化標(biāo)記物探針(專利文獻(xiàn)6)。但是，上述現(xiàn)有技術(shù)中還存在反應(yīng)性增加的同時(shí)空白值下的反應(yīng)也會(huì)增加這樣的技術(shù)課題，在以信號/噪音比的形式來評價(jià)反應(yīng)性的情況下，難以得到高靈敏度且穩(wěn)定的復(fù)合物。并且，在復(fù)合物的形成中，若首先進(jìn)行載體與探針或標(biāo)記物的結(jié)合，則由于載體的多官能性而難以再現(xiàn)性良好地制作所期望的復(fù)合物?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I :日本特開平11-295313號公報(bào)專利文獻(xiàn)2 :日本特開2000-88850號公報(bào)專利文獻(xiàn)3 :日本特開2001-181299號公報(bào)專利文獻(xiàn)4 :日本特開2003-194821號公報(bào)專利文獻(xiàn)5 :國際公開2006/011543專利文獻(xiàn)6 :國際公開2006/07073
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題為了使用跟被測物質(zhì)特異性結(jié)合的探針與標(biāo)記物的結(jié)合物，以被測物質(zhì)與標(biāo)記物藉由探針的結(jié)合量為指標(biāo)，高靈敏度地進(jìn)行被測物質(zhì)的檢測和測定，在I分子探針與標(biāo)記物的結(jié)合物中必須含有大量的標(biāo)記物。因此，需要制作大分子的探針與標(biāo)記物的結(jié)合物。但是，在使用會(huì)形成大分子結(jié)合物的載體的情況下，盡管反應(yīng)性增加，但空白值下的反應(yīng)也增加，結(jié)果難以得到高靈敏度且穩(wěn)定的復(fù)合物。另外，若作為形成復(fù)合物的最初階段進(jìn)行載體與探針或標(biāo)記物的結(jié)合，則由于載體的多官能性而難以再現(xiàn)性良好地制作所期望的復(fù)合物。因此，期待穩(wěn)定地制作可解決上述課題的結(jié)合物和穩(wěn)定地制作該結(jié)合物的方法。解決課題的手段本發(fā)明人想到，在標(biāo)記化探針-載體復(fù)合物的制作中，在探針與標(biāo)記物的結(jié)合中·利用親和素類與生物素的特異性結(jié)合，并且發(fā)現(xiàn)，通過在與載體結(jié)合之前進(jìn)行親和素類與探針的結(jié)合，能夠再現(xiàn)性良好地制作靈敏度極高且穩(wěn)定的復(fù)合物。此外發(fā)現(xiàn)，在為了化學(xué)結(jié)合而進(jìn)行探針的化學(xué)修飾時(shí)，向探針導(dǎo)入硫羥基不會(huì)對探針的結(jié)合能力帶來影響；進(jìn)而通過使用水溶性載體作為載體，構(gòu)建出了在以高靈敏度穩(wěn)定地檢測和測定中有用的標(biāo)記化探針-水溶性載體復(fù)合物。S卩，本發(fā)明涉及包括以下工序的標(biāo)記化探針-水溶性載體復(fù)合物的制作方法。工序I.使具有硫羥基、可與被測物質(zhì)結(jié)合的探針與具有馬來酰亞胺基的親和素類結(jié)合，制成探針結(jié)合體；工序2.接下來，使具有硫羥基的所述探針結(jié)合體與具有馬來酰亞胺基的高分子水溶性載體結(jié)合，制成探針結(jié)合體-水溶性載體復(fù)合物；和工序3.進(jìn)一步將所述探針結(jié)合體-水溶性載體復(fù)合物與生物素化標(biāo)記物混合，使探針結(jié)合體-水溶性載體復(fù)合物的親和素類與生物素化標(biāo)記物的生物素結(jié)合。本發(fā)明還涉及通過該工序制作的標(biāo)記化探針-水溶性載體復(fù)合物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及使用了通過上述工序制作的標(biāo)記化探針-水溶性載體復(fù)合物的測定法、免疫測定法或高靈敏度測定法。本發(fā)明中，“探針”意味著與被測物質(zhì)相互作用的結(jié)合伙伴，作為非限定性示例，可以舉出抗體或者抗體片段、蛋白G、蛋白A、蛋白L、凝集素或受體等。另外，作為抗體或抗體片段的非限定性示例，可以舉出Fab’、F(ab’)2、Fab或IgG等。另外，作為該抗體或抗體片段，可以使用兩種以上的抗體或抗體片段。本發(fā)明中，“親和素類”意味著為低分子堿性糖蛋白的親和素、與其類似的蛋白質(zhì)或其片段等與生物素化合物形成穩(wěn)定復(fù)合物的物質(zhì)，作為該“親和素類”的非限定性示例，可以舉出親和素或鏈霉親和素等。本發(fā)明中，“水溶性載體”優(yōu)選分子量為50萬以上。作為本發(fā)明中水溶性載體的非限定性示例，可以舉出葡聚糖、氨基葡聚糖、糊精、集束糊精(Cluster Dextrin)、聚蔗糖或
普魯蘭多糖等。本發(fā)明中使用“生物素化標(biāo)記物”。此處的“生物素”為維生素B復(fù)合物的一種，已知與親和素有非常強(qiáng)力的結(jié)合。作為本發(fā)明中的“生物素化標(biāo)記物”的非限定性示例，可以舉出生物素化熒光素酶、生物素化堿性磷酸酶、生物素化POD(過氧化物酶，peroxidase)、生物素化GOD (葡糖氧化酶，glucose oxidase)、生物素化FITC (異硫氰酸突光素，fluorescein isothiocyanate)、生物素化B丫唳鐵、生物素化B丫唳鐵衍生物或生物素化三(2，2’-聯(lián)吡啶)釕(II)等。該“生物素化標(biāo)記物”中的生物素與標(biāo)記物的結(jié)合中，可以利用包括化學(xué)修飾等已知的任意手段，特別優(yōu)選利用基因重組。這是因?yàn)?，由于不進(jìn)行化學(xué)結(jié)合所用的化學(xué)修飾，不會(huì)降低該標(biāo)記物的活性。本發(fā)明的工序I中，在可與被測物質(zhì)結(jié)合的探針不具有足夠的硫羥基的情況下，首先向該探針導(dǎo)入硫羥基。在硫羥基的導(dǎo)入中可以使用任何已知的方法，在探針為抗體或抗體片段的情況下，使用2-巰基乙醇等還原劑，通過對內(nèi)在的二硫鍵進(jìn)行還原來導(dǎo)入硫羥基，從而可使得對探針結(jié)合能力的影響為最小限，因而是特別有利的。接下來，向親和素類中導(dǎo)入馬來酰亞胺基。馬來酰亞胺基的導(dǎo)入可以使用任何已知的方法，例如可使用Sulfo-KMUS(同仁化學(xué)社制造)之類的已知的馬來酰亞胺試劑。
在具有硫羥基且可與被測物質(zhì)結(jié)合的探針與具有馬來酰亞胺基的親和素類的結(jié)合中，可以使用任何已知的方法。例如，可將探針和親和素類分別在適當(dāng)濃度下溶解于緩沖液中，通過使該溶解液發(fā)生反應(yīng)來進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。另外，為在以后的工序中回避非特異反應(yīng)，可以在上述結(jié)合反應(yīng)完成后使用2-巰基乙醇等硫醇試劑來封閉未反應(yīng)的馬來酰亞胺基。封閉后的探針-親和素類結(jié)合體可以通過凝膠過濾等已知的方法進(jìn)行精制。本發(fā)明的工序2中，首先向工序I中制作的探針-親和素類結(jié)合體中導(dǎo)入硫羥基。硫羥基的導(dǎo)入可以采用例如使用2-亞氨基硫烷等已知的任意方法。向水溶性載體中導(dǎo)入馬來酰亞胺基時(shí)可以使用任何已知的方法。例如，通過使水溶性載體與酸反應(yīng)來導(dǎo)入羧基，通過透析等去除該酸后，使用乙二胺等已知的氨基導(dǎo)入試齊U，將羧基置換為氨基。置換后，通過透析等除去未反應(yīng)的氨基導(dǎo)入試劑，加入已知的馬來酰亞胺試劑進(jìn)行反應(yīng)，由此可得到具有馬來酰亞胺基的水溶性載體。具有硫羥基的探針-親和素類結(jié)合體與具有馬來酰亞胺基的水溶性載體的結(jié)合可以使用任何已知的方法。另外，為了在以后的工序中回避非特異反應(yīng)，優(yōu)選在結(jié)合反應(yīng)完成后使用2-巰基乙醇等硫醇試劑來封閉導(dǎo)入至水溶性載體中的未反應(yīng)的馬來酰亞胺基。封閉后的探針結(jié)合體-水溶性載體復(fù)合物可以通過凝膠過濾等已知的方法進(jìn)行精制。本發(fā)明的工序3中，通過將上述探針結(jié)合體-水溶性載體復(fù)合物與生物素化標(biāo)記物混合，使探針結(jié)合體-水溶性載體復(fù)合物的親和素類與生物素化標(biāo)記物的生物素進(jìn)行結(jié)合。如上所述，由于親和素類與生物素的親和性非常強(qiáng)，因此可以例如分別以適當(dāng)?shù)臐舛戎苽涮结樈Y(jié)合體-水溶性載體復(fù)合物和生物素化標(biāo)記物，并將該制備液混合，由此來進(jìn)行該親和素類與生物素的結(jié)合反應(yīng)。對于通過本發(fā)明的工序而制作的標(biāo)記化探針-水溶性載體復(fù)合物，由于該探針與目的被測物質(zhì)高靈敏度且穩(wěn)定地進(jìn)行反應(yīng)，因而可在任何已知的測定法中加以利用。另外，在該探針為抗體或抗體片段的情況下，本發(fā)明的標(biāo)記化探針-水溶性載體復(fù)合物可以在任何已知的免疫測定法中加以利用。進(jìn)一步地，通過本發(fā)明的工序制作的標(biāo)記化探針-水溶性載體復(fù)合物即使在長期保存后也極為穩(wěn)定。即使在37°C進(jìn)行I周的加速穩(wěn)定性試驗(yàn)，其也保持了經(jīng)時(shí)穩(wěn)定性。
本發(fā)明中，作為一例，在生物素化標(biāo)記物中使用生物素化熒光素酶、作為探針使用Fab’、作為親和素類使用鏈霉親和素、作為水溶性載體使用葡聚糖(T2000)進(jìn)行了說明，但并不限于本例。將IgG抗體利用胃蛋白酶消化，向所得到的F(ab’)2中加入2_巰基乙醇進(jìn)行還原處理，之后通過凝膠過濾進(jìn)行精制，得到具有硫羥基的Fab’。另一方面，向鏈霉親和素中加入導(dǎo)入馬來酰亞胺基的試劑進(jìn)行處理后，通過凝膠過濾進(jìn)行精制，得到導(dǎo)入有馬來酰亞胺基的鏈霉親和素。將利用上述方法得到的導(dǎo)入有硫羥基的Fab’和導(dǎo)入有馬來酰亞胺基的鏈霉親和素混合來進(jìn)行反應(yīng)，之后添加2-巰基乙醇封閉未反應(yīng)的馬來酰亞胺基，通過凝膠過濾進(jìn)行精制，得到Fab’ -鏈霉親和素結(jié)合體。向所得到的Fab’_鏈霉親和素結(jié)合體中加入2-亞氨基硫烷來進(jìn)行反應(yīng)，之后通過 凝膠過濾進(jìn)行精制，得到導(dǎo)入有硫羥基的Fab’ -鏈霉親和素結(jié)合體。制作葡聚糖(T2000)中導(dǎo)入有氨基的氨基葡聚糖，進(jìn)一步加入馬來酰亞胺試劑來進(jìn)行反應(yīng)，之后通過凝膠過濾進(jìn)行精制，得到導(dǎo)入有馬來酰亞胺基的葡聚糖(T2000)。將通過上述方法得到的導(dǎo)入有硫羥基的Fab’ -鏈霉親和素結(jié)合體和導(dǎo)入有馬來酰亞胺基的葡聚糖(T2000)混合來進(jìn)行反應(yīng)，之后添加2-巰基乙醇來封閉未反應(yīng)的馬來酰亞胺基，通過凝膠過濾進(jìn)行精制，得到Fab’ -鏈霉親和素結(jié)合體-葡聚糖復(fù)合物。將所得到的Fab’ -鏈霉親和素結(jié)合體-葡聚糖(T2000)復(fù)合物與生物素化熒光素酶混合來進(jìn)行反應(yīng)，得到熒光素酶標(biāo)記Fab’ -葡聚糖(T2000)復(fù)合物。使用所得到的熒光素酶標(biāo)記Fab’ -葡聚糖(T2000)復(fù)合物作為標(biāo)記抗體，與另外準(zhǔn)備的固定有抗體的固相進(jìn)行組合，進(jìn)行夾心免疫分析，由此完成高靈敏度的檢測和測定法。雖然并非是要拘泥于理論，但可認(rèn)為，通過本發(fā)明，與現(xiàn)有情況相比再現(xiàn)性良好地得到了靈敏度極高且穩(wěn)定的標(biāo)記化探針-水溶性載體復(fù)合物這一點(diǎn)的主要原因在于，藉由親和素類與生物素的高親和性來進(jìn)行探針與標(biāo)記物的結(jié)合、且在與載體結(jié)合之前進(jìn)行該探針與親和素類的結(jié)合。探針與親和素類的結(jié)合、以及親和素類與生物素的結(jié)合中，容易對與該結(jié)合相關(guān)的分子數(shù)比等進(jìn)行調(diào)節(jié)，因而可再現(xiàn)性良好且穩(wěn)定地制作具有同等結(jié)構(gòu)的標(biāo)記化探針-水溶性載體復(fù)合物。并且認(rèn)為，如此穩(wěn)定地制作出的標(biāo)記化探針-水溶性載體復(fù)合物所具有的結(jié)構(gòu)極其適合于在相對抑制構(gòu)成噪音的非特異性反應(yīng)的同時(shí)僅增加構(gòu)成信號的特異性反應(yīng)。發(fā)明的效果通過實(shí)施本發(fā)明，能夠再現(xiàn)性良好地得到與被測物質(zhì)特異性地結(jié)合的高靈敏度且穩(wěn)定的標(biāo)記化探針-水溶性載體復(fù)合物，通過使用該標(biāo)記化探針-水溶性載體復(fù)合物，能夠高靈敏度且穩(wěn)定地進(jìn)行檢測和測定。


圖I為IgG-鏈霉親和素結(jié)合體-葡聚糖(T2000)復(fù)合物的洗脫分布圖。圖2為Fab’(cll-9+cll-14)-鏈霉親和素結(jié)合體-葡聚糖(T2000)復(fù)合物的洗脫分布圖。
圖3為Fab’(cl 1_9)-鏈霉親和素結(jié)合體-葡聚糖(T2000)復(fù)合物的洗脫分布圖。圖4為Fab’(cll_14)-鏈霉親和素結(jié)合體-葡聚糖(T2000)復(fù)合物的洗脫分布圖。圖5為Fab’(cll-9+cll-14)-鏈霉親和素結(jié)合體-葡聚糖(T500)復(fù)合物的洗脫分布圖。圖6為FITC標(biāo)記Fab’與FITC標(biāo)記Fab’ -葡聚糖復(fù)合物的反應(yīng)性的比較。
具體實(shí)施例方式使固定化有用于與被測物質(zhì)特異性地結(jié)合的探針的不溶性載體與檢體發(fā)生反應(yīng)，之后去除檢體進(jìn)行清洗，其后加入標(biāo)記化探針-水溶性載體復(fù)合物進(jìn)行反應(yīng)，再次去除清洗后對不溶性載體上的標(biāo)記物的活性進(jìn)行測定，由此來進(jìn)行檢體中的被測物質(zhì)的檢測和測 定。實(shí)施例I通丄寸還原處理.來吿1丨備具有硫釋基的IgG將抗HCV核心抗原小鼠單克隆IgG抗體Cl 1-9和Cl 1-14溶解在O. IM磷酸緩沖液(ρΗ7· 2)中，分別制備5mg/mL的溶液。向這些IgG溶液300 μ L中添加O. 2Μ的2-巰基乙醇(和光純藥社制造)30μ L，在37°C進(jìn)行I. 5小時(shí)反應(yīng)。反應(yīng)后，利用H)-10(GE Healthcare社制造)進(jìn)行凝膠過濾精制，得到具有硫羥基的IgG，該硫羥基是對抗體內(nèi)存在的二硫鍵進(jìn)行還原而得到的。對各硫羥基的數(shù)目進(jìn)行定量，結(jié)果確認(rèn)到每I分子IgG中存在有8. O個(gè)硫輕基。實(shí)施例2通過還原處理來制備具有硫羥基的Fab’將抗HCV核心抗原小鼠單克隆IgG抗體Cl 1-9和cll_14溶解在O. IM乙酸鈉緩沖液(pH4. 5)中，制備成10mg/mL。接下來，向ImL這些IgG溶液中添加胃蛋白酶O. 2mg,在37°C攪拌6小時(shí)，使IgG被胃蛋白酶消化。胃蛋白酶消化后，利用2NNaOH中和，進(jìn)一步利用Superdex200柱(GE Healthcare社制造)進(jìn)行精制，從而得到F(ab’)2。向各3. Omg/mL的F(ab’ )21300 μ L中添加O. 2Μ的2_巰基乙醇(和光純藥社制造)13(^1^，在371進(jìn)行1.5小時(shí)反應(yīng)。反應(yīng)后，利用H)-10(GE Healthcare社制造)進(jìn)行凝膠過濾精制，得到具有硫羥基的Fab’，該硫羥基是對抗體內(nèi)存在的二硫鍵進(jìn)行還原而得到的。對各硫羥基的數(shù)目進(jìn)行定量，其結(jié)果，在cll-9中確認(rèn)到每I分子Fab’中存在3. 3個(gè)硫羥基、在cll-14中確認(rèn)到每I分子Fab’中存在3. 4個(gè)硫羥基。實(shí)施例3向鏈霉親和素中導(dǎo)入馬來釀亞胺基將20mg的鏈霉親和素(MP Bio社制造)溶解在O. IM磷酸緩沖液(pH7. 2) 2mL中，向二甲基甲酰胺中加入以6mg/mL進(jìn)行溶解的馬來酰亞胺試劑Sulf0_KMUS(同仁化學(xué)社制造)133 μ L。在30°C反應(yīng)I小時(shí)后，利用PD-IO (GE Healthcare社制造)進(jìn)行凝膠過濾精制，得到導(dǎo)入有馬來酰亞胺基的鏈霉親和素。對馬來酰亞胺基的數(shù)目進(jìn)行定量，結(jié)果確認(rèn)到每I分子鏈霉親和素中存在3. 7個(gè)馬來酰亞胺基。實(shí)施例4
IrG-鏈霉親和素結(jié)合體的制作將實(shí)施例I中制作的cll-9和cll-14的導(dǎo)入有硫羥基的IgG溶解在O. IM磷酸緩沖液(pH7. 2)中，分別制備出2. 5mg/mL的導(dǎo)入有硫羥基的IgG溶液。另一方面，將實(shí)施例3中制作的導(dǎo)入有馬來酰亞胺基的鏈霉親和素溶解在O. IM磷酸緩沖液(pH7. 2)中，制備出
13.Omg/mL的導(dǎo)入有馬來酰亞胺基的鏈霉親和素溶液。接下來，向各導(dǎo)入有硫羥基的IgG溶液500 μ L中添加導(dǎo)入有馬來酰亞胺基的鏈霉親和素溶液38 μ L，在30°C進(jìn)行I小時(shí)反應(yīng)。反應(yīng)后，添加O. 2M的2-巰基乙醇(和光純藥社制造)54 μ L，在4°C進(jìn)行一晚反應(yīng)，封閉未反應(yīng)的馬來酰亞胺基。反應(yīng)后，利用Superdex200柱(GE Healthcare社制造)進(jìn)行凝膠過濾精制,得到IgG-鏈霉親和素結(jié)合體。實(shí)施例5 熒光素酶標(biāo)記IgG的制作向?qū)嵤├?中制作的10 μ M的cll-9和cll_14的IgG-鏈霉親和素結(jié)合體50 μ L中加入61 μ M的生物素化熒光素酶(Kikkoman社制造)8. 2 μ L，在25°C進(jìn)行I小時(shí)反應(yīng)，由此來制作熒光素酶標(biāo)記IgG。實(shí)施例6Fab’ -鏈霉親和素結(jié)合體的制作將實(shí)施例2中制作的cll-9和cll-14的導(dǎo)入有硫羥基的Fab’溶解在O. IM磷酸緩沖液(PH7. 2)中，分別制備出2. 6mg/mL的導(dǎo)入有硫羥基的Fab’溶液。另一方面，將實(shí)施例3中制作的導(dǎo)入有馬來酰亞胺基的鏈霉親和素溶解在O. IM磷酸緩沖液(pH7. 2)中，制備出13. Omg/mL的導(dǎo)入有馬來酰亞胺基的鏈霉親和素溶液。接下來，向各導(dǎo)入有硫羥基的Fab’溶液1400 μ L中添加導(dǎo)入有馬來酰亞胺基的鏈霉親和素溶液365 μ L，在30°C進(jìn)行I小時(shí)反應(yīng)。反應(yīng)后，添加O. 2M的2-巰基乙醇(和光純藥社制造)177 μ L，在4°C反應(yīng)一晚，封閉未反應(yīng)的馬來酰亞胺基。反應(yīng)后，利用Superdex200柱(GE Healthcare社制造)進(jìn)行凝膠過濾精制，得到Fab’-鏈霉親和素結(jié)合體。實(shí)施例7熒光素酶標(biāo)記Fab’的制作向?qū)嵤├?中制作的26. 4μΜ的cll-9和cll-14的Fab，-鏈霉親和素結(jié)合體10 μ L中加入61 μ M的生物素化熒光素酶(Kikkoman社制造)4. 3 μ L，在25°C進(jìn)行I小時(shí)反應(yīng)，由此來制作熒光素酶標(biāo)記Fab’。實(shí)施例8向?qū)胗邪被钠暇厶侵袑?dǎo)入馬來酰亞胺基分別將2g的葡聚糖(T2000)和葡聚糖(T500)與4. 7g 一氯乙酸溶解在50mL的3NNaOH溶液中，在室溫下進(jìn)行70分鐘攪拌，由此向葡聚糖(T2000)和葡聚糖(T500)導(dǎo)入羧基。接著添加磷酸二氫鈉O. 2g，利用6N HCl中和混合液來使反應(yīng)停止，通過透析除去未反
應(yīng)的一氯乙酸。透析后，添加16. 4g的乙二胺與1.2g的I-乙基_3-(3_ 二甲氨基丙基)碳二亞胺，在室溫下攪拌4小時(shí)，由此將導(dǎo)入至葡聚糖(T2000)和葡聚糖(T500)中的羧基轉(zhuǎn)換為氨基。接下來，通過透析除去未反應(yīng)的乙二胺與碳二亞胺，通過冷凍干燥回收氨基葡聚糖(T2000)和氨基葡聚糖(T500)。分別將I. 5mg的氨基葡聚糖(T2000)和氨基葡聚糖(T500)溶解在O. IM磷酸緩沖液(PH7. 2) 3mL中，加入以12mg/mL溶解在二甲基甲酰胺中的馬來酰亞胺試劑Sulfo-KMUS (同仁化學(xué)社制造)30 μ L，在37°C進(jìn)行30分鐘反應(yīng)。反應(yīng)后，利用I3D-IO (GEHealthcare社制造)進(jìn)行凝膠過濾精制，得到導(dǎo)入有馬來酰亞胺基的氨基葡聚糖(T2000)和氨基葡聚糖(T500)。對馬來酰亞胺基的數(shù)目進(jìn)行定量，結(jié)果確認(rèn)到，在每I分子葡聚糖(T2000)中存在294個(gè)馬來酰亞胺基、在每I分子葡聚糖(T500)中存在65個(gè)馬來酰亞胺基。實(shí)施例9IrG-鏈霉親和素結(jié)合體_葡聚糖復(fù)合物的制作分別將實(shí)施例4中制作的cll-9和cll-14的IgG-鏈霉親和素結(jié)合體利用O. IM磷酸緩沖液(PH7. 2)進(jìn)行溶解，制成2. 5mg/mL的溶液，進(jìn)行等量混合，制備出IgG-鏈霉親·和素結(jié)合體溶液。向該IgG-鏈霉親和素結(jié)合體溶液264 μ L中添加以lmg/mL溶解在二甲基甲酰胺中的2-亞氨基硫烷(PIERCE社制造)2 μ L，在30°C進(jìn)行30分鐘反應(yīng)。反應(yīng)后，利用PD-10 (GEHealthcare社制造)進(jìn)行凝膠過濾精制,得到導(dǎo)入有硫輕基的IgG-鏈霉親和素結(jié)合體。對硫羥基的數(shù)目進(jìn)行定量，結(jié)果確認(rèn)到在每I分子的IgG-鏈霉親和素結(jié)合體中存在4. 8個(gè)硫羥基。接下來，在實(shí)施例8中制作的O. 625 μ M的導(dǎo)入有馬來酰亞胺基的氨基葡聚糖(Τ2000)溶液40 μ L中混合8. 6 μ M的導(dǎo)入有硫羥基的IgG-鏈霉親和素結(jié)合體290 μ L，在30°C靜置I小時(shí)。其后，添加O. 2M的2-巰基乙醇(和光純藥社制造)33yL，在4°C反應(yīng)一晚，封閉未反應(yīng)的馬來酰亞胺基。反應(yīng)后，利用Superdex200柱(GE Healthcare社制造)進(jìn)行凝膠過濾精制，由圖I所示的空穴峰(^ F'e—)級分得到IgG-鏈霉親和素結(jié)合體-葡聚糖(T2000)復(fù)合物。實(shí)施例10向IgG-鏈霉親和素結(jié)合體-葡聚糖復(fù)合物中導(dǎo)入牛物素化熒光素酶對于實(shí)施例9中制作的IgG-鏈霉親和素結(jié)合體-葡聚糖(T2000)復(fù)合物，使用O. IM磷酸緩沖液(pH7. 2)將IgG-鏈霉親和素結(jié)合體濃度調(diào)整為570nM。向該IgG-鏈霉親和素結(jié)合體-葡聚糖(T2000)復(fù)合物溶液300 μ L中加入61 μ M的生物素化熒光素酶(Kikkoman社制造)溶液3. O μ L，在25°C進(jìn)行I小時(shí)反應(yīng)，由此得到熒光素酶標(biāo)記IgG-葡聚糖(T2000)復(fù)合物。實(shí)施例11Fab’ -鏈霉親和素結(jié)合體-葡聚糖復(fù)合物的制作向?qū)嵤├?中制作的4. Omg/mL的cll-9Fab’_鏈霉親和素結(jié)合體420 μ L和2. 6mg/mL的cll-14Fab’ -鏈霉親和素結(jié)合體646 μ L中添加以lmg/mL溶解在二甲基甲酰胺中的2-亞氨基硫烷(PIERCE社制造)2 μ L，在30°C進(jìn)行30分鐘反應(yīng)。反應(yīng)后，利用F1D-IO (GE Healthcare社制造)進(jìn)行凝膠過濾精制,得到導(dǎo)入有硫羥基的各Fab’ -鏈霉親和素結(jié)合體。對硫羥基的數(shù)目進(jìn)行定量，結(jié)果確認(rèn)到在每I分子cll-9Fab’_鏈霉親和素結(jié)合體中存在有4. 6個(gè)硫羥基、在每I分子cll_14Fab’_鏈霉親和素結(jié)合體中存在有3. O個(gè)硫羥基。接下來，將實(shí)施例8中制作的導(dǎo)入有馬來酰亞胺基的氨基葡聚糖(T2000)和(T500)與導(dǎo)入有硫羥基的Fab’-鏈霉親和素結(jié)合體混合，在30°C靜置I小時(shí)。另外，導(dǎo)入有馬來酰亞胺基的各氨基葡聚糖與導(dǎo)入有硫羥基的各Fab’ -鏈霉親和素結(jié)合體按以下所示的濃度、液量進(jìn)行組合，制作合計(jì)4種的聚合物。I)混合有C11-9和C11-14的Fab’-鏈霉親和素結(jié)合體-葡聚糖(T2000)復(fù)合物將21 μ M的導(dǎo)入有硫羥基的cll-9Fab’_鏈霉親和素結(jié)合體200 μ L、18 μ M的導(dǎo)入有硫羥基的cll-14Fab’ -鏈霉親和素結(jié)合體240 μ L、以及O. 625 μ M的導(dǎo)入有馬來酰亞胺基的氨基葡聚糖(Τ2000) 142 μ L混合。2)cll_9Fab’ -鏈霉親和素結(jié)合體-葡聚糖(T2000)復(fù)合物將21 μ M的導(dǎo)入有硫羥基的cll_9Fab’ -鏈霉親和素結(jié)合體200 μ L與O. 625 μ M 的導(dǎo)入有馬來酰亞胺基的氨基葡聚糖(Τ2000) 71 μ L混合。3)cll_14Fab’ -鏈霉親和素結(jié)合體-葡聚糖(T2000)復(fù)合物將18 μ M的導(dǎo)入有硫羥基的cll-14Fab’_鏈霉親和素結(jié)合體240 μ L與O. 625 μ M的導(dǎo)入有馬來酰亞胺基的氨基葡聚糖(Τ2000) 71 μ L混合。4)混合有cll-9和cll-14的Fab’ -鏈霉親和素結(jié)合體_葡聚糖(T500)復(fù)合物將21 μ M的導(dǎo)入有硫羥基的cll-9Fab’_鏈霉親和素結(jié)合體200 μ L、18 μ M的導(dǎo)入有硫羥基的cll-14Fab’ -鏈霉親和素結(jié)合體240 μ L、以及2. 5 μ M的導(dǎo)入有馬來酰亞胺基的氨基葡聚糖(Τ500) 116 μ L混合。反應(yīng)后，添加各復(fù)合物溶液的1/10量的O. 2Μ的2-巰基乙醇(和光純藥社制造)，在4°C反應(yīng)一晚,封閉未反應(yīng)的馬來酰亞胺基。次日，利用Superdex200柱(GE Healthcare社制造)進(jìn)行凝膠過濾精制，由圖2 5所示的各樣品的空穴峰級分得到Fab’ -鏈霉親和素結(jié)合體-葡聚糖復(fù)合物。實(shí)施例12向Fab’ -鏈霉親和素結(jié)合體-葡聚糖復(fù)合物中導(dǎo)入牛物素化熒光素酶對于實(shí)施例11中制作的4種Fab’-鏈霉親和素結(jié)合體-葡聚糖復(fù)合物，使用O. IM磷酸緩沖液(PH7. 2)將Fab’ -鏈霉親和素結(jié)合體濃度調(diào)整為I. 8 μ M。向這些Fab’ -鏈霉親和素結(jié)合體-葡聚糖復(fù)合物溶液100 μ L中加入61 μ M的生物素化熒光素酶(Kikkoman社制造)3. O μ L，通過在25°C進(jìn)行I小時(shí)反應(yīng)，得到以下所示的4種熒光素酶標(biāo)記Fab’ -葡聚糖復(fù)合物。I)熒光素酶標(biāo)記cll-9 · cll_14Fab，_葡聚糖(T2000)復(fù)合物2)熒光素酶標(biāo)記cll_9Fab’ -葡聚糖(T2000)復(fù)合物3)熒光素酶標(biāo)記cll_14Fab’ -葡聚糖(T2000)復(fù)合物4)熒光素酶標(biāo)記cll-9 · cll_14Fab，_葡聚糖(T500)復(fù)合物實(shí)施例13使用熒光素酶標(biāo)記抗體的酶免疫測定利用使用了 WSC的碳二亞胺法，將抗HCV核心抗原小鼠單克隆抗體cll-3、cll_7、和A0T3固定于磁性顆粒，制作O. 2%抗體固相化磁性顆粒。另一方面，將正常人血清和經(jīng)PCR確認(rèn)的兩種HCV陽性血清100 μ L與檢體處理液(6Μ鹽酸胍、O. 5NHC1U2. 5%TritonX100、O. 75%Tween20) 100 μ L混合，在37°C放置15分鐘，由此進(jìn)行檢體的前處理，之后將反應(yīng)液(O. IM 磷酸鈉、O. 15MNaCl、l%BSA、0. 5% 酪蛋白、O. 05%Tween20、pH7. 3) 140 μ L 與 IM Tris 緩沖液20 μ L混合，向該混合液160 μ L中加入前處理檢體80 μ L，由此中和前處理檢體。接下來，向經(jīng)中和的前處理檢體240 μ L中加入O. 2%抗體固相化磁性顆粒20 μ L,在37°C放置15分鐘，由此進(jìn)行I次反應(yīng)。反應(yīng)后，將磁性顆粒利用清洗液清洗3次，添加實(shí)施例5中制作的熒光素酶標(biāo)記IgG和實(shí)施例10中制作的熒光素酶標(biāo)記IgG-葡聚糖(T2000)復(fù)合物。對于標(biāo)記抗體的量，加入120 μ L以熒光素酶濃度計(jì)稀釋至18ηΜ的標(biāo)記抗體，攪拌后進(jìn)一步在37°C進(jìn)行15分鐘反應(yīng)。反應(yīng)后，將磁性顆粒用清洗液清洗3次，再懸浮于50mM Tris 緩沖液(pH8. 5) 100 μ L 中。向再懸浮有磁性顆粒的管中加入底物溶液(熒光素)100yL，使用LumatLB9507 (Berthold社制造)來測定突光素酶的發(fā)光。在發(fā)光測定中，在自添加突光素O. 5秒之后起累計(jì)5秒鐘的發(fā)光。其結(jié)果，如表I所示，熒光素酶標(biāo)記IgG-葡聚糖(T2000)復(fù)合物顯示出了高于熒光素酶標(biāo)記IgG的發(fā)光值。若由樣本檢體( 木&検體)M的S/N比進(jìn)行估算，則反應(yīng)性提高大致50 100倍左右。表I
權(quán)利要求
1.一種標(biāo)記化探針-水溶性載體復(fù)合物的制作方法，其包括下述工序 工序I.使具有硫羥基、可與被測物質(zhì)結(jié)合的探針與具有馬來酰亞胺基的親和素類結(jié)合，制成探針結(jié)合體； 工序2.接下來，使具有硫羥基的所述探針結(jié)合體與具有馬來酰亞胺基的高分子水溶性載體結(jié)合，制成探針結(jié)合體-水溶性載體復(fù)合物；和 工序3.進(jìn)一步將所述探針結(jié)合體-水溶性載體復(fù)合物與生物素化標(biāo)記物混合，使探針結(jié)合體-水溶性載體復(fù)合物的親和素類與生物素化標(biāo)記物的生物素結(jié)合。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中，親和素類為親和素或鏈霉親和素。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其中，水溶性載體的分子量為50萬以上。
4.如權(quán)利要求I 3任一項(xiàng)所述的方法，其中，水溶性載體選自葡聚糖、氨基葡聚糖、糊精、集束糊精、聚蔗糖或普魯蘭多糖。
5.如權(quán)利要求I 4任一項(xiàng)所述的方法，其中，可與被測物質(zhì)結(jié)合的探針為抗體或抗體片段。
6.如權(quán)利要求I 5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，該方法使用兩種以上的抗體或抗體片段。
7.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其中，抗體或抗體片段選自Fab’、F(ab’)2、Fab或IgG0
8.如權(quán)利要求I 4任一項(xiàng)所述的方法，其中，可與被測物質(zhì)結(jié)合的探針選自蛋白G、蛋白A、蛋白L、凝集素或受體。
9.如權(quán)利要求I 8任一項(xiàng)所述的方法，其中，生物素化標(biāo)記物選自生物素化熒光素酶、生物素化堿性磷酸酶、生物素化POD、生物素化GOD、生物素化FITC、生物素化吖啶鎗、生物素化吖啶鎗衍生物或生物素化三(2，2’ -聯(lián)吡啶)釕(II)。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，生物素化熒光素酶是通過基因重組制作的。
11.一種標(biāo)記化探針-水溶性載體復(fù)合物，其是通過權(quán)利要求I 10任一項(xiàng)所述的方法來制作的。
12.一種測定法，其使用通過權(quán)利要求I 10任一項(xiàng)所述的方法制作的標(biāo)記化探針-水溶性載體復(fù)合物。
13.一種免疫測定法，其使用通過權(quán)利要求I 7或9 10任一項(xiàng)所述的方法制作的標(biāo)記化探針-水溶性載體復(fù)合物。
14.一種高靈敏度測定法，其使用通過權(quán)利要求I 10任一項(xiàng)所述的方法制作的標(biāo)記化探針-水溶性載體復(fù)合物。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于高再現(xiàn)性地制作標(biāo)記化探針-載體復(fù)合物，其用于對被測物質(zhì)進(jìn)行高靈敏度且穩(wěn)定的檢測和測定。其中，在標(biāo)記物與探針-水溶性載體的結(jié)合中，利用親和素、鏈霉親和素等親和素類與生物素的特異性結(jié)合，且在與載體結(jié)合之前進(jìn)行該親和素類與探針的結(jié)合。即，在使跟被測物質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)與親和素類結(jié)合之后，使該結(jié)合體與高分子水溶性載體結(jié)合來制作親和素化探針-水溶性載體復(fù)合物，通過在該親和素化探針-水溶性載體復(fù)合物中混合生物素化標(biāo)記物，再現(xiàn)性良好地得到可藉由親和素類與生物素的特異性結(jié)合來高靈敏度地檢測和測定出被測物質(zhì)的穩(wěn)定的標(biāo)記化探針-水溶性載體復(fù)合物。
文檔編號G01N33/53GK102893151SQ20118001868
公開日2013年1月23日 申請日期2011年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月14日
發(fā)明者大廣義幸, 高安進(jìn) 申請人:榮研化學(xué)株式會(huì)社, 株式會(huì)社先端生命科學(xué)研究所