專利名稱：在體內(nèi)具有抗腫瘤活性的抗人trop-2 抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有抗腫瘤活性的抗人TR0P-2抗體、特別涉及在體內(nèi)具有抗腫瘤活性的抗人TR0P-2抗體。此外，本發(fā)明涉及產(chǎn)生該抗體的雜交瘤、及該抗體的用途。
背景技術(shù)：
人TROP-2 (Tacstd2，GA733-1，EGP-1)(以下也記作 hTROP-2。)為已知在各種上皮細胞癌腫中過度表達的、由323氨基酸殘基(參照序列號2)構(gòu)成的I次跨膜型的I型細胞膜蛋白。以前即已明確，存在與人滋養(yǎng)層細胞(tiOphoblasts)和癌細胞所表現(xiàn)的免疫抵抗有關(guān)的細胞膜蛋白(非專利文獻1)，已經(jīng)鑒定出一種被抗人絨毛膜癌細胞株BeWo的細胞膜蛋白的小鼠單克隆抗體(162-25.3、162-46.2)識別的抗原分子，為在人滋養(yǎng)層細胞(trophoblasts)中表達的分子之一，被命名為Trop-2 (非專利文獻2)。此后，相同分子被其它研究者發(fā)現(xiàn)，將被免疫胃癌細胞SW948而得的小鼠單克隆抗體GA733識別的稱為腫瘤抗原GA733-1 (非專 利文獻3)、將被非小細胞肺癌的細胞免疫而獲得的小鼠單克隆抗體RS7-3G11識別的稱為上皮糖蛋白(epithelial/carcinoma antigen, EGP-1)(非專利文獻4)，1995年克隆了 Trop-2的基因，確認了它們?yōu)橥环肿?非專利文獻5)。此外，闡明了其在癌細胞中具有放大細胞內(nèi)鈣信號的作用(非專利文獻6)，也被稱為腫瘤相關(guān)鈣信號傳導蛋白(tumor-associated calcium signal transducer) 2, TACSTD2。hTR0P-2基因定位在染色體1ρ32上，與具有約50%同源性的GA733-2 (還作為TACSTD1、上皮糖蛋白EGP-2、EpCAM及Trop-1而已知)一起構(gòu)成TACSTD基因家族(非專利文獻7)。hTR0P-2蛋白(323氨基酸殘基；序列號2)具有約36kD的分子量，包含親水性的信號肽(第I 26位的氨基酸)、細胞外結(jié)構(gòu)域(第27 274位的氨基酸)、細胞跨膜結(jié)構(gòu)域(第275 297位的氨基酸)以及細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(第298 323位的氨基酸)。細胞外結(jié)構(gòu)域中存在4個非均質(zhì)N結(jié)合糖基化位點，添加糖鏈后，表觀分子量增加11 13KD (非專利文獻5)。TACSTD基因家族中，細胞外結(jié)構(gòu)域具有特征性的甲狀腺球蛋白(TY)重復序列，通常認為其與癌細胞的增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移有關(guān)。截至目前，尚未鑒定出hTR0P-2的生理學上的配體，分子功能尚未闡明，但已經(jīng)公開了其在腫瘤細胞中傳遞鈣信號(非專利文獻6)，此外，由于細胞內(nèi)絲氨酸303號殘基通過屬于Ca2+依賴性蛋白激酶的蛋白激酶C而磷酸化(非專利文獻4)以及細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域具有PIP2結(jié)合序列，表明其具有腫瘤細胞中的信號傳遞功能(非專利文獻8)。通過免疫組化(IHC)及流式細胞術(shù)研究等體外診斷研究，已經(jīng)報道了 hTR0P-2在胃癌、肺癌、大腸癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、胰癌、肝癌、食道癌等多種上皮源癌腫中過度表達。與此相對，顯示出正常組織中的表達則僅限于上皮區(qū)域的細胞，表達水平也比癌腫中低，表明TR0P-2與腫瘤形成有關(guān)(專利文獻I 3和9)。此外，在作為臨床檢體的生物學標志的hTR0P-2表達水平解析中，顯示其與大腸癌(非專利文獻10及11)、胰臟癌(非專利文獻12)、口腔癌(非專利文獻13)的惡性度有關(guān)，在hTR0P-2高表達時，癌的轉(zhuǎn)移、復發(fā)頻率顯著高。此外，在使用cDNA微陣列技術(shù)的大規(guī)?；虮磉_分析中，已經(jīng)鑒定出，其為與正常的卵巢上皮相比在卵巢的重度乳頭狀癌中最為高度過度表達的基因組之一(非專利文獻14)。進而，近年通過使用大腸癌細胞的模型證明了 hTR0P-2在腫瘤形成中的重要作用(非專利文獻15)。hTR0P-2的表達促進腫瘤細胞的錨著非依賴性細胞增殖，是移植到免疫缺陷小鼠皮下的癌細胞的腫瘤形成及增殖所必需的，表明其可能是功能性腫瘤抗原，可能成為新的治療祀標。截至目前，已經(jīng)報告了幾種抗hTR0P-2抗體的抗腫瘤效果的研究結(jié)果。就RS7抗體(專利文獻I)而言，使用經(jīng)放射標記的抗體在體內(nèi)模型中進行了試驗，在裸小鼠異種移植模型中顯示出抗腫瘤活性，但沒有報告僅抗體(裸抗體)時的抗腫瘤效果。此外，報告了與細胞毒素結(jié)合的抗hTR0P-2單克隆抗體BRllO (專利文獻2)對于人癌細胞株H3619、H2987、MCF-7、H3396及H2981的體外實驗中的細胞毒性，但體內(nèi)數(shù)據(jù)方面，對于裸抗體或免疫復合BRllO的體內(nèi)數(shù)據(jù)則均未公開。近年還報道了:由通過用人卵巢癌組織免疫小鼠而得的雜交瘤細胞株AR47A6.4.2或AR52A301.5產(chǎn)生的分離單克隆抗體與hTR0P-2結(jié)合，初次以裸抗體形式顯示體外的細胞毒性，并且在裸小鼠異種移植模型中顯示抗腫瘤活性(專利文獻3和4)。但是，這些文獻中，在移植了胰臟癌細胞株BxPC-3及PL45、前列腺癌細胞PC-3、乳腺癌細胞MCF-7以及大腸癌細胞Colo205的小鼠異種移植模型中，雖然僅抗體時顯示出抗腫瘤效果，但是除了在BxPC-3細胞移植中顯示出治療效果以外，均止步于通過抗體的預防性投與而部分地(約40 60%)抑制腫瘤形成及增殖，此外，所需抗體量也為20mg/kg左右，為非常高的用量。由以上的現(xiàn)有技術(shù)，雖然已經(jīng)明確抗hTR0P-2抗體可能作為抗腫瘤抗體，但同時所有的抗hTR0P-2抗體均并非是以裸抗體形式以抗體單獨在體內(nèi)顯示出抗腫瘤效果，表明對hTR0P-2的作用根據(jù)抗體的結(jié)合位點、親和性、單克隆抗體譜而不同。專利文獻1:美國專利第6653104號專利文獻2:美國專利第5840854號專利文獻3:美國專利第7420040號專利文獻4:美國專利第7420041號非專利文獻1:Faulk WP, et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.U S A, 75 (4)，p.1947-1951 (1978)非專利文獻2:Lipinski M, et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.U S A, 78 (8)，p.5147-5150 (1981)非專利文獻3:Linnenbach AJ, et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.U S A, 86 (1)，p.27-31 (1989)非專利文獻4:Basu A, et al., Int.J.Cancer, 62 (4)，p.472-479 (1995)非專利文獻5:Fornaro M, et al., Int.J.Cancer,62 (5), p.610-618 (1995)非專利文獻6:Ripani E，et al., Int.J.Cancer, 76 (5)，p.671-676 (1998)非專利文獻7:Calabrese G，et al.，Cell Genet.,92 (1-2), p.164-165 (2001)非專利文獻8:E1 Sewedy Tet al., Int.J.Cancer, 75 (2)，p.324-330 (1998)非專利文獻9:Cubas R, et al.，Biochim.Biophys.Acta., 1796 (2), p.309-314(2009)非專利文獻10:0hmachi Tet al.，Clin.Cancer Res.，12 (10)，p.3057-3063(2006)非專利文獻11:Fang YJ, et al.，Int.J.Colorectal Dis.,24 (8)，p.875-884(2009)非專利文獻12:Fong D, et al.，Br.J.Cancer,99 (8)，p.1290-1295 (2008)非專利文獻13:Fong D，et al., Mod.Pathol.，21 (2)，p.186-191 (2008)非專利文獻14:Santin AD, et al., Int.J.Cancer, 112 (I), p.14-25 (2004)非專利文獻15:ffang J, et al.，Mol.Cancer Ther.，7 (2)，p.280-285 (2008)

發(fā)明內(nèi)容
在這樣的狀況下，期望開發(fā)在體內(nèi)具有高抗腫瘤活性的抗人hTR0P-2抗體(抗人hTR0P-2單克隆抗體)，特別是以裸抗體形式在僅抗體時即具有在體內(nèi)的抗腫瘤效果且以低用量具有該效果的抗人hTR0P-2抗體等。本發(fā)明是考慮了上述狀況而作出的，提供以下所示的抗人hTR0P-2抗體(抗人hTR0P-2單克隆抗體)、產(chǎn)生該抗體的雜交瘤、該抗體的片段、該抗體等與藥劑的復合物(i mmunoconj ugate)、腫瘤的診斷用或治療用藥物組合物、腫瘤的檢測方法、腫瘤的檢測用或診斷用試劑盒等。(I)在體內(nèi)具有抗腫瘤活性的抗人TR0P-2的抗體。

作為上述(I)的抗體，可以列舉出例如以5 20mg/kg體重的投與量顯示50%以上的腫瘤生長抑制活性的抗體、用于顯示前述腫瘤生長抑制活性的投與次數(shù)至多為每周I次的抗體、以10mg/kg體重的單次投與顯示50%以上的腫瘤生長抑制活性的抗體、對2種以上人腫瘤細胞株具有抗腫瘤活性的抗體、解離常數(shù)(Kd值)為Ι.ΟΧΙΟ,Μ以下的抗體等。這里，作為腫瘤可以列舉出例如選自人胰癌、人前列腺癌、人大腸癌及人乳腺癌組成的組中的至少I種，特別是人胰癌；此外，作為腫瘤，還可以列舉出復發(fā)癌及轉(zhuǎn)移癌。此外，作為腫瘤細胞株，可以列舉出例如選自人胰癌細胞株ΡΚ-59、人胰癌細胞株BxPC-3、人胰癌細胞株KP-3L、人胰癌細胞株KP-2、人胰癌細胞株P(guān)K-1、人胰癌細胞株P(guān)K-45H、人胰癌細胞株P(guān)K-45P、人胰癌細胞株TCC-PAN2、人胰癌細胞株SUIT-2、人大腸癌細胞株CAC0-2、人大腸癌細胞株SW480、人大腸癌細胞株DLD-1、人大腸癌細胞株HCTl 16、人乳腺癌細胞株JIMT-1、人乳腺癌細胞株HCC1143、人乳腺癌細胞株MCF-7、人前列腺癌細胞株DU145及人前列腺癌細胞株P(guān)C-3組成的組中的至少2種，特別是人胰癌細胞株P(guān)K-59及人胰癌細胞株BxPC-3。作為上述(I)的抗體，可以列舉出例如:抗體的H鏈V區(qū)域的⑶Rl 3的氨基酸序列分別依次為序列號36 38所示的氨基酸序列、和/或抗體的L鏈V區(qū)域的CDRl 3的氨基酸序列分別依次為序列號41 43所示的氨基酸序列的抗體；抗體的H鏈V區(qū)域的⑶Rl 3的氨基酸序列分別依次為序列號46 48所示的氨基酸序列、和/或抗體的L鏈V區(qū)域的CDRl 3的氨基酸序列分別依次為序列號51 53所示的氨基酸序列的抗體；抗體的H鏈V區(qū)域的⑶Rl 3的氨基酸序列分別依次為序列號56 58所示的氨基酸序列、和/或抗體的L鏈V區(qū)域的CDRl 3的氨基酸序列分別依次為序列號61 63所示的氨基酸序列的抗體；及抗體的H鏈V區(qū)域的⑶Rl 3的氨基酸序列分別依次為序列號66 68所示的氨基酸序列、和/或抗體的L鏈V區(qū)域的CDRl 3的氨基酸序列分別依次為序列號71 73所示的氨基酸序列的抗體等。作為上述(I)的抗體，可以列舉出例如單克隆抗體。作為上述(I)的抗體，可以列舉出例如基因重組抗體，具體而言，可以列舉出嵌合抗體、人源化抗體或人抗體(human antibody)。這里，作為上述嵌合抗體，可以列舉出:例如H鏈V區(qū)域的氨基酸序列包含序列號35所示的氨基酸序列、和/或L鏈V區(qū)域的氨基酸序列包含序列號40所示的氨基酸序列的抗體；H鏈V區(qū)域的氨基酸序列包含序列號45所示的氨基酸序列、和/或L鏈V區(qū)域的氨基酸序列包含序列號50所示的氨基酸序列的抗體；H鏈V區(qū)域的氨基酸序列包含序列號55所示的氨基酸序列、和/或L鏈V區(qū)域的氨基酸序列包含序列號60所示的氨基酸序列的抗體；及H鏈V區(qū)域的氨基酸序列包含序列號65所示的氨基酸序列、和/或L鏈V區(qū)域的氨基酸序列包含序列號70所示的氨基酸序列的抗體等。(2)由保藏號為 FERM BP-11251,FERM BP-11252,FERM BP-11253,FERM BP-11346或FERM BP-11254的雜交瘤產(chǎn)生的、抗人TR0P-2的單克隆抗體。作為上述(I )和(2)的抗體，可以列舉出例如:與由保藏號為FERM BP-1125UFERMBP-11252.FERM BP_11253、FERM BP-11346 或FERM BP-11254 的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體所結(jié)合的位點結(jié)合的抗體，及與包含選自下列區(qū)域組成的組中的至少I種(例如任意I種)區(qū)域的部分結(jié)合的抗體，所述區(qū)域為:包含序列號2所示的人TR0P-2的氨基酸序列中的第43位 第65位的氨基酸的區(qū)域、包含序列號2所示的人TR0P-2的氨基酸序列中的第152位 第165位的氨基酸的區(qū)域、包含序列號2所示的人TR0P-2的氨基酸序列中的第171位 第183位的氨基酸的區(qū)域、包含序列號2所示的人TR0P-2的氨基酸序列中的第109位 第120位的氨基酸的區(qū)域、包含序列號2所示的人TR0P-2的氨基酸序列中的第43位 第56位的氨基酸的區(qū)域、及包含序列號2所示的人TR0P-2的氨基酸序列中的第193位 第206位的氨基酸的區(qū)域。(3)來源于上述(I)或(2)的抗體的抗體片段。作為上述(3)的抗體片段，可以列舉出例如:包含序列號36 38所示的氨基酸序列、和/或序列號41 43所示的氨基酸序列的片段，例如包含序列號35所示的氨基酸序列、和/或序列號40所示的氨基酸序列的片段；包含序列號46 48所示的氨基酸序列、和/或序列號51 53所示的氨基酸序列的片段，例如包含序列號45所示的氨基酸序列、和/或序列號50所示的氨基酸序列的片段；包含序列號56 58所示的氨基酸序列、和/或序列號61 63所示的氨基酸序列的片段，例如包含序列號55所示的氨基酸序列、和/或序列號60所示的氨基酸序列的片段；及包含序列號66 68所示的氨基酸序列、和/或序列號71 73所示的氨基酸序列的片段，例如包含序列號65所示的氨基酸序列、和/或序列號70所示的氨基酸序列的片段等。(4)產(chǎn)生上述(I)或(2)的抗體的雜交瘤。(5)保藏號為 FERM BP-1125UFERM BP_11252、FERM BP-11253,FERM BP-11346 或FERM BP-11254的產(chǎn)生抗人TR0P-2的單克隆抗體的雜交瘤。(6 ) 一種抗體一藥劑復合 物，其包含上述(I)或(2 )的抗體以及具有抗腫瘤活性和/或細胞殺傷活性的物質(zhì)。(7)—種抗體片段一藥劑復合物，其包含上述(3)的抗體片段以及具有抗腫瘤活性和/或細胞殺傷活性的物質(zhì)。在上述(6)和(7)的復合物中，作為腫瘤，可以列舉出例如選自人胰癌、人前列腺癌、人大腸癌及人乳腺癌組成的組中的至少I種，特別是人胰癌，此外，作為腫瘤，還可以列舉出復發(fā)癌及轉(zhuǎn)移癌。(8 ) 一種藥物組合物，其含有選自上述(I)和(2 )的抗體、上述(3 )的抗體片段、以及上述(6)和(7)的復合物組成的組中的至少I種。作為上述(8)的組合物，可以列舉出例如用于腫瘤的治療的組合物，特別是沒有體重減少的副作用的組合物，此外，還可以列舉出用于腫瘤的診斷的組合物。這里，作為腫瘤，可以列舉出例如選自人胰癌、人前列腺癌、人大腸癌及人乳腺癌組成的組中的至少I種，特別是人胰癌，此外，作為腫瘤，還可以列舉出復發(fā)癌及轉(zhuǎn)移癌。(9 ) 一種腫瘤治療劑，其包含選自上述(I)和(2 )的抗體、上述(3 )的抗體片段、以及上述(6)和(7)的復合物組成的組中的至少I種。作為上述(9)的治療劑,可以列舉出例如沒有體重減少的副作用的治療劑。(10) —種腫瘤診斷劑，其包含選自上述(I)和(2)的抗體、上述(3)的抗體片段、以及上述(6)和(7)的復合物組成的組中的至少I種。在上述(9)的治療劑及上述(10)的診斷劑中，作為腫瘤，可以列舉出例如選自人胰癌、人前列腺癌、人大腸癌及人乳腺癌組成的組中的至少I種，特別是人胰癌，此外，作為腫瘤，還可以列舉出復發(fā)癌及轉(zhuǎn)移癌。(11) 一種腫瘤檢測方法，其特征在于，使選自上述(I)和(2 )的抗體、上述(3 )的抗體片段、以及上述(6)和(7)的復合物組成的組中的至少I種與由生物體采集的試樣反應(yīng)，并檢測發(fā)生反應(yīng)的抗體和/或抗體片段的信號。在上述(11)的方法中，作為腫瘤，可以列舉出例如選自人胰癌、人前列腺癌、人大腸癌及人乳腺癌組成的組中的至少I種，特別是人胰癌，此外，作為腫瘤，還可以列舉出復發(fā)癌及轉(zhuǎn)移癌。(12) —種腫瘤的治療用、診斷用或檢測用試劑盒，其包含選自上述(I)和(2)的抗體、上述(3)的抗體片段、以及上述(6)和(7)的復合物組成的組中的至少I種。在上述(12)的試劑盒中，作為腫瘤，可以列舉出例如選自人胰癌、人前列腺癌、人大腸癌及人乳腺癌組成的組中的至少I種，特別是人胰癌，此外，作為腫瘤，還可以列舉出復發(fā)癌及轉(zhuǎn)移癌。


圖1為表示抗hTR0P-2單克隆抗體(K5-70)的抗原親和性(Kd:解離常數(shù))測定的圖。Abt:抗體(總計)，Agf:抗原(游離)圖2為表示產(chǎn)生抗hTR0P-2單克隆抗體的雜交瘤培養(yǎng)上清的、與HuH_7細胞(TR0P-2陰性)和HuH-7-hTR0P-2細胞的反應(yīng)性的圖。涂成黑色的柱狀圖表示HuH_7細胞，黑色線的柱狀圖表示HuH-7-hTR0P-2細胞。圖3是表示抗hTR0P-2單克隆抗體的、與在細胞表面表達內(nèi)源性hTR0P_2的人胰臟癌細胞株(PK-59細胞)的反應(yīng)性的圖。涂成黑色的柱狀圖表示僅二抗(PE標記抗小鼠IgG),黑色線的柱狀圖表示與各抗hTR0P-2單克隆抗體反應(yīng)。圖4是表示抗hTR0P-2單克隆抗體的、在細胞表面表達內(nèi)源性hTR0P-2的人胰臟癌細胞株(BxPC-3細胞)的反應(yīng)性的圖。涂成黑色的柱狀圖表示僅二抗(PE標記抗小鼠IgG)、黑色線的柱狀圖表示與各抗hTR0P-2單克隆抗體反應(yīng)。圖5是表示抗hTR0P-2單克隆抗體(K5-70)與人胰臟癌細胞株的反應(yīng)性的圖。涂成黑色的柱狀圖表示僅二抗(PE標記抗小鼠IgG)、黑色線的柱狀圖表示與抗hTR0P-2單克隆抗體反應(yīng)。圖6是表示抗hTR0P-2單克隆抗體(K5-70)與人大腸癌細胞株(Colo320，CAC02，SW480, DLDI, Cff2, HCT116)，人乳腺癌(JMT-1，HCCl 143)，人前列腺癌細胞株(PC-3，DU145)的反應(yīng)性的圖。涂成黑色的柱表示僅二抗(PE標記抗小鼠IgG)，黑色線的柱狀圖表示與抗hTR0P-2單克隆抗體反應(yīng)。圖7是調(diào)查抗hTR0P-2單克隆抗體與小鼠TR0P-2的交叉反應(yīng)性的圖。細胞使用的是在CHO-Kl細胞中瞬時表達小鼠TR0P-2基因的細胞，作為陽性對照抗體，使用的是與小鼠TR0P-2顯示交叉性的T2-102抗體(小鼠IgGl )。涂成黑色的柱表示僅二抗(PE標記抗小鼠IgG)，黑色線的柱狀圖表示與各抗hTR0P-2單克隆抗體反應(yīng)。圖8是調(diào)查抗hTR0P-2單克隆抗體與人EpCAM/TR0P_l的交叉反應(yīng)性的圖。細胞使用的是在CHO-Kl細胞中瞬時表達人EpCAM/TROP-Ι基因的細胞，作為陽性對照抗體，使用的是PE標記抗人EpCAM單克隆抗體(Becton, Dickinson and Company)。涂成黑色的柱表示僅二抗(PE標記抗小鼠IgG),黑色線的柱狀圖表示與各抗hTR0P-2單克隆抗體反應(yīng)。圖9是表示抗hTR0P-2抗體(T6-16，T5-86，K5-70，K5-107)的人胰臟癌細胞株(PK-59細胞)的細胞增殖抑制活性的圖。mlgG表示對照抗體(小鼠IgG)，YYOl:市售的抗hTROP-2 抗體(Santacruz。白色柱:0 μ g/mL,灰色柱:0.I μ g/mL,黑色柱:lyg/mL。以相對于不添加抗體(O μ g/mL)的值的比例來表示。誤差棒表示標準偏差。*P〈0.05,**P〈0.01(利用學生t檢驗)圖10為表示抗hTROP-2抗體(T6-16，K5-70)的人胰臟癌細胞株(PK-59細胞)的劃痕檢測的圖。A.表示PK-59細胞的劃痕區(qū)域的照片的代表例。O天:表示剛劃痕后的代表例。mlgG (I天):劃痕后在培養(yǎng)基中添加對照抗體(小鼠IgG、ly g/mL)的I天后(24小時后)的照片。K5-70 (I天):表示劃痕后在培養(yǎng)基中添加K5-70抗體(I μ g/mL)的I天后(24小時后)的照片。T6-16 (I天):表示劃痕后在培養(yǎng)基中添加T6-16抗體(I μ g/mL)的I天后(24小時后)的照片。照片中所示箭頭表示劃痕區(qū)域的寬度。B.通過圖像解析軟件 (Scion Image)解析劃痕區(qū)域的面積，以該值為基礎(chǔ)并將對照mlgG添加組O天設(shè)為基準值I而算出其它樣品各種值。*Ρ〈0.05，#P〈0.01 (利用學生 t 檢驗)圖11為人胰臟癌細胞株P(guān)K-59細胞的干細胞標志的FACS的圖。A:為表示PK-59細胞的EpCAM表達的FACS的圖。涂成黑色的柱表示僅二抗(PE標記抗小鼠IgG)，黑色線表不與抗人EpCAM抗體(Becton, Dickinson and Company)反應(yīng)時的柱狀圖。13、0:表不？1(-59細胞的P-glycoprotein/MCRl (B)或ABCG2 (C)的表達的FACS的圖。藍色的柱狀圖表示僅二抗，紅色的柱狀圖表示與抗人P-糖蛋白/MDRl抗體(BD BIOSCIENCES PHARMINGEN)(B)、抗人ABCG2抗體(BD BIOSCIENCES PHARMINGEN) (C)反應(yīng)的情況。D:為使用作為胰臟癌干細胞標志的FITC標記抗人⑶24抗體(BD Pharmingen)和PE標記抗人⑶44抗體(BDPharmingen)對PK-59細胞進行二重染色的FACS圖。D圖中的數(shù)字表示各組分的細胞的存在比率。圖12為在使用PK-59細胞的異種移植治療模型中對新的抗hTR0P-2單克隆抗體克隆K5-70 (小鼠IgG2a)的抗腫瘤活性進行評價的圖。A:表示對照組(小鼠IgG)和K5-70投與組的腫瘤經(jīng)時生長(平均值土標準偏差)。箭頭表示抗體投與期間。*P〈0.05，**P〈0.01 (利用學生t檢驗)B:是在A的試驗中對第21天(21天)(實驗最后一天)時各小鼠的腫瘤重量作圖而得的圖。各曲線上所示的數(shù)值為平均值土標準偏差。**P〈0.01 (利用學生t檢驗)圖13是在使用了 PK-59細胞的異種移植治療模型中對A.克隆K5-107，B.克隆T6-16，C.克隆K5-116-2-1的抗腫瘤活性進行評價的圖。 表示對照組(小鼠IgG)，〇表示抗hTR0P-2抗體投與組。圖中的箭頭表示抗體投與期間，各曲線上所示的數(shù)值為平均值土標準偏差。*Ρ〈0.05 (利用學生t檢驗)圖14為在使用PK- 59細胞的異種移植預防模型中對A.克隆K5_70、B.克隆T6-16及C.克隆K5-116-2-1的抗腫瘤活性進行評價的圖。 表示對照組(小鼠IgG)，〇表示抗hTR0P-2抗體投與組。圖中的箭頭表示抗體投與期間，各曲線上所示的數(shù)值為平均值土標準偏差。**Ρ〈0.01 (利用學生t檢驗)圖15為在使用BxPC-3細胞的異種移植預防及治療模型中對克隆K5-70的抗腫瘤活性進行評價的圖。A:表示在預防模型中對照組(小鼠IgG)和K5-70投與組的腫瘤經(jīng)時生長(平均值土標準偏差)。箭頭表示抗體投與期間。**P〈0.01 (利用學生t檢驗)B:表示在治療模型中對照組(小鼠IgG)和K5-70投與組的腫瘤經(jīng)時生長(平均值土標準偏差)。箭頭表示抗體投與期間。*P〈0.05 (利用學生t檢驗)圖16為表示在使用PK-59細胞的異種移植預防模型中克隆K5-70的用量依賴性的抗腫瘤活性的圖。腫瘤體積以平均值土標準偏差來表示。A:表示對照組(小鼠IgG)和各用量時的K5-70投與組的腫瘤經(jīng)時生長(平均值土標準偏差)。箭頭表示抗體投與期間。*P〈0.05 (利用學生t檢驗)，**P〈0.01 (利用學生t檢驗)B:為在A的試驗中對第17天(17天)(實驗最后一天)時各小鼠的腫瘤重量作圖而得的圖。各曲線上所示的數(shù)值為平均值土標準偏差。**P〈0.01 (利用學生t檢驗)圖17為實驗中使用的人/小鼠嵌合TR0P-2蛋白的示意圖。SP:信號序列，TY結(jié)構(gòu)域:1型甲狀腺球蛋白區(qū)域(thyroglobulin type I region),TM:跨膜區(qū)域,C:細胞內(nèi)區(qū)域。涂滿黑色的的區(qū)域為來自于hTROP-2的多肽。以白色空心表示的區(qū)域為來自于小鼠TR0P-2的多肽。嵌合蛋白的示意圖的上段所示的數(shù)字表示小鼠TR0P-2蛋白的氨基酸號，下段表不hTROP-2蛋白的氨基酸號。圖18為使用人/小鼠嵌合TR0P-2的抗hTROP-2單克隆抗體結(jié)合區(qū)域的鑒定結(jié)果圖。使用恒定表達人/小鼠嵌合TR0P2-C(hmTR0P2-C)及小鼠/人嵌合TR0P2-D(mhTR0P2_D)蛋白的HEK293細胞，研究與圖中所示的抗hTROP-2單克隆抗體的反應(yīng)性。陰性對照使用的是小鼠IgG2b。圖19是表示抗hTROP-2單克隆抗體的抗體結(jié)合區(qū)域的鑒定結(jié)果的圖。 使用將hTROP-2基因及各人/小鼠嵌合TR0P-2基因?qū)際EK293細胞并使其瞬時表達的細胞進行FACS解析。對于(A)K5-70、K5-107、T5-86、K5-116-2-1抗體，研究與hTROP-2 (上段)、hmTR0P-2-A (中段)及hmTROP-2-B (下段)的反應(yīng)性。使用小鼠IgG2b作為陰性對照。對于(B) T6-4、T6-16抗體，研究與hTROP-2 (上段)、mhTROP-2-E (中段)及mhTROP-2-F (下段)的反應(yīng)性。使用小鼠IgG2b作為陰性對照。圖20是表示人正常組織中的hTROP-2的表達的圖。使用抗hTROP-2單克隆抗體克隆K5-63-17進行人正常組織陣列的免疫染色。(A)皮膚、(B)食道、(C)腎臟(皮質(zhì))、(D)腎臟(髓質(zhì))、(E)胰臟、(F)前列腺、(G)膀胱、(H)扁桃腺、(I)心臟、(J)肝臟(倍率:X200)圖21是表示癌組織中的hTROP-2的表達的圖。使用抗hTROP-2單克隆抗體克隆K5-63-17進行人癌組織陣列的免疫染色。(A)乳腺癌、(B)肺癌、(C)食道癌、(D)胃癌、(E)胰臟癌、(F)大腸癌、(G)膀胱癌、(H)前列腺癌、(I)卵巢癌(倍率:X 100)圖22為表示在使用PK-59細胞的異種移植預防模型中單次投與克隆K5-70的抗腫瘤活性的圖。A.表示對照組(小鼠IgG.)和K5-70投與組(〇)的腫瘤經(jīng)時形成(平均值土標準偏差)。箭頭表不投與抗體。*P〈0.05 (利用學生t檢驗)，**P〈0.01 (利用學生t檢驗)。B.為在A的試驗中對第28天(28天)(實驗最后一天)時的各小鼠的腫瘤重量作圖而得的圖。#P〈0.01 (利用學生t檢驗)。C.表示對照組(小鼠IgG.)和K5-70投與組(〇)的各個體的腫瘤經(jīng)時形成。箭頭表示投與抗體。圖23為表示克隆K5-70在使用人大腸癌細胞SW480細胞的異種移植治療模型中的抗腫瘤活性的圖。A:表示對照組(.小鼠IgG)和K5-70投與組(〇)的腫瘤經(jīng)時形成(平均值土標準偏差)。箭頭表示抗體投與期間。**P〈0.01 (利用學生t檢驗)B:為在A的試驗中對第44天(44天)(實驗最后一天)時的各小鼠中的腫瘤重量作圖而得的圖。#Ρ〈0.01 (利用學生t檢驗)圖24是表示克隆K5-116-2-1在使用SW480細胞的異種移植治療模型中的抗腫瘤活性的圖。A:表示對照組(.小鼠IgG)和T6-16投與組(〇)的腫瘤經(jīng)時形成(平均值土標準偏差)。箭頭表示抗體投與期間。**P〈0.01 (利用學生t檢驗)B:為在A的試驗中對第42天(42天)(實驗最后一天)時的各小鼠中的腫瘤重量作圖而得的圖。#Ρ〈0.01 (利用學生t檢驗)
圖25為表示克隆T6-16在使用SW480細胞的異種移植治療模型中的抗腫瘤活性的圖。A:表示對照組(.小鼠IgG)和T6-16投與組(〇)的腫瘤經(jīng)時形成(平均值土標準偏差)。箭頭表示抗體投與期間。*P〈0.05 (利用學生t檢驗)B:為在A的試驗中對第42天(42天)(實驗最后一天)時的各小鼠中的腫瘤重量作圖而得的圖。*Ρ〈0.05 (利用學生t檢驗)圖26為表示克隆K5-70在使用SW480細胞的異種移植治療模型中的用量依賴性的抗腫瘤活性的圖。A:表不對照組(.小鼠 IgG)和 K5-70 投與組(〇:lmg/kg, Δ:5mg/kg, □:10mg/kg)的腫瘤經(jīng)時形成(平均值土標準偏差)。箭頭表示抗體投與期間。*P〈0.05 (利用學生t檢驗)B:為在A的試驗中對第42天(42天)(實驗最后一天)時的各小鼠的腫瘤重量作圖而得的圖。*Ρ〈0.05 (利用學生t檢驗)圖27為表示克隆K5-70在使用SW480細胞的異種移植治療模型中的抗腫瘤活性的圖。A:為表示每周I次的投與間隔時的K5-70抗體的抗腫瘤活性的圖。表示對照組(.小鼠IgG)和K5-70投與組(〇:10mg/kg)的腫瘤經(jīng)時形成(平均值土標準偏差)。箭頭(10，17，24，31，38天)表示K5-70抗體的投與。*Ρ〈0.05利用學生t檢驗。B:為表示以每10天I次(■:ql0d)、或每2周I次(籲:ql4d)的投與間隔投與K5-70抗體時的腫瘤經(jīng)時形成的圖。菱形( )表示對照組(小鼠IgG、10mg/kg)(平均值土標準偏差)。涂成黑色 的箭頭29天)和空心的箭頭(V;9，23，37天)表示投與K5-70抗體。*Ρ〈0.05，**P〈0.01利用學生t檢驗。圖28為表示克隆T6-16在使用SW480細胞的異種移植治療模型中的用量依賴性的抗腫瘤活性的圖。A:表不對照組(.小鼠 IgG)和 T6-16 投與組(〇:lmg/kg, Δ:5mg/kg, □:10mg/kg)的腫瘤經(jīng)時形成(平均值土標準偏差)。箭頭表示抗體投與期間。**P〈0.01 (利用學生t檢驗)B:為在A的試驗中對第43天(43天)(實驗最后一天)時的各小鼠中的腫瘤重量作圖而得的圖。#Ρ〈0.01 (利用學生t檢驗)圖29為表示克隆T6-16在使用SW480細胞的異種移植治療模型中的抗腫瘤活性的圖。表不對照組(.:小鼠 IgG10mg/kg)、T6_16 (10mg/kg)投與組(O:q7d, Δ:ql0d)的腫瘤經(jīng)時形成(平均值土標準偏差)。箭頭(10，17，24，31，38天)、及箭頭(10，20，30，40天)表示投與T6-16抗體。對照組每3天進行I次投與。*P〈0.05，**P〈0.01利用學生t檢驗。圖30為表示克隆K5-70在使用人前列腺癌細胞DU-145細胞的異種移植預防模型中的抗腫瘤活性的圖。A:表示對照組(.小鼠IgG)和K5-70投與組(〇)的腫瘤經(jīng)時形成(平均值土標準偏差)。箭頭表示抗體投與期間。*P〈0.05 (利用學生t檢驗)B:為在A的試驗中對第40天(40天)(實驗最后一天)時的各小鼠的腫瘤重量作圖而得的圖。*Ρ〈0.05 (利用學生t檢驗)
圖31為表示克隆K5-70在使用PK-59細胞的肝轉(zhuǎn)移模型的轉(zhuǎn)移抑制活性的圖。A:表示細胞移植6周后對照組(小鼠IgG)摘出的肝臟圖，B:表示細胞移植6周后K5-70投與組摘出的肝臟圖。箭頭表示肝轉(zhuǎn)移灶。圖32為表示K5-70在使用SW480細胞的異種移植模型中、在鹽酸伊立替康投與后癌復發(fā)模型中的抗腫瘤活性的圖。為表示無處置組( )、和鹽酸伊立替康(40mg/kg)投與后K5-70 (O:10mg/kg)、小鼠IgG投與組(.:10mg/kg)的腫瘤經(jīng)時形成的圖(平均值土標準偏差)。箭頭(11，14，17天)表示投與鹽酸伊立替康。K5-70抗體或小鼠IgG從20天開始每3天進行I次投與。箭頭表示抗體投與期間。*P〈0.05，**P〈0.01利用學生t檢驗。圖33為表示克隆K5-70H鏈可變區(qū)域(VH)的cDNA堿基序列(序列號34)和推定氨基酸序列(序列號35)的圖。信號肽用斜體表示。畫有雙下劃線的谷氨酰胺(Q)表示成熟肽的N末端氨基酸殘基。CDR序列(下劃線；IYWIN，NIYPSDSYTNYNQKFKD，TSMADY)按照Kabat等(Sequences of Proteins of Immunological Interests,Fifth edition,NIH PublicationN0.91-3242, U.S.Department of Health and Human Services, 1991)的定義來確定?？寺5-70VH的⑶Rl 3的氨基酸序列依次如序列號36 38所示。圖34為表示克隆K5-70L鏈可變區(qū)域(VL)的cDNA堿基序列(序列號39)和推定氨基酸序列(序列號40)的圖。信號肽用斜體表示。畫有雙下劃線的天冬氨酸(D)表示成熟肽的N末端氨基酸殘基。CDR序列(下劃線；RASQSIGTSIH，YASESIS, QQSNSWPFT)按照Kabat等(Sequences of Proteins of Immunological Interests,Fifth edition,NIH PublicationN0.91-3242, U.S.Department of Health and Human Services, 1991)的定義來確定?？寺5-70VL的⑶Rl 3的氨基酸序列分別如序列號41 43所示。圖35為表示克隆K5-107H鏈可變區(qū)域(VH)的cDNA堿基序列(序列號44)和推定氨基酸序列(序列號45)的圖。信號肽用斜體表示。畫有雙下劃線的谷氨酰胺(Q)表示成熟肽的N末端氨基酸殘基。CDR序列(下劃線；SYWMH，NIYPGGGYTNYDEKFKS, SSVFDY)按照 Kabat 等(Sequences of Proteins of Immunological Interests,Fifth edition,NIHPublication N0.91-3242, U.S.Department of Health and Human Services, 1991)的定義來確定。克隆K5-107VH的⑶Rl 3的氨基酸序列分別如序列號46 48所示。圖36為表示克隆K5-107L鏈可變區(qū)域(VL)的cDNA堿基序列(序列號49)和推定氨基酸序列(序列號50)的圖。信號肽用斜體表示。畫有雙下劃線的天冬氨酸(D)表示成熟肽的N末端氨基酸殘基。CDR序列(下劃線；RASQNIGTSIH，YASESIS，QQSNSWPFT)按照Kabat等(Sequences of Proteins of Immunological Interests,Fifth edition,NIH PublicationN0.91-3242, U.S.Department of Health and Human Services, 1991)的定義來確定?？寺5-107VL的⑶Rl 3的氨基酸序列分別如序列號510 53所不。圖37為表示克隆K5-116-2-1H鏈可變區(qū)域(VH)的cDNA堿基序列(序列號54)和推定氨基酸序列(序列號55)的圖。信號肽用斜體表示。畫有雙下劃線的谷氨酰胺(Q)表示成熟肽的N末端氨基酸殘基。⑶R序列(下劃線；SYWIT，NIYPSDSYTNYNQKFRD, LFDY)按照 Kabat 等(Sequences of Proteins of Immunological Interests,Fifth edition,NIHPublication N0.91-3242, U.S.Department of Health and Human Services, 1991)的定義來確定?？寺5-116-2-1VH的⑶Rl 3的氨基酸序列分別如序列號56 58所不。
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圖38為表示克隆K5-116-2-1L鏈可變區(qū)域(VL)的cDNA堿基序列(序列號59)和推定氨基酸序列(序列號60)的圖。信號肽用斜體表示。畫有雙下劃線的天冬氨酸(D)表示成熟肽的N末端氨基酸殘基。CDR序列(下劃線；RASQSIGTSIH，YASESIS，QQSNSWPFT)按照 Kabat 等(Sequences of Proteins of Immunological Interests,Fifth edition,NIHPublication N0.91-3242, U.S.Department of Health and Human Services, 1991)的定義來確定?？寺5-116-2-1VL的⑶Rl 3的氨基酸序列分別如序列號61 63所不。圖39為表示克隆T6-16H鏈可變區(qū)域(VH)的cDNA堿基序列(序列號64)和推定氨基酸序列(序列號65)的圖。信號肽用斜體表不。畫有雙下劃線的谷氨酰胺酸(E)表不成熟肽的N末端氨基酸殘基。CDR序列(下劃線；DYNMH，HYPYNGGTGYNQRFKS，EDYGSSPSYAMDY)按照 Kabat 等(Sequences of Proteins of Immunological Interests,Fifth edition,NIHPublication N0.91-3242, U.S.Department of Health and Human Services, 1991)的定義來確定?？寺6-16VH的⑶Rl 3的氨基酸序列分別如序列號66 68所不。圖40為表示克隆T6-16L鏈可變區(qū)域(VL)的cDNA堿基序列(序列號69)和推定氨基酸序列(序列號70)的圖。信號肽用斜體表示。畫有雙下劃線的天冬氨酸(D)表示成熟肽的N末端氨基酸殘基。CDR序列(下劃線；RSSQSLVHGNGNTYLH，KVSNRFS, SQTTHVPT)按照 Kabat 等(Sequences of Proteins of Immunological Interests,Fifth edition,NIHPublication N0.91-3242, U.S.Department of Health and Human Services, 1991)的定義來確定?？寺6-16VL的⑶Rl 3的氨基酸序列分別如序列號71 73所示。
具體實施方式
以下詳細說明本發(fā)明。本發(fā)明的范圍不受這些說明限制，除了以下例示以外，也可以在不損害本發(fā)明主旨的范圍內(nèi)適當變更實施。予以說明，本說明書包括作為本申請優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的日本特愿2010-113302號說明書(2010年5月17日提出申請)的全體。此外，本說明書所引用的全部的出版物如現(xiàn)有技術(shù)文獻及公開公報、專利公報以及其他專利文獻均作為參照而引入本說明書中。1.本發(fā)明的概要如前所述，人TROP-2 (hTR0P-2)是由全長323氨基酸殘基構(gòu)成的I次跨膜型的I型膜蛋白。并且已知hTR0P-2基因及其基因產(chǎn)物在各種癌細胞中表達。如前所述，希望開發(fā)出在體內(nèi)具有高抗腫瘤活性的抗人hTR0P-2抗體(抗人hTR0P-2單克隆抗體)等的狀況下，本發(fā)明人從極其眾多的克隆中進行篩選，從而成功地獲得了在體內(nèi)具有高抗腫瘤活性的克隆。具體而言，本發(fā)明提供在體內(nèi)特異性識別hTR0P-2的細胞外區(qū)域的單克隆抗體，特別是提供顯示皮摩爾級別(PM)的高親和性的單克隆抗體。與現(xiàn)有的抗hTR0P-2抗體相比，本發(fā)明的抗體為:以僅裸抗體投與時，在更少的用量(例如1/20投與量)下具有顯著的腫瘤生長抑制活性，且在使用多種人癌細胞的荷瘤小鼠治療模型中顯示顯著的腫瘤生長抑制活性的抗hTR0P-2單克隆抗體，從這方面來看是極其有用的。2.抗hTR0P-2抗體的制作(I)抗原的制備hTR0P-2的氨基酸序列(序列號2)信息在例如NCBI (GenBank)網(wǎng)站(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)中以“登錄號:NP_002344”公布。予以說明，編碼hTROP-2的氨基酸序列的堿基序列(序列號I)的信息在該網(wǎng)站中以“登錄號:NM002353”公布。作為抗原，可以使用包含hTROP-2的氨基酸序列的至少一部分(全部或一部分)的多肽或肽(也簡稱為肽)，可以優(yōu)選使用包含hTROP-2的細胞外區(qū)域的氨基酸序列的至少一部分(全部或一部分)的肽。hTROP-2的細胞外區(qū)域(包括信號肽)是指包含序列號2所示的氨基酸序列中的第I位 第274位的氨基酸的區(qū)域(信號肽:第I位 第26位的氨基酸)。這里，對用作抗原的肽而言，上述“氨基酸序列的至少一部分”的長度沒有特別限定，優(yōu)選例如包含序列號2所示的氨基酸序列中的第I位 第145位的氨基酸的區(qū)域、包含該氨基酸序列中的第146位 第274位的氨基酸的區(qū)域等。作為抗原的肽的制作方法可以是化學合成，也可以通過采用大腸桿菌等的基因工程法合成，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法。進行肽的化學合成時，可以通過肽合成的公知方法進行合成。此外，其合成也可以使用固相合成法和液相合成法中的任意一種。還可以使用市售的肽合成裝置(例如，島津制作所制:PSSM-8等)。在用基因工程學方式合成肽時，首先設(shè)計并合成編碼該肽的DNA。該設(shè)計和合成例如可以使用以包含全長hTROP-2基因的載體等作為模板，使用設(shè)計為可以合成所希望的DNA區(qū)域的引物，通過PCR法進行。然后，通過將上述DNA連接到適當?shù)妮d體上而獲得蛋白質(zhì)表達用重組載體，將該重組載體導入宿主中并使得目的基因可以表達，由此獲得轉(zhuǎn)化子(Sambrook J.et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual,3rd edition, ColdSpring Harbor Laboratory Press,2001)。使用可以在宿主微生物中自我增殖的噬菌體或質(zhì)粒作為載體。而且還可以使用動物病毒、昆蟲病毒載體。重組載體的制作可如下進行，即用適當?shù)南拗菩悦盖袛嗉兓腄NA，插入適當?shù)妮d體DNA的限制性酶位點等中而與載體連接。作為轉(zhuǎn)化時使用的宿主，只要是可以表達目的基因的宿主即可，沒有特別的限定。例如，可以列舉細菌(大腸桿菌、枯草桿菌等)、酵母、動物細胞(C0S細胞、CHO細胞等)、昆蟲細胞或昆蟲。還可以使用山羊等哺乳動物作為宿主。向宿主導入重組載體的方法是公知的。然后，培養(yǎng)前述轉(zhuǎn)化子，從其培養(yǎng)物中收集作為抗原使用的肽。“培養(yǎng)物”是指(a)培養(yǎng)上清、(b)培養(yǎng)細胞或者培養(yǎng)菌體或其破碎物中的任意一種。培養(yǎng)后，目的肽在菌體內(nèi)或細胞內(nèi)產(chǎn)生時，通過破碎菌體或細胞來提取肽。而且，目的肽在菌體外或細胞外產(chǎn)生時，直接使用培養(yǎng)液或通過離心分離等除去菌體或細胞。然后，可以通過單獨使用可以在肽的分離純化中使用的一般的生物化學方法，例如硫酸銨沉淀、凝膠過濾、離子交換層析、親和層析等或?qū)⑦@些方法組合使用，來分離純化目的肽。本發(fā)明中，還可以使用無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，通過體外翻譯獲得作為抗原的肽。此時，可以使用以RNA作為模板的方法和以DNA作為模板的方法(轉(zhuǎn)錄/翻譯)這2種方法。作為無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，可以使用市售的系統(tǒng)，例如Expressway 系統(tǒng)(Invitrogen公司)、PURESYSTEM (注冊商標；post genome研究所)、TNT系統(tǒng)(注冊商標；Promega公司)等。如上所述獲得的肽還可以結(jié)合到適當?shù)妮d體蛋白質(zhì)，例如牛血清白蛋白(BSA)^.孔血藍蛋白(Keyhole limpet hemocyanin, KLH)、人甲狀腺球蛋白、雞Y-球蛋白等。另外，抗 原可以是在hTR0P-2的氨基酸序列(序列號2)或前述的其部分序列中缺失、置換或添加了 I個或多個氨基酸的氨基酸序列而構(gòu)成的肽。例如，還可以使用hTR0P-2的氨基酸序列或其部分序列中缺失I個或多個(優(yōu)選I個或多個(例如I個 10個，更優(yōu)選I個 5個))氨基酸、I或多個(優(yōu)選I個或多個(例如I個 10個，更優(yōu)選I個 5個))氨基酸被其它氨基酸置換、或添加了 I個或多個(優(yōu)選I個或多個(例如I個 10個，更優(yōu)選I個 5個))其它氨基酸的氨基酸序列所構(gòu)成的肽。本發(fā)明中，作為用于導入于細胞等的基因，可以列舉編碼hTROP-2蛋白質(zhì)或其部分片段的基因、或編碼其突變型的蛋白質(zhì)或片段的基因。作為這種基因，例如可以使用具有序列號I所不的喊基序列或其部分序列的基因。另外，作為用于導入于細胞等的基因，還可以使用與序列號I所示的堿基序列互補的序列在嚴緊條件下雜交，且編碼具有hTROP-2活性的蛋白質(zhì)的堿基序列或其部分序列。“嚴緊條件”是指雜交后洗滌時的條件，緩沖液的鹽(鈉)濃度為10 500mM，溫度為42°C 72°C，優(yōu)選 上述鹽濃度為50 300mM，溫度為55 68°C的條件。為了在基因中導入突變，可以通過Kunkel法或帶缺口的雙鏈體(Gappedduplex)法等公知方法進行，例如使用利用定點突變法的突變導入用試劑盒如GeneTai1r Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen 公司 制)、TaKaRaSite-Directed Mutagenesis System (Mutan-K、Mutan_Super Express Km 等:TAKARA BIO公司制)來進行。(2)多克隆抗體的制作將制備的抗原投與到用于免疫的哺乳動物。哺乳動物沒有特別限定，例如可以列舉大鼠、小鼠和兔等，其中優(yōu)選小鼠。每一只動物的抗原投與量，可以根據(jù)佐劑的有無適當設(shè)定。作為佐劑，可以列舉弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FIA)、氫氧化鋁佐劑等。免疫主要可以通過注入到靜脈內(nèi)、腳掌、皮下、腹腔內(nèi)等來進行。而且，免疫的間隔沒有特別限定，以數(shù)天至數(shù)周的間隔優(yōu)選以I周的間隔進行I 10次、優(yōu)選進行2 3次免疫。然后，在最后的免疫日起3 7天后，通過酶免疫測定法(ELISA或EIA)或放射性免疫測定法(RIA)等測定抗體效價，可以在出現(xiàn)所希望的抗體效價之日采血，獲得抗血清。在上述抗體的提取方法中，在需要純化抗體時，可以通過適當選擇或組合硫酸銨鹽析法、離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等公知方法來進行純化。然后，通過ELISA法等測定抗血清中的多克隆抗體的反應(yīng)性。(3)單克隆抗體的制作(3-1)抗體產(chǎn)生細胞的提取本發(fā)明的抗hTROP-2抗體并沒有限制，但優(yōu)選為單克隆抗體。將制備的抗原投與用于免疫的哺乳動物，例如大鼠、小鼠和兔等。每只動物的抗原投與量可以根據(jù)有無佐劑適當設(shè)定。佐劑與上述同樣。免疫方法也與前述同樣。而且，在最后的免疫日起I 60天后，優(yōu)選為I 14天后，提取抗體產(chǎn)生細胞。作為抗體產(chǎn)生細胞，可以列舉脾細胞、淋巴結(jié)細胞和末梢血細胞等，其中優(yōu)選淋巴結(jié)細胞和脾臟細胞。(3-2)細胞融合為了獲得雜交瘤(抗體產(chǎn)生細胞株)，進行抗體產(chǎn)生細胞和骨髓瘤細胞的細胞融合。作為與抗體產(chǎn)生細胞融合的骨髓瘤細胞，可以使用小鼠等動物的一般可以獲得的已建立的細胞株。作為使用的細胞株，優(yōu)選具有藥劑選擇性，具有未融合的狀態(tài)下在HAT選擇培養(yǎng)基(含有次黃嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶脫氧核苷)中無法生存而只有在與抗體產(chǎn)生細胞融合的狀態(tài)下可以生存的性質(zhì)的細胞株。作為骨髓瘤細胞，例如可以列舉P3-X63-Ag8.653、P3-X63-Ag8(X63)、P3-X63_Ag8.Ul (P3Ul)、P3/NSI/l-Ag4-l (NSl)和 Sp2/0_Agl4 (Sp2/0)等小鼠骨髓瘤細胞株。骨髓瘤細胞的選擇，可以適當考慮與抗體產(chǎn)生細胞的適合性而進行。然后，使骨髓瘤細胞與抗體產(chǎn)生細胞進行細胞融合。細胞融合時，在不含血清的DMEM和RPM1-1640培養(yǎng)基等動物細胞用培養(yǎng)基中，混合I X IO6 I X IO7個/mL的抗體產(chǎn)生細胞和2 X IO5 2 X IO6個/mL的骨髓瘤細胞。抗體產(chǎn)生細胞與骨髓瘤細胞的細胞比(抗體產(chǎn)生細胞:骨髓瘤細胞)沒有限制，但通常優(yōu)選為1:1 10:1，更優(yōu)選為3:1。然后，在細胞融合促進劑的存在下進行融合反應(yīng)。作為細胞融合促進劑，例如可以使用平均分子量為1000 6000道爾頓(D)的聚乙二醇等。而且,還可以使用利用電刺激(例如電穿孔)的市售的細胞融合裝置，使抗體產(chǎn)生細胞與骨髓瘤細胞融合。(3-3)雜交瘤的挑選和克隆從細胞融合處理后的細胞中挑選出目的雜交瘤。作為該方法，將細胞懸浮液用例如含有胎牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)基等適當稀釋后，接種于微孔培養(yǎng)板上，在各孔中加入選擇培養(yǎng)基，以后適當更換選擇培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。其結(jié)果是，在選擇培養(yǎng)基中開始培養(yǎng)后，可以將14天前后開始生長的細胞作為雜交瘤。然后，在逐步增殖的雜交瘤的培養(yǎng)上清中，篩選是否存在與hTROP-2反應(yīng)的抗體。雜交瘤的篩選可以按照通常的方法，沒有特別限制。例如，可以采集已長出雜交瘤的孔中所含的培養(yǎng)上清的一部分，通過ELISA、EIA和RIA等進行篩選。融合細胞的克隆可以通過有限稀釋法等進行。通過流式細胞術(shù)等判斷與hTROP-2顯示出強反應(yīng)性的抗體，選擇產(chǎn)生該抗體的雜交瘤，建立克隆。

(3-4)單克隆抗體的提取作為培養(yǎng)已建立的雜交瘤并從獲得的培養(yǎng)物中提取單克隆抗體的方法，可以采取通常的細胞培養(yǎng)法或腹水形成法等。“培養(yǎng)”是指在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中使雜交瘤生長，或如下使雜交瘤在動物的腹腔內(nèi)增殖。細胞培養(yǎng)法中，可以在含有10%胎牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基等動物細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中，在通常的培養(yǎng)條件(例如37°C，5%C02濃度)下培養(yǎng)雜交瘤7 14天，從其培養(yǎng)上清中獲得抗體。腹水形成法的情況下，在與骨髓瘤細胞來源的哺乳動物同種系動物的腹腔內(nèi)投與約I X IO7個雜交瘤，使雜交瘤大量增殖。并且，優(yōu)選在2 3周后提取腹水。在上述抗體的提取方法中，在需要純化抗體時，可以通過適當選擇或組合硫酸銨鹽析法、離子交換層析、凝膠過濾、親和層析等公知方法來進行純化。(3-5)具有抗腫瘤活性的克隆的挑選本發(fā)明的抗hTROP-2抗體是在體內(nèi)具有抗腫瘤活性的抗體。這里，“抗腫瘤活性”是指使腫瘤細胞(癌細胞)死亡的活性或抑制腫瘤生長的活性。作為抗腫瘤活性，例如可優(yōu)選列舉癌細胞增殖抑制活性、腫瘤血管生成抑制活性。此夕卜，作為本發(fā)明的抗體可以發(fā)揮抗腫瘤活性的人腫瘤(腫瘤細胞)的種類，可以列舉已確認hTROP-2的表達的公知的各種人腫瘤，沒有特別限定，可以優(yōu)選列舉出例如人胰癌、人前列腺癌、人大腸癌及人乳腺癌中的I種或2種以上，更優(yōu)選人胰癌。進而，作為上述腫瘤的種類，還可以是復發(fā)癌、轉(zhuǎn)移癌，本發(fā)明的抗體對于這些腫瘤也可以發(fā)揮優(yōu)異的抗腫瘤活性。在體內(nèi)的抗腫瘤活性的確認，例如可以使用在小鼠的皮下移植了所希望的腫瘤細胞的荷瘤小鼠(荷瘤動物治療模型)，通過對該小鼠投與前述獲得的抗體來進行。此時，抗體的投與可以在腫瘤細胞的移植后立即進行(預防模型)，也可以在確認移植腫瘤達到預定體積之后進行(治療模型)。投與方法并沒有限制，例如可以以每3天I次、I周I次、10天I次或2周I次或單次(僅一次)，以5 20mg/kg體重進行腹腔內(nèi)投與等。預防模型的情況下，可以通過腫瘤形成頻率和腫瘤體積評價抗腫瘤活性的有無和水平。治療模型的情況下，可以根據(jù)腫瘤體積評價抗腫瘤活性的有無和水平。本發(fā)明中，作為在體內(nèi)具有抗腫瘤活性的抗hTROP-2抗體，可以優(yōu)選列舉出例如H鏈V區(qū)域的CDRl 3的氨基酸序列分別依次為序列號36 38所示的氨基酸序列，和/或L鏈V區(qū)域的CDRl 3的氨基酸序列分別依次為序列號41 43所示的氨基酸序列的抗體。作為該H鏈V區(qū)域，優(yōu)選例如包含序列號35所示的氨基酸序列的區(qū)域，作為該L鏈V區(qū)域，優(yōu)選例如包含序列號40所示的氨基酸序列的區(qū)域。此外，作為本發(fā)明的抗hTROP-2抗體的其它形態(tài)，可以優(yōu)選列舉例如H鏈V區(qū)域的CDRl 3的氨基酸序列分別依次為序列號46 48所示的氨基酸序列，和/或L鏈V區(qū)域的CDRl 3的氨基酸序列分別依次為序列號51 53所示的氨基酸序列的抗體。作為該H鏈V區(qū)域，優(yōu)選例如包含序列號45所示的氨基酸序列的區(qū)域，作為該L鏈V區(qū)域，優(yōu)選例如包含序列號50所示的氨基酸序列的區(qū)域。

同樣地，作為本發(fā)明的抗hTROP-2抗體的其它形態(tài)，可以優(yōu)選列舉例如H鏈V區(qū)域的CDRl 3的氨基酸序列分別依次為序列號56 58所示的氨基酸序列，和/或L鏈V區(qū)域的CDRl 3的氨基酸序列分別依次為序列號61 63所示的氨基酸序列的抗體。作為該H鏈V區(qū)域，優(yōu)選例如包含序列號55所示的氨基酸序列的區(qū)域，作為該L鏈V區(qū)域，優(yōu)選例如包含序列號60所示的氨基酸序列的區(qū)域。同樣地，作為本發(fā)明的抗hTROP-2抗體的其它形態(tài)，可以優(yōu)選列舉例如H鏈V區(qū)域的CDRl 3的氨基酸序列分別依次為序列號66 68所示的氨基酸序列，和/或L鏈V區(qū)域的CDRl 3的氨基酸序列分別依次為序列號71 73所示的氨基酸序列的抗體。作為該H鏈V區(qū)域，可以列舉出例如包含序列號65所示的氨基酸序列的區(qū)域，作為該L鏈V區(qū)域，可以列舉出例如包含序列號70所示的氨基酸序列的區(qū)域。在本發(fā)明中，作為在體內(nèi)具有抗腫瘤活性的抗hTROP-2抗體，更具體而言，可以優(yōu)選列舉出例如由保藏號為FERM BP-11251的雜交瘤產(chǎn)生的抗hTROP-2單克隆抗體(克隆名:K5-70)、由保藏號為FERM ΒΡ-11252的雜交瘤產(chǎn)生的抗hTROP-2單克隆抗體(克隆名:K5-107)、由保藏號為FERM ΒΡ-11253的雜交瘤產(chǎn)生的抗hTROP-2單克隆抗體(克隆名:K5-116-2-1)、由保藏號為FERM BP-11346的雜交瘤產(chǎn)生的抗hTROP-2單克隆抗體(克隆名:T6-16)及由保藏號為FERM BP-11254的雜交瘤產(chǎn)生的抗hTROP-2單克隆抗體(克隆名:T5-86)等。這里，保藏號為FERM BP-11251的雜交瘤命名為“小鼠-小鼠雜交瘤(Mouse-MouseHybridoma) K5-70”，于2010年5月12日保藏，保藏號為FERM BP-11252的雜交瘤命名為“小鼠-小鼠雜交瘤(Mouse-Mouse Hybridoma) K5-107”，于2010年5月12日保藏，保藏號為FERM BP-11253的雜交瘤命名為“小鼠-小鼠雜交瘤(Mouse-Mouse Hybridoma)K5-116-2-1”，于2010年5月12日保藏，保藏號為FERM BP-11346的雜交瘤命名為“小鼠-小鼠雜交瘤(Mouse-Mouse Hybridoma) T6-16”，于2011年3月I日保藏，保藏號為FERM BP-11254 的雜交瘤命名為“小鼠-小鼠雜交瘤(Mouse-Mouse Hybridoma) T5-86”，于2010年5月12日保藏，均保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(〒305-8566茨城縣筑波市東1-1-1中央第6)。進而，作為本發(fā)明的抗hTR0P-2抗體，還可以優(yōu)選列舉出例如與由保藏號為FERMBP-11251, FERM BP-11252, FERM BP-11253, FERM BP-11346 或 FERM BP-11254 的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體所結(jié)合(識別)的位點(例如表位)結(jié)合的抗hTR0P-2抗體。作為表位，可以優(yōu)選列舉出下述(3-6)項中例示的表位。(3-6)抗hTR0P-2抗體的表位本發(fā)明的抗hTR0P-2抗體的表位(抗原決定簇)只要是抗原h(huán)TR0P-2的至少一部分即可，沒有特別限制，例如優(yōu)選為序列號2所示的hTR0P-2的氨基酸序列中的、除由第252位 第260位的氨基酸構(gòu)成的區(qū)域外的區(qū)域的至少一部分，更優(yōu)選為包含第I位 第69位的氨基酸的區(qū)域的至少一部分或包含第100位 第274位的氨基酸的區(qū)域(由第252位 第260位的氨基酸構(gòu)成的區(qū)域除外)的至少一部分，進一步優(yōu)選為包含第27位 第69位的氨基酸的區(qū)域的至少一部分或包含第109位 第206位的氨基酸的區(qū)域的至少一部分。作為上述表位，特別優(yōu)選包含序列號2所示的hTR0P-2的氨基酸序列中的第43位 第65位的氨基酸的區(qū)域、包含序列號2所示的hTR0P-2的氨基酸序列中的第152位 第165位的氨基酸的區(qū)域、包含序列號2所示的hTR0P-2的氨基酸序列中的第171位 第183位的氨基酸的區(qū)域、包含序列號2所示的hTR0P-2的氨基酸序列中的第109位 第120位的氨基酸的區(qū)域、包含序列號2所示的hTR0P-2的氨基酸序列中的第193位 第206位的氨基酸的區(qū)域、及包含序列號2所示的hTR0P-2的氨基酸序列中的第43位 第56位的氨基酸的區(qū)域、以及包含上述區(qū)域的部分，其中最優(yōu)選的是包含序列號2所示的hTR0P-2的氨基酸序列中的第43位 第65位的氨基酸的區(qū)域、包含序列號2所示的hTR0P-2的氨基酸序列中的第152位 第165位的氨基酸的區(qū)域、包含序列號2所示的hTR0P-2的氨基酸序列中的第171位 第183位的氨基酸的區(qū)域、及包含序列號2所示的hTR0P-2的氨基酸序列中的第109位 第120位的氨基酸的區(qū)域、以及包含上述區(qū)域的部分。識別該區(qū)域的(與該區(qū)域或包含該區(qū)域的部分結(jié)合的)抗hTR0P-2抗體例如對腫瘤細胞內(nèi)的內(nèi)化活性高，在后述的免疫交聯(lián)物等用途中極為有用。(3-7)抗hTR0P-2抗體的特性如前所述，本發(fā)明的抗hTR0P-2抗體為以低用量在體內(nèi)具有高抗腫瘤活性的抗體。具體而言，優(yōu)選對于荷瘤動物模型以20mg/kg體重以下(優(yōu)選10mg/kg體重以下，更優(yōu)選5mg/kg體重以下，進而，優(yōu)選lmg/kg體重以下)的投與量(裸抗體)顯示50%以上(優(yōu)選80%以上，更優(yōu)選90%以上，進而，優(yōu)選95%以上、特別優(yōu)選幾乎100% (例如98%以上或99%以上))的腫瘤生長抑制活性。這里，腫瘤生長抑制活性(％)例如可以通過下式算出。

腫瘤生長抑制活性(％)= 100 -〔(抗體投與組的腫瘤體積或腫瘤重量)+ (對照組的腫瘤體積或腫瘤重量)〕X100
此外，本發(fā)明的抗hTROP-2抗體優(yōu)選對2種以上人腫瘤細胞株具有抗腫瘤活性。作為人腫瘤細胞株，沒有限定，可以列舉出例如選自各種人胰癌細胞株、人前列腺癌細胞株、人大腸癌細胞株及人乳腺癌細胞株組成的組中的至少2種，具體而言，可以優(yōu)選列舉出選自人胰癌細胞株P(guān)K-59、人胰癌細胞株BxPC-3、人胰癌細胞株KP-3L、人胰癌細胞株KP-2、人胰癌細胞株P(guān)K-1、人胰癌細胞株P(guān)K-45H、人胰癌細胞株P(guān)K-45P、人胰癌細胞株TCC-PAN2、人胰癌細胞株SWT-2、人大腸癌細胞株CAC0-2、人大腸癌細胞株SW480、人大腸癌細胞株DLD-1、人大腸癌細胞株HCT116、人乳腺癌細胞株JIMT-1、人乳腺癌細胞株HCC1143、人乳腺癌細胞株MCF-7、人前列腺癌細胞株DU145及人前列腺癌細胞株P(guān)C-3組成的組中的至少2種。其中，作為前述2種以上人腫瘤細胞株，可以更優(yōu)選列舉人胰癌細胞株P(guān)K-59及人胰癌細胞株BxPC-3。進而，本發(fā)明的抗hTROP-2抗體優(yōu)選解離常數(shù)(Kd值)為Ι.ΟΧΙΟ,Μ以下，更優(yōu)選1.0X IO-11M以下，進而，優(yōu)選1.0X IO-12M以下。這里，抗體的結(jié)合能力(親和性)例如可以通過斯卡查德分析(Scatchard analysis)、稱為Biacore的表面等離子體共振傳感器來測定解離常數(shù)(Kd值)、解離速率常數(shù)(Kdiss[l/秒])、結(jié)合速率常數(shù)(Kass[l/M.秒])。作為Biacore裝置，可以列舉出例如Biacore3000、Biacore2000、Biacore X、Biacore J、BiacoreQ (均為Biacore公司)等。就抗體而言，解離常數(shù)(Kd值)值越小則結(jié)合能力(親和性)越強則越優(yōu)選。Kd值可以由Kdiss及Kass兩個參數(shù)確定,例如可以用式:Kd[M] = Kdiss/Kass表示。予以說明，Kd值的計算方法還可以優(yōu)選采用后述實施例(具體為實施例10)中所述方法。(4)基因重組抗體和抗體片段(4-1)基因重組抗體作為本發(fā)明的抗hTROP-2抗體的優(yōu)選方式之一，可以列舉基因重組抗體。作為基因重組抗體，沒有限制，但例如可以列舉嵌合抗體、人源化抗體和人抗體等。嵌合抗體(即人源化嵌合抗體)是小鼠源抗體的可變區(qū)連接(接合)到人來源的恒定區(qū)的抗體(參照 Pr oc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.81，6851-6855，(1984)等)，在制作嵌合體時，可以通過基因重組技術(shù)容易地構(gòu)建，從而獲得這樣連接的抗體。在制作人源化抗體時，通過從小鼠抗體的可變區(qū)將互補性決定區(qū)(⑶R)移植到人可變區(qū)，框架區(qū)(FR)為人來源，CDR由小鼠來源的CDR構(gòu)成，制備重構(gòu)的可變區(qū)(即CDR移植(⑶R grafting))。然后，將這些人源化的重構(gòu)的人可變區(qū)與人恒定區(qū)連接。這種人源化抗體的制作方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的(參照Nature，321，522-525 (1986) ；J.Mol.Biol.，196,901-917 (1987)；Queen C et al.,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 86:10029-10033 (1989)；日本特表平4-502408號公報(日本特許第2828340號公報；Queen等)等)。人抗體(完全人抗體),一般是V區(qū)域的抗原結(jié)合位點即高變區(qū)(Hyper Variableregion)，V區(qū)域的其它部分和恒定區(qū)的結(jié)構(gòu)具有與人的抗體相同的結(jié)構(gòu)。但是，高變位點也可以來源于其它動物。制作人抗體的技術(shù)也是公知的，已建立了通過基因工程學的手法來制作人共通的基因序列的方法。人抗體例如可以通過使用含有具有人抗體的H鏈和L鏈基因的人染色體片段的人抗體產(chǎn)生小鼠的方法(參照Tomizuka, K.et al., NatureGenetics, (1977)16，133-143 ；Kuroiwa,Y.et.al.，Nuc.Acids Res.，(1998)26，3447-3448 ；Yoshida, H.et.al., Animal Cell Technology:Basic and Applied Aspects, (1999) 10,69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T.and Iijima, S.eds.), Kluwer Academic Publishers ；Tomizuka, K.et.al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, (2000) 97，722-727 等)和獲得從人抗體文庫挑選的曬菌體展示來源的人抗體的方法(參照Wormstone, 1.M.et.al, InvestigativeOphthalmology & Visual Science.,(2002)43 (7),2301-8 ；Carmen,S.et.al.,Briefingsin Functional Genomics and Proteomics, (2002) 1 (2),189-203 ；Siriwardena, D.et.al.，Opthalmology，(2002) 109 (3)，427-431 等)而獲得。上述嵌合抗體、人源化抗體和人抗體，優(yōu)選為抗體Fe區(qū)域中的N-糖苷鍵復合型糖鏈為該糖鏈的還原末端的N-乙酰葡糖胺不與巖藻糖結(jié)合的糖鏈，具體而言可以列舉在抗體分子的Fe區(qū)域中具有該巖藻糖的I位不與N-糖苷鍵復合型糖鏈還原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位發(fā)生α結(jié)合的糖鏈的基因重組抗體分子所構(gòu)成的抗體。如果是這種抗體，則可以使ADCC活性極大提高。而且，前述的多克隆抗體和單克隆抗體同樣優(yōu)選這一點(抗體Fe區(qū)域中N-糖苷鍵復合型糖鏈的特征)。(4-2)抗體片段
本發(fā)明的抗hTR0P-2抗體的片段(部分片段)也包含在本發(fā)明的抗體中。其中，本發(fā)明的抗體片段與本發(fā)明的抗hTR0P-2抗體一樣，具有與hTR0P-2結(jié)合的活性(即可以結(jié)合到hTR0P-2上)，在體內(nèi)具有抗腫瘤活性。作為該抗體的片段，是指抗hTR0P-2多克隆抗體或抗hTR0P-2單克隆抗體的一部分的區(qū)域(即，來源于本發(fā)明的抗hTR0P-2抗體的抗體片段)，例如，可以列舉Fab、Fab’、F(ab’ ) 2、Fv (抗體可變區(qū))、單鏈抗體(H鏈、L鏈、H鏈V區(qū)域和L鏈V區(qū)域等)、scFv、雙抗體(diabody) (scFv 二聚物)、dsFv (二硫化物穩(wěn)定化V區(qū)域)和至少一部分含有互補性決定區(qū)(complementarity determining region:CDR)的月太等。Fab是用蛋白質(zhì)分解酶中的木瓜蛋白酶處理抗體分子而獲得的片段中，H鏈的N末端側(cè)約一半和L鏈全體通過二硫鍵結(jié)合的、分子量約為5萬的具有抗原結(jié)合活性的抗體片段。而且，還可以通過將編碼抗體的Fab的DNA插入于原核生物用表達載體或真核生物用表達載體中，通過將該載體導入到原核生物或真核生物而使之表達，制造Fab。F (&13’)2是用蛋白質(zhì)分解酶中的胃蛋白酶處理抗體分子而獲得的片段中，F(xiàn)ab通過鉸鏈區(qū)的二硫鍵結(jié)合的稍大的、分子量約為10萬的具有抗原結(jié)合活性的抗體片段。而且，還可以通過后述的使Fab形成硫醚鍵或二硫鍵進行制作。Fab’是切斷上述F (ab’)2的鉸鏈區(qū)的二硫鍵的、分子量約為5萬的具有抗原結(jié)合活性的抗體片段。而且，還可以通過將編碼抗體的Fab’片段的DNA插入于原核生物用表達載體或真核生物用表達載體中，通過將該載體導入于原核生物或真核生物而使之表達，制造Fab’。scFv是將I條H鏈V區(qū)域(VH)和I條L鏈V區(qū)域(VL)用適當?shù)碾倪B接子(P)連接的VH-P-VL或VL-P-VH多肽，其是具有抗原結(jié)合活性的抗體片段。scFv可以如下制備，即，獲得編碼抗體的VH和VL的cDNA，構(gòu)建編碼scFv的DNA，將該DNA插入于原核生物用表達載體或真核生物用表達載體中，再將該表達載體導入于原核生物或真核生物中使之表達而進行制造。雙抗體是scFv 二聚化形成的抗體片段，其為具有二價的抗原結(jié)合活性的抗體片段。二價的抗原結(jié)合活性可以是相同的，也可以是其中一方為不同的抗原結(jié)合活性。雙抗體可以如下制備，即，通過獲得編碼抗體的VH和VL的cDNA，構(gòu)建編碼scFv的DNA并使P的氨基酸序列的長度達到8個殘基以下，將該DNA插入于原核生物用表達載體或真核生物用表達載體，再將該表達載體導入于原核生物或真核生物使之表達而進行制造。dsFv是指使VH和VL中的各I個氨基酸殘基被換成半胱氨酸殘基的多肽通過該半胱氨酸殘基間的二硫鍵結(jié)合形成的抗體。被換成半胱氨酸殘基的氨基酸殘基可以按照Reiter等人公開的方法(Protein Engineering, 7,697-704,1994),基于抗體的立體結(jié)構(gòu)預測進行選擇。dsFv可以如下制備:通過獲得編碼抗體的VH和VL的cDNA,構(gòu)建編碼dsFv的DNA，將該DNA插入到原核生物用表達載體或真核生物用表達載體中，再將該表達載體導入于原核生物或真核生物中使之表達而進行制造。含有⑶R的肽包含VH的⑶R (⑶Rl 3)及VL的⑶R (⑶Rl 3)中的至少I個以上區(qū)域而構(gòu)成，更優(yōu)選包含VH的全部⑶R的肽、及包含VL的全部⑶R的肽，特別優(yōu)選包含VH及VL的全部CDR (共6個區(qū)域)的肽。作為CDR的氨基酸序列，可以優(yōu)選列舉例如前述序列號36 38、41 43、46 48、51 53、56 58、61 63、66 68及71 73所示的氨基酸序列。包含多個CDR的肽可以直接或介由適當?shù)碾倪B接子結(jié)合。含有CDR的肽可以通過構(gòu)建編碼抗體的VH和VL的⑶R的DNA，將該DNA插入原核生物用表達載體或真核生物用表達載體中，再將該表達載體導入原核生物或真核生物中使之表達而進行制造。此外，含有⑶R的肽還可以通過Fmoc法(芴甲氧羰基法)和tBoc法(叔丁氧羰基法)等化學合成法來制造。作為本發(fā)明的抗體片段，可以是以原有的形狀含有N-糖苷鍵復合型糖鏈為該糖鏈的還原末端的N-乙酰葡糖胺不與巖藻糖結(jié)合的糖鏈的抗體Fe區(qū)域的一部分或全部的抗體片段，而且，也可以是上述抗體片段與N-糖苷鍵復合型糖鏈為該糖鏈的還原末端的N-乙酰氨基葡萄糖不與巖藻糖結(jié)合的糖鏈的抗體Fe區(qū)域的一部分或全部的融合蛋白質(zhì)。這種抗體片段可以極大地提高ADCC活性，因而優(yōu)選。以下本說明書中的說明中，上述抗體片段也包含于本發(fā)明的抗hTROP-2抗體中。3.抗體-藥劑復合 物的制作作為使用上述本發(fā)明的抗hTROP-2抗體的免疫交聯(lián)物等，可以提供含有該抗體以及具有抗腫瘤活性和/或細胞殺傷活性的物質(zhì)(化合物等)的抗體-藥劑復合物。予以說明，在預先分別制備該抗體分子以及具有抗腫瘤活性和/或細胞殺傷活性的物質(zhì)之后，將它們復合化而獲得的物質(zhì)一般被稱為免疫交聯(lián)物。而且，通過使用基因重組技術(shù)，將具有抗腫瘤活性和/或細胞殺傷活性的物質(zhì)中的蛋白質(zhì)毒素在基因上與抗體基因連接，作為I個蛋白質(zhì)(融合蛋白質(zhì))表達而獲得的物質(zhì)一般被稱為免疫毒素。作為具有抗腫瘤活性的物質(zhì)，例如，可以列舉阿霉素(doxorubicin)、卡奇霉素(calicheamicin)、絲裂霉素(mitomycin) C、Auristatin E、放射性同位素(RI)等。作為具有細胞殺傷活性的物質(zhì)，例如，可以列舉皂草素、篦麻毒素、綠膿桿菌外毒素、白喉毒素、放射性同位素(RI)等，其中優(yōu)選使用皂草素和綠膿桿菌外毒素。予以說明，作為具有抗腫瘤活性和/或細胞殺傷活性的RI，沒有限定，可以列舉出例如9°Y、mIn、1251、3H、35S、14C、186Re、188Re,189Re,177Lu,67Cu,212Bi,213Bi,211At,198Au,224Ac, 1261 , 1331 , 77Br,113mln,95Ru,97Ru, 103Ru,105Ru,107Hg>203Hg>94mTc,121mTe, 122mTe, 125mTe,165Tm, 167Tm, 168Tm,111Ag, 197Pt, 109Pd,32P,33P,47Sc,153Sm,177Lu、105Rh、142Pr、143Pr、161Tb、166Ho、199Au、57Co、58Co、51Cr、59Fe、18F、75Se、201T1、225Ac、76Br、86Y、169Yb、166Dy、212Pb 及 223Ra 等。作為抗體-藥劑復合物的制作方法并沒有限制，例如，可以列舉通過二硫鍵或腙鍵將抗體與藥劑偶聯(lián)的方法等。上述本發(fā)明的抗hTROP-2抗體在對表達hTROP-2的目標腫瘤細胞內(nèi)的內(nèi)化活性方面優(yōu)異。因此，通過預先使具有抗腫瘤活性和/或細胞殺傷活性的物質(zhì)復合化，可以使這些物質(zhì)直接且高選擇地作用于腫瘤細胞。本發(fā)明的抗體-藥劑復合物在向目標腫瘤細胞傳送藥劑的能力上極為優(yōu)異。予以說明，對細胞內(nèi)的內(nèi)化活性可以如下評價，S卩，通過用羅丹明等對抗體進行螢光標記，用螢光顯微鏡等觀察向細胞內(nèi)的進入舉動和抗體的定位性。另外，本發(fā)明中還可以提供在抗體-藥劑復合物中使用前述抗體片段代替抗體的抗體片段-藥劑復合物。抗體片段-藥劑復合物的詳細內(nèi)容可以適當應(yīng)用上述抗體-藥劑復合物的說明。以下，本說明書的說明中，抗體片段-藥劑復合物也包含于本發(fā)明的抗體-藥劑復合物中。4.藥物組合物本發(fā)明的抗hTROP-2抗體和抗體-藥劑復合物作為包含于藥物組合物中的有效成分是有用的。該藥物組合物作為腫瘤的治療用和/或診斷用的藥物組合物是有用的。尤其是，由于本發(fā)明的抗hTROP-2抗體和含有該抗體的抗體-藥劑復合物具有作為抗腫瘤活性的優(yōu)異的腫瘤生長抑制活性，因此優(yōu)選在腫瘤的治療用中使用。即，本發(fā)明的抗hTROP-2抗體和抗體-藥劑復合物作為包含于腫瘤治療劑和腫瘤診斷劑中的有效成分是有用的。予以說明，本發(fā)明中，上述腫瘤 的治療還包括抑制腫瘤生長和阻遏腫瘤生長的意思，具體而言，例如若為腫瘤治療劑，則還包括腫瘤生長抑制劑(tumor growth inhibitor)和腫瘤生長阻遏劑(tumor growth suppressor)的形態(tài)。此外,本發(fā)明的藥物組合物還可以與公知的抗腫瘤劑并用。通過并用，可以獲得更好的抗腫瘤效果。本發(fā)明的藥物組合物含有本發(fā)明的抗hTR0P-2抗體和/或抗體-藥劑復合物作為有效成分，而且優(yōu)選以包括藥學上允許的載體的藥物組合物的形態(tài)提供。作為本發(fā)明的藥物組合物的適用對象疾病(腫瘤)，可以列舉確認了表達hTR0P-2的前述公知的各種人腫瘤。其中，特別優(yōu)選列舉人胰癌、人前列腺癌、人大腸癌、和人乳腺癌中的I種或2種以上。這些疾病可以是單獨的，也可以是2種以上并發(fā)。此外，作為對象的腫瘤還可以是復發(fā)癌、轉(zhuǎn)移癌，本發(fā)明的藥物組合物(進而，本發(fā)明的抗hTR0P-2抗體和/或抗體一藥劑復合物)可以有效用作復發(fā)癌、轉(zhuǎn)移癌的治療劑和診斷劑。所謂“藥學上允許的載體”，可以列舉賦形劑、稀釋劑、增量劑、崩解劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、緩沖劑、乳化劑、芳香劑、著色劑、甜味劑、粘稠劑、矯味劑、增溶劑或其它添加劑等。通過使用I種以上這種載體，可以制備注射劑、液劑、膠囊劑、懸浮劑、乳劑或糖漿劑等形態(tài)的藥物組合物。這些藥物組合物可以經(jīng)口或非經(jīng)口投與。作為用于非經(jīng)口投與的其它形態(tài)，包括含有I種以上的活性物質(zhì)的通過常規(guī)方法制備的注射劑等。注射劑的情況中，可以通過溶解或懸浮于生理鹽水或市售的注射用蒸餾水等藥學上允許的載體中來制造。尤其是，對生物體內(nèi)投與本發(fā)明的抗hTR0P-2抗體來源的抗體片段(其中尤其是低分子的物質(zhì))時，在其基礎(chǔ)上還可以使用膠體分散系。膠體分散系可期待具有提高化合物(抗體片段)在生物體內(nèi)穩(wěn)定性的效果和將化合物高效輸送到特定的內(nèi)臟器官、組織或細胞的效果。膠體分散系只要為通常使用的即可，沒有限制，可以列舉聚乙二醇、高分子復合物、高分子凝集體、納米膠囊、微球體、珠子和水包油系的乳化劑、膠束、混合膠束和以包含脂質(zhì)體在內(nèi)的脂質(zhì)為基礎(chǔ)的分散系，優(yōu)選為具有將化合物高效輸送到特定臟器、組織或細胞的效果的多個脂質(zhì)體、人工膜的小囊泡(Mannino et al.,Biotechniques, 1988,6,682 ；Blumeand Cevc, Biochem.et Biophys.Acta,1990,1029,91 ；Lappalainen et al., AntiviralRes.，1994，23，119 ;Chonn and CulI is, Current Op.Biotech.，1995，6，698)。本發(fā)明的藥物組合物的投與量根據(jù)患者的年齡、性別、體重和癥狀、治療效果、投與方法、處理時間或藥物組合物所含的本發(fā)明的抗hTROP-2抗體和抗體-藥劑復合物的種類等而不同。通常，成人每人每次可以在600yg到6000mg的范圍內(nèi)投與，但并不限于此范圍。例如通過注射劑投與時，對人患者I次的投與中，可以每Ikg體重平均I天以I次 數(shù)次投與ΙΟΟμ g IOOmg的量，還可以優(yōu)選采用每3天、I周、10天或2周投與I次或單次(總計投與次數(shù)為I次)投與的方式。作為投與的形態(tài)，可以列舉靜脈內(nèi)注射、皮下注射、皮內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射或腹腔內(nèi)注射等,優(yōu)選為靜脈內(nèi)注射。而且,注射劑根據(jù)情況還可以調(diào)制成非水性的稀釋劑(例如聚乙二醇、橄欖油等植物油、乙醇等醇類等)、懸浮劑或乳濁齊IJ。這種注射劑的無菌化可以通過過濾器進行過濾殺菌、配合殺菌劑等來進行。注射劑可以制備成使用時調(diào)制的形態(tài)。即，可以通過冷凍干燥法等制成無菌的固體組合物，在使用前溶解于無菌的注射用蒸餾水或其它溶劑中使用。另外，本發(fā)明還提供用于制造治療和/或診斷腫瘤的藥物(藥劑)的前述本發(fā)明的抗hTR0P-2抗體和/或抗體-藥劑復合物的應(yīng)用。而且，本發(fā)明還提供治療和/或診斷腫瘤用的前述本發(fā)明的抗hTR0P-2抗體和/或抗體-藥劑復合物。此外，本發(fā)明還提供腫瘤的治療和/或診斷方法，其特征在于，其使用前述本發(fā)明的抗hTR0P-2抗體和/或抗體-藥劑復合物(即投與患者)，而且，還提供前述本發(fā)明的抗hTR0P-2抗體和/或抗 體-藥劑復合物在用于治療和/或診斷腫瘤中的應(yīng)用。5.腫瘤的檢測方法本發(fā)明的腫瘤檢測方法的特征在于，使前述本發(fā)明的抗hTR0P-2抗體與從生物體采集的試樣(以下稱生物體試樣)反應(yīng)，檢測發(fā)生反應(yīng)的抗體的信號的方法。如前所述，由于確認了 hTR0P-2在各種腫瘤細胞中特異性表達，hTR0P_2，尤其是游離hTR0P-2 (hTR0P-2的細胞外區(qū)域部分)可以作為各種腫瘤標志來使用。其中，優(yōu)選作為人胰癌、人前列腺癌、人大腸癌、和人乳腺癌的靶標來使用。因此，可以通過使本發(fā)明的抗hTR0P-2抗體與生物體試樣反應(yīng)，檢測發(fā)生反應(yīng)的抗體的信號來檢測腫瘤。獲得的抗體的信號成為生物體試樣中的抗原量(即hTR0P-2量或游離hTR0P-2 fi)的指標。使用本發(fā)明的抗體的腫瘤的檢測，首先，使作為試樣的從被驗者中提取的生物體試樣，例如作為檢查對象的組織片或血液等與本發(fā)明的抗體通過抗原抗體反應(yīng)結(jié)合。然后，基于結(jié)合的抗體量的測定結(jié)果，測定生物體試樣中的目的抗原量，從而進行。該測定可以按照公知的免疫學測定法進行，例如，可以使用免疫沉淀法、免疫凝集法、標記免疫測定法、免疫比池法、western blot法、流式細胞術(shù)法等。標記免疫測定法中,抗體的信號除了以用標記抗體直接檢測的標記量表示之外，還可以以已知濃度或已知抗體效價的抗體作為標準液相對地表示。S卩，可以通過測定計測定標準液和試樣，以標準液的值作為基準，相對地表示生物體試樣中的抗體信號。作為標記免疫測定法，例如可以列舉ELISA法、EI法、RIA法、螢光免疫測定(FIA)法、化學發(fā)光免疫測定法(Luminescence immunoassay)等。其中ELISA法由于簡便和高靈敏度而尤其優(yōu)選。本發(fā)明中，可以將通過上述檢測方法獲得的檢測結(jié)果作為指標來評價或診斷腫瘤的狀態(tài)。例如，檢測結(jié)果超過預定的基準值時判斷為腫瘤陽性，在預定的基準值以下時判斷為腫瘤陰性，為陽性時，判斷為有發(fā)生任意一種腫瘤的可能性，可以評價腫瘤的狀態(tài)。這里，所謂腫瘤的狀態(tài)是指是否患有腫瘤或其進行程度，可以列舉腫瘤發(fā)病的有無、進行度、惡性程度、轉(zhuǎn)移的有無和復發(fā)的有無等。在上述評價時，作為腫瘤的狀態(tài)，可以選擇I個，也可以組合選擇多個。腫瘤的有無的評價，可以基于所獲得的檢測結(jié)果，通過以預定的基準值作為界限，判斷是否患有腫瘤來進行。腫瘤的惡性程度是表示癌進行到何種程度的指標，也可以基于檢測結(jié)果，對病期(Stage)分類再進行評價，或分類為早期癌或晚期癌再進行評價。例如，還可以將檢測結(jié)果作為指標，評價為早期癌或晚期癌。腫瘤的轉(zhuǎn)移，可以通過以檢測結(jié)果作為指標，根據(jù)在從原發(fā)瘤的位置離開的位點是否出現(xiàn)新生物來評價。復發(fā)，可以根據(jù)在間歇期或緩解后檢測結(jié)果是否再次超過預定的基準值來評價。6.腫瘤的檢測用或診斷用試劑盒本發(fā)明的抗hTROP-2抗體可以以腫瘤的檢測用或診斷用試劑盒的形態(tài)提供。本發(fā)明的試劑盒含有抗體，此外還可以含有標記物質(zhì)、或用于固定抗體或該標記物的固定化試劑等。所謂抗體的標記物質(zhì)是指用酶、放射性同位素、螢光化合物和化學發(fā)光化合物等標記的物質(zhì)。本發(fā)明的試劑盒除了上述構(gòu)成要素之外，還可以含有用于實施本發(fā)明的檢測的其它試劑，例如標記物為酶標記物時，可以含有酶底物(顯色性底物等)、酶底物溶解液、酶反應(yīng)停止液、或試樣用稀釋液等。而且，還可以含有各種緩沖液、無菌水、各種細胞培養(yǎng)容器、各種反應(yīng)容器(Eppendorf管等)、封閉劑(牛血清白蛋白(BSA)、脫脂乳、山羊血清等血清成分)、洗滌劑、表面活性劑、各種板、疊氮化鈉等防腐劑和實驗操作手冊(說明書)等。本發(fā)明的試劑盒可有效用于進行上述本發(fā)明的檢測方法，其有用性極高。以下，通過列舉實施例對本發(fā)明進行更具體的說明，但本發(fā)明并不限于此?！矊嵤├?〕[hTROP-2基因的克隆]hTROP-2全長基因的分離是通過RT-PCR法由人胎兒肝臟(10周大的胚胎)進行的。首先，基于hTROP-2基因(Genbank登錄號N0.NM002353)的序列設(shè)計了以下所示的PCR引物。正向側(cè)引物:5’-ttcctccgccccaccatggc-3’(序列號 3)反向側(cè)引物:5’-ctcgagcaagctcggttcctttctc-3’(序列號 4)此時，反向側(cè)引物中除去了`終止密碼子并添加了 Xho I的限制酶消化序列。以由這些引物和人胎兒肝臟(10周大的胚胎)制備的總RNA (TAKARA)合成的cDNA為模板進行PCR反應(yīng)。然后，利用瓊脂糖凝膠電泳進行展開、進行目標條帶的提取，克隆到pCRII載體(Invitrogen)中(pCRII_hTR0P2)。通過測序，對所克隆的hTROP-2的cDNA進行了確認。
表達載體的構(gòu)建:由pCRII_hTR0P2切出含有hTROP-2基因的Eco RI/Xho I片段，插入到pcDNA4/ my C-Hisl5 A載體(Invitrogen)的EcoRI/Xho I位點，從而進行構(gòu)建(pcDNA4-hTR0P2-myc/His)。此外，由 pcDNA4-hTR0P2_myc/His 切出含有 hTROP-2 基因的Hind ΙΙΙ/Pme I片段，(Hind III切斷位點進行了平滑末端化)、插入到pcDNA3.1(+ )載體(Invitrogen)的Pme I位點，從而構(gòu)建了具有新霉素耐性基因的表達載體(pcDNA3.l-hTR0P2-myc/His)?！矊嵤├?〕[hTROP-2基因穩(wěn)定細胞株的構(gòu)建]使用lipofectamine2000試劑(Invitrogen),將按照上述方法制作的編碼hTROP-2 的全長 cDNA 的表達載體(pcDNA3.l-hTR0P2_myc/His)導入 HEK293 細胞(RIKEN)、HuH-7 細胞(HSRRB)、7E2-C 細胞(W02005/052156 中所記載的)、CHO-Kl 細胞(HSRRB)中，利用抗生素G418 (遺傳霉素，GIBCO BRL)進行選擇后，建立了穩(wěn)定表達hTROP-2的細胞株，從而獲得。

〔實施例3〕[hTROP-2細胞外區(qū)域的重組蛋白制作]通過PCR法對編碼hTROP-2細胞外區(qū)域的一部分(具體而言，包含序列號2所示的氨基酸序列中的第I位 第263位的氨基酸的區(qū)域)的基因片段進行了擴增。擴增中使用的引物如下所示。正向側(cè)引物:5’-ttcctccgccccaccatggc-3 (序列號 3)反向側(cè)引物:5’-ctcgagctcgtccaggtaatagatgagcg-3’(序列號 5)此時，反向側(cè)引物中添加了 Xho I限制酶消化位點。利用瓊脂糖凝膠電泳對PCR法擴增獲得的DNA片段進行展開,使用QIAquick(注冊商標)Gel Extraction Kit(QIAGEN)進行純化。純化而得的DNA片段亞克隆至pCR Blunt載體(Invitrogen)中(pCRB-hTR0P-2EC)，確認基因序列。然后，由pCRB-hTR0P-2EC切出含有編碼hTROP-2的細胞外區(qū)域的基因片段的 Eco RI/Xho I 片段，插入到 pcDNA4/myc-His'' A 載體(Invitrogen)的 Eco RI/Xho I位點(pcDNA4mH-hTR0P-2EC)。進而，為了在 pcDNA4mH-hTR0P_2EC 的 Bam HI/Eco RI 位點制作Nru I限制酶切斷位點，連接、插入以下所示的寡核苷酸。寡核苷酸1:5’ -gatccactagtcgcgagtggtgg-3’(序列號 6)寡核昔酸2:5’ -aattccaccactcgcgactagtg-3’(序列號 7)同樣地在pcDNA4mH-hTR0P-2EC 的 Pme I 位點插入 pBglll 連接子(TAKARA)(pcDNA4mH-NB-hTR0P-2EC)。為了使用桿狀病毒(baculovirus)制作重組蛋白，由pcDNA4mH-NB-hTR0P-2EC切出含有編碼hTROP-2的細胞外區(qū)域的基因片段的Nru I/Bgl II片段，插入到PPSC8載體(日本農(nóng)產(chǎn)工業(yè))的Nru I/Bgl II位點(pPSC8_hTR0P2EC)。委托日本農(nóng)產(chǎn)工業(yè)來進行使用桿狀病毒制作hTROP-2細胞外區(qū)域的重組蛋白。hTROP-2細胞外區(qū)域的重組蛋白的純化如下進行。在含有重組蛋白的培養(yǎng)上清中加入Ni Sepharose6Fast Flow (GE Healthcare),在4°C下進行2小時結(jié)合。然后，使用Econo柱(BIO RAD)，用含有20mM咪唑的磷酸緩沖液洗滌，用含有300mM咪唑的磷酸緩沖液進行洗脫，從而進行純化?！矊嵤├?〕
[人EpCAMcDNA的分離和表達載體的構(gòu)建]人EpCAM全長基因的分離是通過RT-PCR法由人胎兒肝臟(10周大的胚胎)進行的。首先，基于人EpCAM基因(Genbank登錄號N0.NM002354)的序列設(shè)計了以下所示的PCR引物。正向側(cè)引物:5’-tcctcgtgtcccactcccgg-3’(序列號 8)反向側(cè)引物:5’-ctcgagtgcattgagttccctatgc-3’(序列號 9)此時，反向側(cè)引物中除去了終止密碼子并添加了 Xho I的限制酶消化序列。以由這些引物和人胎兒肝臟(10周大的胚胎)源的總RNA (TAKARA)合成的cDNA為模板進行PCR反應(yīng)。然后，利用瓊脂糖凝膠電泳進行展開、進行目標條帶的提取，克隆到pCRII載體(Invitrogen)中(pCRI1-hEpCAM)。通過測序,對克隆的人EpCAM的cDNA進行了確認。表達載體的構(gòu)建:由pCRI1-hEpCAM切出含有人EpCAM基因的Eco RI/Xho I片段，插入到pcDNA4/ myC-His''1 A載體(Invitrogen)的EcoRI/Xho I位點，從而進行構(gòu)建(pcDNA4-hEpCAM-myc/His)。此外，由 pcDNA4-hEpCAM_myc/His 切出含有人 EpCAM 基因的Hind ΙΙΙ/Pme I片段，(Hind III切斷位點進行了平滑末端化)、插入到pcDNA3.1(+ )載體(Invitrogen)的Pme I位點，從而構(gòu)建了具有新霉素耐性基因的表達載體(pcDNA3.1-hEpCAM-myc/His)。

〔實施例5〕[抗hTROP-2單克隆抗體的制作]作為免疫原，使用了 hTROP-2穩(wěn)定表達細胞株(HEK293-hTR0P_2細胞、CHO-K1-hTROP-2細胞、7E2-C-hTR0P-2細胞)、在細胞表面內(nèi)源性表達hTROP-2蛋白的人胰臟癌細胞株(PK-59，RCB1901 ;由RIKEN cell bank購入)、或通過上述方法制作的hTROP-2的細胞外區(qū)域的重組蛋白。在hTROP-2穩(wěn)定表達細胞株時將I X IO7細胞、在重組hTROP-2蛋白時將20 μ g蛋白分別與免疫輔助劑TiterMax Gold (Funakoshi株式會社)以1:1混合,制備乳池液,注射到小鼠(C57/BL6，Balb/c)的兩腳掌、或腹腔內(nèi)(初次免疫)。在對兩腳掌短期免疫時，從初次免疫起3天后及10天后進行加強免疫,在最后一次免疫的次日，取出兩膝窩的淋巴結(jié)，制備淋巴細胞。在向腹腔內(nèi)長期免疫時，從初次免疫起以每周I次的比例進行加強免疫(在I 2個月內(nèi)實施)，按照常規(guī)方法由脾臟分離B細胞。加強免疫時，在細胞免疫的情況下使用5X IO6細胞的用PBS懸浮的細胞懸浮液，在蛋白質(zhì)抗原的情況下，使用5 μ g的PBS溶液。將制備的淋巴細胞和小鼠骨髓瘤細胞株(P3-X63_Ag8.653)以3:1的比例混合，用聚乙二醇法進行細胞融合，用含有HAT (氨基蝶呤、次黃嘌呤、胸腺嘧啶脫氧核苷)的甲基纖維素培養(yǎng)基(商品名:ClonaCeI1-HY Cloning Medium D ；Stem Cell)培養(yǎng)7 28天,將增殖出來的雜交瘤的單一集落一個一個地挑到96孔平底培養(yǎng)板中，使用含有HAT的液體選擇培養(yǎng)基在5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對來自于增殖出來的單一集落的雜交瘤的培養(yǎng)上清，利用Cell ELISA(后述)進行一次篩選、通過使用HuH-7-hTR0P_2細胞，PK-59的FACS解析進行2次篩選，從而建立了 300種產(chǎn)生識別在活細胞的細胞表面表達的hTR0P-2蛋白的抗hTR0P-2單克隆抗體的雜交瘤?！矊嵤├?〕[使用CellELISA進行的一次篩選]
在96孔培養(yǎng)板(BD Falcon)中，以3 X IO4細胞/孔交替接種CHO-Kl細胞(hTROP-2 陰性對照:由 Japan Health Sciences Foundation 購入)、和 CHO-Kl-hTROP-2 細胞(或 HuH_7 細胞(hTROP-2 陰性對照:由 Japan Health Sciences Foundation 購入)和HuH-7-hTR0P-2細胞)，在5%C02、37°C下培養(yǎng)I 2天。通過傾析除去細胞培養(yǎng)液，接下來用冰冷PBS洗滌后，用4%多聚甲醛-PBS處理5分鐘，從而將細胞固定，用冰冷PBS洗滌后，作為ELISA板。之后，按照常規(guī)方法進行ELISA法。具體如下所示。首先，在室溫下用2%脫脂乳-PBS溶液進行30分鐘 I小時封閉。接下來，加入雜交瘤培養(yǎng)上清，在室溫下反應(yīng)I小時后，用0.l%Tween20-PBS溶液洗滌3次。加入作為二抗的用封閉溶液稀釋1000倍的辣根過氧化物酶(HRP)標記抗小鼠IgG (GE HealthcareBiosciences)，在室溫下反應(yīng)I小時后，用0.l%Tween20_PBS溶液洗滌3次。添加TMB(3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺:SIGMA)底物溶液進行顯色反應(yīng)，加入IM硫酸使反應(yīng)停止。使用酶標儀Model550 (BIO RAD)測定吸光度(405nm)。將相對于陰性對照顯示高吸光度值的雜交瘤培養(yǎng)上清的相應(yīng)雜交瘤在24孔平底培養(yǎng)板中進行擴大培養(yǎng)，轉(zhuǎn)移到使用FACS解析進行的二次篩選(后述)。〔實施例7〕[使用FACS解析進行的二次篩·選]對上述用Cell ELISA進行的一次篩選中為陽性的雜交瘤，使用FACS解析進行二次篩選。就細胞而言，以不表達hTR0P-2的人肝癌細胞株HuH-7細胞為陰性對照，以相對于表達hTR0P-2的穩(wěn)定細胞株HuH-7-hTR0P-2細胞的反應(yīng)性為指標進行評價，接下來以與在細胞表面內(nèi)源性表達hTR0P-2蛋白的人胰臟癌細胞株P(guān)K-59細胞(RCB1901 ;由RIKEN cellbank購入)的反應(yīng)性進行評價。通過胰蛋白酶處理將細胞從培養(yǎng)皿剝離，制備細胞懸浮液(細胞密度2X106cells/mL)o使在使用Cell ELISA進行的一次篩選中顯示陽性反應(yīng)的雜交瘤上清和細胞懸浮液100μ L于4V反應(yīng)20分鐘。用PBS洗滌后，使之與PE標記抗小鼠IgG (BDPharmingen) (0.1 μ g)反應(yīng)(4°C, 30 分鐘)后，用 FACS Calibur (Becton, Dickinson andCompany)解析。最終，建立了約300種產(chǎn)生識別在活細胞的細胞表面表達的hTR0P-2蛋白的抗hTR0P-2單克隆抗體的雜交瘤。〔實施例8〕[同種型的鑒定]使用小鼠單克隆抗體同種型測定試劑盒(Serotec公司)并按照試劑盒所附方法進行制作的抗hTR0P-2單克隆抗體的同種型的鑒定?！矊嵤├?〕[TR0P-2抗體的腹水化及抗體純化]在預先(7天前)投與2，6，10, 14-四甲基十五烷(pristane)的BALB/c裸小鼠的腹腔內(nèi)投與3X IO6個按照上述方法制作的雜交瘤的克隆，采集2周后的腹水。進而，進行辛酸沉淀、使用蛋白 G 柱(HiTrap protein G ；GE Healthcare Biosciences)或蛋白 A 柱(HiTrap protein A ；GE Healthcare Biosciences)進行親和純化,從而由該腹水獲得各雜交瘤克隆所產(chǎn)生的抗hTR0P-2單克隆抗體。
〔實施例10〕[抗原親和性的測定(Kd值的測定)]通過使用了 ELISA的方法計算所制作的抗hTROP-2單克隆抗體的抗原親和性(Kd值)(Djavad1-Ohaniance L.et al(1996),In Antibody Engineering,Chapter4,pp77-97.1RL Press, Oxford)。具體而言，在96孔培養(yǎng)板(Corning)中添加純化的重組hTROP-2蛋白(0.1 μ g/mL)，將抗原固定化(室溫、I小時，或4°C、一晚)。然后，用PBS洗滌3次，加入2%脫脂乳(PBS溶液)進行封閉(室溫，I小時)。用PBS洗滌2次后，在上述ELISA板中添加預先混合抗原溶液(純化hTROP-2蛋白;50，25，12.5,6.25，3.125nM)和抗hTROP-2單克隆抗體的各克隆(0.5nM)并用其平衡化的抗原-抗體復合物，并使之反應(yīng)(室溫，I小時)。用PBS洗滌3次后，使之與用封閉液稀釋的HRP標記抗小鼠IgG (最終濃度I μ g/mL) (GE HealthcareBiosciences)反應(yīng)(室溫，I小時)。接下來用0.l%Tween20_PBS溶液洗滌3次后，添加TMB(3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺:SIGMA)底物溶液，進行顯色反應(yīng)，加入IM硫酸使反應(yīng)停止。使用酶標儀Model550 (BIO RAD)測定吸光度。解離常數(shù)(Kd)的計算式如下所示?；谫|(zhì)量作用定律,抗原抗體反應(yīng)如下表示。
權(quán)利要求
1.一種在體內(nèi)具有抗腫瘤活性的抗人TR0P-2的抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其以5 20mg/kg體重的投與量顯示50%以上的腫瘤生長抑制活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗體，用于顯示所述腫瘤生長抑制活性的投與次數(shù)最多為每周I次。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其以10mg/kg體重的單次投與顯示50%以上的腫瘤生長抑制活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4中任意一項所述的抗體，其對2種以上的人腫瘤細胞株具有抗腫瘤活性。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 5中任意一項所述的抗體，其解離常數(shù)(Kd值)為1.0X ΙΟ,Μ以下。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 6中任意一項所述的抗體，抗體為單克隆抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 7中任意一項所述的抗體，腫瘤為選自人胰癌、人前列腺癌、人大腸癌及人乳腺癌組成的組中的至少I種。
9.根據(jù)權(quán)利要求1 7中任意一項所述的抗體，腫瘤為人胰癌。
10.根據(jù)權(quán)利要求1 9中任意一項所述的抗體，腫瘤為復發(fā)癌或轉(zhuǎn)移癌。
11.根據(jù)權(quán)利要求5 10中任意一項所述的抗體，腫瘤細胞株為選自人胰癌細胞株ΡΚ-59、人胰癌細胞株BxP C-3、人胰癌細胞株KP-3L、人胰癌細胞株KP-2、人胰癌細胞株P(guān)K-1、人胰癌細胞株P(guān)K-45H、人胰癌細胞株P(guān)K-45P、人胰癌細胞株TCC-PAN2、人胰癌細胞株SWT-2、人大腸癌細胞株CAC0-2、人大腸癌細胞株SW480、人大腸癌細胞株DLD-1、人大腸癌細胞株HCTl 16、人乳腺癌細胞株JIMT-1、人乳腺癌細胞株HCCl 143、人乳腺癌細胞株MCF-7、人前列腺癌細胞株DU145及人前列腺癌細胞株P(guān)C-3組成的組中的至少2種。
12.根據(jù)權(quán)利要求5 10中任意一項所述的抗體，腫瘤細胞株為人胰癌細胞株P(guān)K-59及人胰癌細胞株BxPC-3。
13.根據(jù)權(quán)利要求1 12中任意一項所述的抗體，抗體的H鏈V區(qū)域的⑶Rl 3的氨基酸序列分別依次為序列號36 38所示的氨基酸序列、和/或抗體的L鏈V區(qū)域的CDRl 3的氨基酸序列分別依次為序列號41 43所示的氨基酸序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求1 12中任意一項所述的抗體，抗體的H鏈V區(qū)域的⑶Rl 3的氨基酸序列分別依次為序列號46 48所示的氨基酸序列、和/或抗體的L鏈V區(qū)域的CDRl 3的氨基酸序列分別依次為序列號51 53所示的氨基酸序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求1 12中任意一項所述的抗體，抗體的H鏈V區(qū)域的⑶Rl 3的氨基酸序列分別依次為序列號56 58所示的氨基酸序列、和/或抗體的L鏈V區(qū)域的CDRl 3的氨基酸序列分別依次為序列號61 63所示的氨基酸序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求1 12中任意一項所述的抗體，抗體的H鏈V區(qū)域的⑶Rl 3的氨基酸序列分別依次為序列號66 68所示的氨基酸序列、和/或抗體的L鏈V區(qū)域的CDRl 3的氨基酸序列分別依次為序列號71 73所示的氨基酸序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求1 16中任意一項所述的抗體，抗體為基因重組抗體。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的抗體，基因重組抗體為嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的抗體，嵌合抗體為如下抗體:H鏈V區(qū)域的氨基酸序列包含序列號35所示的氨基酸序列、和/或L鏈V區(qū)域的氨基酸序列包含序列號40所示的氨基酸序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的抗體，嵌合抗體為如下抗體:H鏈V區(qū)域的氨基酸序列包含序列號45所示的氨基酸序列、和/或L鏈V區(qū)域的氨基酸序列包含序列號50所示的氨基酸序列。
21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的抗體，嵌合抗體為如下抗體:H鏈V區(qū)域的氨基酸序列包含序列號55所示的氨基酸序列、和/或L鏈V區(qū)域的氨基酸序列包含序列號60所示的氨基酸序列。
22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的抗體，嵌合抗體為如下抗體:H鏈V區(qū)域的氨基酸序列包含序列號65所示的氨基酸序列、和/或L鏈V區(qū)域的氨基酸序列包含序列號70所示的氨基酸序列。
23.由保藏號為FERMBP-11251的雜交瘤產(chǎn)生的抗人TROP-2的單克隆抗體。
24.由保藏號為FERMBP-11252的雜交瘤產(chǎn)生的抗人TROP-2的單克隆抗體。
25.由保藏號為FERMBP-11253的雜交瘤產(chǎn)生的抗人TROP-2的單克隆抗體。
26.由保藏號為FERMBP-11346的雜交瘤產(chǎn)生的抗人TROP-2的單克隆抗體。
27.由保藏號為FERMBP-11254的雜交瘤產(chǎn)生的抗人TROP-2的單克隆抗體。
28.根據(jù)權(quán)利要求1 22中任意一項所述的抗體，其與由保藏號為FERMBP-11251、FERM BP-11252.FERM BP_11253、FERM BP-11346 或 FERM BP-11254 的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體所結(jié)合的位點結(jié)合。
29.根據(jù)權(quán)利要求1 22中任意一項所述的抗體，其與包含選自下列區(qū)域組成的組中的至少I種區(qū)域的部分結(jié)合，所述區(qū)域為:包含序列號2所示的人TROP-2的氨基酸序列中的第43位 第65位的氨基酸的區(qū)域、包含序列號2所示的人TROP-2的氨基酸序列中的第152位 第165位的氨基酸的區(qū)域、包含序列號2所示的人TROP-2的氨基酸序列中的第171位 第183位的氨基酸的區(qū)域、包含序列號2所示的人TROP-2的氨基酸序列中的第109位 第120位的氨基酸的區(qū)域、包含序列號2所示的人TROP-2的氨基酸序列中的第43位 第56位的氨基酸的區(qū)域、及包含序列號2所示的人TROP-2的氨基酸序列中的第193位 第206位的氨基酸的區(qū)域。
30.根據(jù)權(quán)利要求1 22中任意一項所述的抗體，其與含有包含序列號2所示的人TROP-2的氨基酸序列中的第43位 第65位的氨基酸的區(qū)域的部分結(jié)合。
31.根據(jù)權(quán)利要求1 22中任意一項所述的抗體，其與含有包含序列號2所示的人TROP-2的氨基酸序列中的第152位 第165位的氨基酸的區(qū)域的部分結(jié)合。
32.根據(jù)權(quán)利要求1 22中任意一項所述的抗體，其與含有包含序列號2所示的人TROP-2的氨基酸序列中的第171位 第183位的氨基酸的區(qū)域的部分結(jié)合。
33.根據(jù)權(quán)利要求1 22中任意一項所述的抗體，其與含有包含序列號2所示的人TROP-2的氨基酸序列中的第109位 第120位的氨基酸的區(qū)域的部分結(jié)合。
34.一種來自于權(quán)利要求1 33中任意一項所述的抗體的抗體片段。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的抗體片段，其為包含序列號36 38所示的氨基酸序列、和/或序列號41 43所示的氨基酸序列的片段。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的抗體片段，其為包含序列號35所示的氨基酸序列、和/或序列號40所示的氨基酸序列的片段。
37.根據(jù)權(quán)利要求34所述的抗體片段，其為包含序列號46 48所示的氨基酸序列、和/或序列號51 53所示的氨基酸序列的片段。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的抗體片段，其為包含序列號45所示的氨基酸序列、和/或序列號50所示的氨基酸序列的片段。
39.根據(jù)權(quán)利要求34所述的抗體片段，其為包含序列號56 58所示的氨基酸序列、和/或序列號61 63所示的氨基酸序列的片段。
40.根據(jù)權(quán)利要求38所述的抗體片段，其為包含序列號55所示的氨基酸序列、和/或序列號60所示的氨基酸序列的片段。
41.根據(jù)權(quán)利要求34所述的抗體片段，其為包含序列號66 68所示的氨基酸序列、和/或序列號71 73所示的氨基酸序列的片段。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的抗體片段，其為包含序列號65所示的氨基酸序列、和/或序列號70所示的氨基酸序列的片段。
43.一種產(chǎn)生權(quán)利要求1 22及28 33中任意一項所述的抗體的雜交瘤。
44.一種保藏號為FERM BP-11251的產(chǎn)生抗人TROP-2的單克隆抗體的雜交瘤。
45.一種保藏號為FERM BP-11252的產(chǎn)生抗人TROP-2的單克隆抗體的雜交瘤。
46.一種保藏號為FERM BP-11253的產(chǎn)生抗人TROP-2的單克隆抗體的雜交瘤。
47.一種保藏號為FERM BP-11346的產(chǎn)生抗人TROP-2的單克隆抗體的雜交瘤。
48.一種保藏號為FERM BP-11254的產(chǎn)生抗人TROP-2的單克隆抗體的雜交瘤。
49.一種抗體一藥劑復合物，其含有權(quán)利要求1 33中任意一項所述的抗體以及具有抗腫瘤活性和/或細胞殺傷活性的物質(zhì)。
50.一種抗體片段一藥劑復合物，其含有權(quán)利要求34 42中任意一項所述的抗體片段以及具有抗腫瘤活性和/或細胞殺傷活性的物質(zhì)。
51.根據(jù)權(quán)利要求49或50所述的復合物，腫瘤為選自人胰癌、人前列腺癌、人大腸癌及人乳腺癌組成的組中的至少I種。
52.根據(jù)權(quán)利要求49或50所述的復合物，腫瘤為人胰癌。
53.根據(jù)權(quán)利要求49 52中任意一項所述的復合物，腫瘤為復發(fā)癌或轉(zhuǎn)移癌。
54.—種藥物組合物，其含有選自權(quán)利要求1 33中任意一項所述的抗體、權(quán)利要求34 42中任意一項所述的抗體片段、及權(quán)利要求49 53中任意一項所述的復合物組成的組中的至少I種。
55.根據(jù)權(quán)利要求54所述的組合物，其用于腫瘤的治療。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的組合物，其沒有體重減少的副作用。
57.根據(jù)權(quán)利要求54所述的組合物，其用于腫瘤的診斷。
58.根據(jù)權(quán)利要求54 57中任意一項所述的組合物，腫瘤為選自人胰癌、人前列腺癌、人大腸癌及人乳腺癌組成的組中的至少I種。
59.根據(jù)權(quán)利要求55 58中任意一項所述的組合物，腫瘤為復發(fā)癌或轉(zhuǎn)移癌。
60.一種腫瘤治療劑，其含有選自權(quán)利要求1 33中任意一項所述的抗體、權(quán)利要求34 42中任意一項所述的抗體片段、及權(quán)利要求49 53中任意一項所述的復合物組成的組中的至少I種。
61.根據(jù)權(quán)利要求60所述的治療劑，其沒有體重減少的副作用。
62.根據(jù)權(quán)利要求60或61所述的治療劑，腫瘤為選自人胰癌、人前列腺癌、人大腸癌及人乳腺癌組成的組中的至少I種。
63.一種腫瘤診斷劑，其含有權(quán)利要求1 33中任意一項所述的抗體、權(quán)利要求34 42中任意一項所述的抗體片段、及權(quán)利要求49 53中任意一項所述的復合物組成的組中的至少I種。
64.根據(jù)權(quán)利要求63所述的診斷劑，腫瘤為選自人胰癌、人前列腺癌、人大腸癌及人乳腺癌組成的組中的至少I種。
65.—種腫瘤檢測方法,其特征在于,使選自權(quán)利要求1 33中任意一項所述的抗體、權(quán)利要求34 42中任意一項所述的抗體片段、及權(quán)利要求49 53中任意一項所述的復合物組成的組中的至少I種與由生物體采集的試樣反應(yīng)，檢測發(fā)生反應(yīng)的抗體和/或抗體片段的信號。
66.根據(jù)權(quán)利要求65所述的方法，腫瘤為選自人胰癌、人前列腺癌、人大腸癌及人乳腺癌組成的組中的至少I種。
67.一種腫瘤的治療用、診斷用或檢測用試劑盒，其含有選自權(quán)利要求1 33中任意一項所述的抗體、權(quán)利要求34 42中任意一項所述的抗體片段、及權(quán)利要求49 53中任意一項所述的復合物組成的組中的至少I種。
68.根據(jù)權(quán)利要求67所述的試劑盒，腫瘤為選自人胰癌、人前列腺癌、人大腸癌及人乳腺癌組成的組中的至 少I種。
全文摘要
本發(fā)明提供與hTROP-2特異性反應(yīng)且在體內(nèi)具有抗腫瘤活性的抗體、產(chǎn)生該抗體的雜交瘤、該抗體與藥劑的復合物、腫瘤的診斷用或治療用藥物組合物、腫瘤的檢測方法、腫瘤的檢測用或診斷用試劑盒。
文檔編號G01N33/574GK103228673SQ20118002429
公開日2013年7月31日 申請日期2011年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月17日
發(fā)明者中村康司, 岡村健太郎, 田村真紀, 柳內(nèi)浩之, 菅家徹 申請人:株式會社立富泰克