專利名稱：維生素d化合物的釋放制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于釋放與維生素D-結(jié)合蛋白結(jié)合的維生素D化合物的試劑組合物(reagent composition),用于檢測維生素D化合物的體外方法,其中通過使用該試劑組合物，使得所述維生素D化合物從維生素D-結(jié)合蛋白釋放，且還涉及以該方式獲得的試劑混合物。本發(fā)明還涉及所披露的用于釋放維生素D化合物的試劑組合物的用途以及用于檢測維生素D化合物的試劑盒，其含有除常見檢測試劑之外的用于釋放維生素D化合物的試劑組合物。
背景技術(shù)：
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維生素D的充分供給是極其重要的，如術(shù)語“維他命(vitamin) ”早已暗示的那樣。維生素D的缺乏導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病諸如佝僂病或者骨質(zhì)疏松。雖然在上個世紀(jì)的早期，維生素D仍然被看作一種單一物質(zhì)，但是在過去的幾十年內(nèi)，維生素D系統(tǒng)已經(jīng)變?yōu)橐环N維生素D代謝產(chǎn)物的復(fù)雜且多樣的網(wǎng)絡(luò)。如今，40種以上的不同的維生素D代謝產(chǎn)物是已知的(Zerwekh, J. E. , Ann. Clin. Biochem. 41 (2004) 272-281)。人類只能通過來自陽光的紫外線作用于皮膚上而產(chǎn)生D3維生素或者維生素D2(CalCiferols)。在血液中，維生素D3結(jié)合到所謂的維生素D-結(jié)合蛋白，并將其輸送到肝臟中，在此通過25-羥基化作用將其轉(zhuǎn)化為25-羥基維生素D3。除皮膚和肝臟之夕卜，許多其它組織目前已知涉及維生素D新陳代謝，而上述兩個器官早已在下述文獻中提及(Schmidt-Gayk, H. et al. (eds.), “Calcium regulating hormones, vitamin Dmetabolites and cyclic AMP^, SpringerVerlag, Heidelberg(1990)pp. 24-47) 25-輕基維生素D，更具體地說，25-羥基維生素D2和25-羥基維生素D3,就其數(shù)量而言，是人有機體中的重要存儲形式。當(dāng)需要時，這些前體可以在腎中轉(zhuǎn)化而形成生物活性的Ia，25_ 二羥基維生素D，所謂的D激素。生物活性的維生素D調(diào)節(jié)從腸的鈣攝取、骨礦化，并且影響許多其它代謝途徑諸如胰島素體系。測量維生素D水平本身是沒有多少益處的，當(dāng)測定患者的維生素D狀況時，因為取決于食物攝取或者暴露于陽光，維生素D (維生素D2和維生素D3)的濃度變化很大。另外，在循環(huán)(24小時)中維生素D具有較短的生物半衰期，因此出于這種原因也不是合適的測定患者的維生素D狀況的參數(shù)。同樣也適用于生理活性形式的維生素D (1，25- 二羥基維生素D)。相比于25-羥基維生素D而言，這些生物活性形式同樣以較小的且較大波動的濃度存在。由于全部這些原因，特別地，25-羥基維生素D的量化是一種合適的全面分析患者的總的維生素D狀況的手段。維生素D代謝產(chǎn)物如25-羥基維生素D以高親和性由維生素D-結(jié)合蛋白結(jié)合且也以受限的程度與白蛋白和一些脂蛋白結(jié)合。在正常情況下適于從維生素D-結(jié)合蛋白釋放維生素D代謝產(chǎn)物的方法相比于從任何其它蛋白釋放維生素D代謝產(chǎn)物而言將是非常適當(dāng)?shù)摹?5-羥基維生素D或者其它維生素D化合物對維生素D-結(jié)合蛋白的結(jié)合使得維生素D化合物的確定極大地復(fù)雜化。全部已知的方法要求待分析的維生素D化合物從其與維生素D-結(jié)合蛋白形成的復(fù)合物中釋放或者分離。在下文中，為了簡化的目的，這被稱為從維生素D-結(jié)合蛋白中釋放維生素D化合物，雖然當(dāng)然其只能從維生素D化合物和維生素D-結(jié)合蛋白的復(fù)合物中，而不是單獨地從維生素D-結(jié)合蛋白中被釋放。維生素D-結(jié)合蛋白在酸性pH條件下為未折疊的，但在pH重新變?yōu)橹行詶l件時，其具有正確重折疊且重新結(jié)合分析物的高趨勢。因此，通常需要首先釋放維生素D化合物，然后將所述維生素D-結(jié)合蛋白與待分析的維生素D化合物分離。由于2 5-羥基維生素D的高的臨床價值，許多方法從文獻中是已知的，這使得25-羥基維生素D可以或多或少被可靠地確定。 Haddad, J. G. et al.，J. Cl in. Endocrinol. Metab. 33 (1971) 992-995,和Eisman, J. A. et al. , Anal. Biochem. 80 (1977) 298-305 例如描述了使用高效液相色譜(HPLC)確定血液樣品中25-羥基維生素D的濃度。其它確定25-羥基維生素D的方法尤其是基于使用維生素D-結(jié)合蛋白，如牛奶中存在的那些。因此，Holick, M. F. and Ray, R. (US 5, 981, 779)以及 DeLuca et al. (EP O583 945)描述了用于羥基維生素D和二羥基維生素D的維生素D測定，其基于這些物質(zhì)結(jié)合到維生素D-結(jié)合蛋白，其中這些物質(zhì)的濃度是通過競爭性測試程序確定的。然而，這種方法的先決條件是待確定的維生素D代謝產(chǎn)物首先需要從原始的血液或者血清樣品中分離并且必需通過例如色譜進行純化。Armbruster, F. P. et al. (W0 99/67211)教導(dǎo)了為通過乙醇沉淀法進行維生素D確定，應(yīng)當(dāng)制備血清或者血漿樣品。在這種方法中，通過離心作用除去蛋白質(zhì)沉淀物，并且乙醇(ethanolic)上清液包含可溶維生素D代謝產(chǎn)物。這些可以在競爭性結(jié)合測定中進行測量?？蛇x擇地，EP O 753 743教導(dǎo)了使用高碘酸鹽，蛋白質(zhì)可以和血液或者血清樣品分離。在這種情況下，在獲自用高碘酸鹽處理的樣品的不含蛋白質(zhì)的上清液中確定維生素D化合物。在一些商業(yè)測試中，乙腈被推薦用于萃取血清或者血漿樣品(例如，在DiaSorin的放射免疫測定中或者在“Immundiagnostik”公司的維生素D測試中)。最近幾年中，許多不同的釋放試劑被提出，其原則上應(yīng)當(dāng)適于從樣品中存在的任何結(jié)合蛋白中釋放維生素D化合物。然而,這種釋放或者脫附(detachment)應(yīng)當(dāng)在相對溫和條件下進行，使得能夠在結(jié)合測試中直接使用用釋放試劑處理的樣品(參見例如WO02/57797和US 2004/0132104)。最近幾年中雖然進行了很多努力，但是用于確定維生素D的所有可得的方法具有缺點，諸如費力的樣品制備，差的標(biāo)準(zhǔn)化，測試程序間的差的一致性或者加料(spiked)維生素D的差的回收(就此特別參見Zerwekh, J. E.，見上文)。在US 7，087，395中，金屬氫氧化物和環(huán)糊精及其衍生物以及金屬水楊酸鹽已經(jīng)用于從維生素D-結(jié)合蛋白釋放維生素D化合物，這導(dǎo)致了維生素D-結(jié)合蛋白或者其它血清蛋白的不可逆的變性。表面活性劑如Triton X100或者Tween-20已經(jīng)用于防止維生素D化合物與變性后的樣品中的脂質(zhì)和蛋白進行非特異性結(jié)合。特別難以使維生素D化合物的測試自動化。自動化要求解決非常困難的問題，即鋼絲行走生存(surviving a tightrope walk):一方面,必需在合適的釋放試劑的幫助下從維生素D-結(jié)合蛋白中釋放維生素D化合物，另一方面，條件必需被選擇使得所述樣品可以直接進行進一步的分析。這種直接進一步的分析的先決條件是，一方面，內(nèi)源性維生素D-結(jié)合蛋白在這種分析期間沒有結(jié)合或者不再顯著地結(jié)合維生素D化合物并由此不妨礙這種分析，而另一方面，所用的釋放試劑沒有妨礙檢測試劑諸如抗體或維生素D-結(jié)合蛋白的結(jié)合。另外，眾所周知，維生素D-結(jié)合蛋白的不同的等位基因存在于人群中，其生物化學(xué)行為不同。維生素D化合物的釋放和測量應(yīng)當(dāng)對于各種等位基因/表型是可比較的。因此，本發(fā)明的目的是開發(fā)一種用于維生素D化合物且特別是用于羥基維生素D化合物從樣品中的維生素D-結(jié)合蛋白的釋放的試劑組合物，其可以至少部分地解決現(xiàn)有技術(shù)的問題。在下文中描述了并且由所附權(quán)利要求涵蓋了用于釋放維生素D化合物的合適的試劑組合物、用于確定維生素D化合物的體外方法、試劑組合物的用途和使用該試劑組合物的用于確定維生素D化合物的試劑盒
發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明涉及用于從維生素D-結(jié)合蛋白釋放維生素D化合物的體外方法，包括以下步驟a)提供待研究的樣品；以及b)使步驟(a)的樣品與以下物質(zhì)混合i)含有濃度為O. IM至2. OM的碳酸氫鹽或者能夠在水解后釋放碳酸氫根離子(HC03_)的物質(zhì)的試劑，ii)還原劑，和iii)堿化劑，由此從維生素D-結(jié)合蛋白釋放所述維生素D化合物。在另外的實施方案中，本發(fā)明涉及用于測量維生素D化合物的體外方法，包括以下步驟a)提供待研究的樣品；b)使步驟(a)的樣品與以下物質(zhì)混合i)含有濃度為O. IM至2. OM的碳酸氫鹽或者能夠在水解后釋放碳酸氫根離子(HCCV)的物質(zhì)的試劑， )還原齊U，和iii)堿化劑，由此從維生素D-結(jié)合蛋白釋放維生素D化合物；以及c)測量步驟(b)中釋放的維生素D化合物。在另外的實施方案中，本發(fā)明涉及用于從維生素D-結(jié)合蛋白釋放維生素D化合物的試劑組合物，包含濃度為O. IM至2. OM的碳酸氫鹽或者能夠在水解后釋放碳酸氫根離子(HCO3O的物質(zhì)，以及還原劑。在另外的實施方案中，本發(fā)明涉及試劑混合物，其包含待研究的樣品、用于從維生素D-結(jié)合蛋白釋放維生素D化合物的試劑組合物以及堿化劑，所述試劑組合物包含濃度為
O.IM至2. OM的碳酸氫鹽或者能夠在水解后釋放碳酸氫根離子(HC03_)的物質(zhì)，以及還原劑。在另外的實施方案中，本發(fā)明涉及用于從維生素D-結(jié)合蛋白釋放維生素D化合物的試劑盒，其含有包含濃度為O. IM至2. OM的碳酸氫鹽或者能夠在水解后釋放碳酸氫根離子(HC03_)的物質(zhì)以及還原劑的試劑組合物。
具體實施例方式本發(fā)明涉及用于從維生素D-結(jié)合蛋白釋放維生素D化合物的體外方法，包括以下步驟a)提供待研究的樣品；b)使步驟(a)的樣品與以下物質(zhì)混合i)含有濃度為O. IM至2. OM的碳酸氫鹽或者能夠在水解后釋放碳酸氫根離子(HC03_)的物質(zhì)的試劑， )還原劑，和iii)堿化劑，由此從維生素D-結(jié)合蛋白釋放所述維生素D化合物。如本申請所使用，以下各術(shù)語具有與其在該部分相關(guān)的含義。本申請使用的冠詞〃 一個〃和〃 一種〃是指一個或者多于一個(即至少一個)的合乎語法的物品對象(grammatical object of the article)。
表述“一個或者多個”是指I至50，優(yōu)選I至20，也優(yōu)選2、3、4、5、6、7、8、9、10、12
或者15。如果沒有另外敘述，術(shù)語“維生素D化合物”將被理解為包括包含根據(jù)以下結(jié)構(gòu)式I和II的維生素D2的主鏈或維生素D3的主鏈的所有化合物。式I
權(quán)利要求
1.用于從維生素D-結(jié)合蛋白釋放維生素D化合物的體外方法，包括以下步驟 a)提供待研究的樣品以及 b)使步驟(a)的樣品與以下物質(zhì)混合 i)含有濃度為O.IM至2. OM的碳酸氫鹽或者能夠在水解后釋放碳酸氫根離子(HC03_)的物質(zhì)的試劑， ii)還原劑，和 iii)堿化劑， 由此從維生素D-結(jié)合蛋白釋放所述維生素D化合物。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述步驟(i)的試劑在用于從維生素D-結(jié)合蛋白釋放維生素D化合物的適當(dāng)條件下在水溶液中為可溶的。
3.權(quán)利要求I至2中任一項的方法，其中所述步驟(i)的試劑含有濃度為O.IM至2. OM的碳酸氫鹽。
4.權(quán)利要求I至2中任一項的方法，其中所述步驟(i)的試劑含有濃度為O.IM至2. OM的能夠在水解后釋放碳酸氫根離子(HCO3-)的物質(zhì)。
5.權(quán)利要求1、2和4中任一項的方法，其中能夠在水解后釋放碳酸氫根離子(HCCV)的所述物質(zhì)為環(huán)狀或者非環(huán)狀的碳酸酯或者其各自的羥基化或者鹵化衍生物。
6.權(quán)利要求I至5中任一項的方法，其中所述樣品為液體樣品。
7.權(quán)利要求I至5中任一項的方法，其中所述樣品為血液、血清或者血漿。
8.用于測量維生素D化合物的體外方法，包括以下步驟 a)根據(jù)權(quán)利要求I至7中任一項的方法從維生素D-結(jié)合蛋白釋放維生素D化合物，以及 b)測量步驟(a)中釋放的維生素D化合物。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述維生素D化合物選自25-羥基維生素D2、25-羥基維生素D3、24，25- 二羥基維生素D2、24，25- 二羥基維生素D3和C3-表-25-羥基維生素D。
10.權(quán)利要求9的方法，其中確定了所述維生素D化合物為25-羥基維生素D2和/或者25-羥基維生素D3。
11.用于從維生素D-結(jié)合蛋白釋放維生素D化合物的試劑組合物，包含選自以下的物質(zhì)濃度為O. IM至2. OM的碳酸氫鹽或者能夠在水解后釋放碳酸氫根離子(HC03_)的物質(zhì)，以及還原劑。
12.權(quán)利要求11的試劑組合物，其特征在于所述還原劑選自2-巰基乙醇、2-巰基乙胺-HC1、TCEP、半胱氨酸-HC1、二硫蘇糖醇(DTT)、N-甲基馬來酰亞胺、Ellman試劑和1，2- 二硫雜環(huán)戊烷-3-羧酸。
13.權(quán)利要求11的試劑組合物，其特征在于所述還原劑選自2-巰基乙醇、2-巰基乙胺-HCl、TCEP、半胱氨酸-HCl和二硫蘇糖醇(DTT)。
14.權(quán)利要求11至13中任一項的試劑組合物，其特征在于所述還原劑具有2mM至30mM的濃度。
15.試劑混合物，包含待研究的樣品、權(quán)利要求11至14中任一項的試劑組合物以及堿化劑。
16.權(quán)利要求15的試劑混合物，其特征在于所述堿化劑選自NaOH、KOH、Ca(OH)2和LiOH。
17.權(quán)利要求11至14中任一項的試劑組合物以及堿化劑在將維生素D化合物從維生素D-結(jié)合蛋白釋放中的用途。
18.用于從維生素D-結(jié)合蛋白釋放維生素D化合物的試劑盒，其含有權(quán)利要求11至14中任一項的試劑組合物。
19.用于檢測從維生素D-結(jié)合蛋白釋放的維生素D化合物的試劑盒，其含有權(quán)利要求11至14中任一項的試劑組合物以及堿化劑。·
全文摘要
本發(fā)明涉及用于釋放與維生素D-結(jié)合蛋白結(jié)合的維生素D化合物的試劑組合物，用于檢測維生素D化合物的體外方法，其中通過使用該試劑組合物，使得所述維生素D化合物從維生素D-結(jié)合蛋白釋放，且還涉及以該方式獲得的試劑混合物。所使用的試劑含有濃度為0.1M至2.0M的碳酸氫鹽或者能夠在水解后釋放碳酸氫根離子(HCO3-)的物質(zhì)。本發(fā)明還涉及所披露的用于釋放維生素D化合物的試劑組合物的用途以及用于檢測維生素D化合物的試劑盒，其含有常見檢測試劑之外的用于釋放除維生素D化合物的試劑組合物。
文檔編號G01N33/82GK102906570SQ201180024919
公開日2013年1月30日 申請日期2011年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月20日
發(fā)明者S.安東尼, C.沃格爾 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司