專利名稱：western印跡分析技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本專利申請(qǐng)涉及進(jìn)行western印跡分析(blot analytical)技術(shù)的改良的方法。
背景技術(shù)：
Western印跡法是勞動(dòng)密集型實(shí)驗(yàn)室分析方法，其廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)中以確定在復(fù)雜樣品中是否存在靶蛋白質(zhì)并且以確定靶蛋白質(zhì)的相對(duì)量。所使用的術(shù)語(yǔ)“靶蛋白質(zhì)”是指分析方法的使用者期望在復(fù)雜樣品內(nèi)辨識(shí)的蛋白質(zhì)。使用蛋白質(zhì)的相對(duì)數(shù)量來(lái)測(cè)量蛋白質(zhì)表達(dá)中的變化(即.上調(diào)和下調(diào))。通過(guò)結(jié)合下述兩個(gè)變量來(lái)實(shí)現(xiàn)確定是否存在特定蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的分子量及其免疫特性(假定蛋白質(zhì)的這兩個(gè)極為不同的方面不可能偶然共存)。通過(guò)下述方式來(lái)實(shí)現(xiàn)確定特定蛋白質(zhì)的相對(duì)數(shù)量將復(fù)雜樣品中的靶蛋白質(zhì)與總蛋白質(zhì)元素或常見(jiàn)的“持家(housekeeping)”蛋白質(zhì)的數(shù)量比較。所用術(shù)語(yǔ)“持家”蛋白質(zhì)是指涉及細(xì)胞基本功能的常見(jiàn)蛋白質(zhì)，例如，肌動(dòng)蛋白或微管蛋白。在western印跡分析中量化總蛋白質(zhì)或“持家”蛋白質(zhì)的第二功能是它們可被用作為加載對(duì)照?？墒褂每偟鞍踪|(zhì)或‘‘持家”蛋白質(zhì)存在的數(shù)量來(lái)辨識(shí)通道(lane)加載中和樣品制備中的不準(zhǔn)確性。然后，使用這些差異來(lái)歸一化靶蛋白質(zhì)數(shù)值，從而把這些不準(zhǔn)確性考慮進(jìn)去。標(biāo)準(zhǔn)western印跡方法使用電泳(如，十二燒基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，SDS-PAGE)分離復(fù)雜樣品中的蛋白質(zhì)，然后，將分離的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到固體膜(通常，由硝化纖維或聚偏ニ氟こ烯制成，PVDF)使得蛋白質(zhì)保持同樣的分離模式。然后，將此膜在稀釋的蛋白質(zhì)溶液(如，脫脂奶粉或牛血清白蛋白(BSA))中培育，以阻斷非特異性鍵合部位，然后使用ー級(jí)抗體(即，特別用于靶蛋白質(zhì))培育，使用允許用于靶蛋白質(zhì)檢測(cè)的ニ級(jí)抗體洗和培育。這稱作免疫檢測(cè)。一旦用戶已經(jīng)確定所述樣品中是否存在靶蛋白質(zhì)，就將第一和第ニ抗體就從所述膜剝離，并且所述膜使用替代第一抗體(特別用于可用作為加載対照的另ー個(gè)蛋白質(zhì))來(lái)培育，使用允許用于加載對(duì)照的檢測(cè)的第二抗體來(lái)洗和培育。通常，整個(gè)方法完成需5至8小時(shí)，盡管ー些使用者喜歡將整個(gè)方法中的一些步驟過(guò)夜運(yùn)行。關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)western印跡方法的問(wèn)題包括下述事實(shí)通常，電泳之后分離的蛋白質(zhì)樣品不可見(jiàn)，因此使用者不能容易地分析蛋白質(zhì)分離的結(jié)果?？稍诜蛛x之后將分離的蛋白質(zhì)樣品染色以使得使用者可完全可見(jiàn)分離的蛋白質(zhì)，然而，這種方法工作強(qiáng)度大并且耗時(shí)。一種用于蛋白質(zhì)后分離(post separation)但在免疫檢測(cè)之前的檢測(cè)的常用方法是將分離介質(zhì)暴露于Ponceau S染色劑。此方法需要在致使蛋白質(zhì)可見(jiàn)之前勞動(dòng)密集型的染色和脫色步驟。使用此技術(shù)顯示的蛋白質(zhì)通常是不明顯的和缺乏捕獲數(shù)字圖像所需的對(duì)照。另外，免疫檢測(cè)的當(dāng)前方法通常使用化學(xué)發(fā)光和照相膠片，來(lái)自Poceau S染色的總蛋白質(zhì)的圖像將不直接與靶蛋白質(zhì)的圖像比較。通常所用的另ー種方法是使用兩個(gè)恒定的電泳蛋白質(zhì)分離物來(lái)比較蛋白質(zhì)總量與靶蛋白質(zhì)的總量。將ー種分離介質(zhì)染色以用于總蛋白質(zhì)的檢測(cè)而另一種介質(zhì)被轉(zhuǎn)移到用于靶蛋白質(zhì)的免疫檢測(cè)的固體膜。此方法在多種情況下(特別是貴重樣品或僅小體積樣品) 不具吸引力。另外，正象多數(shù)人那樣將樣品加載到電泳設(shè)備，在不同電泳分離物之間人工比較蛋白質(zhì)元素，由于不正確加載樣品導(dǎo)致結(jié)果的不正確判讀。這表明，確定蛋白質(zhì)表達(dá)所需要的附加處理步驟導(dǎo)致以試劑和時(shí)間的形式的附加成本。此外，如果使用標(biāo)準(zhǔn)western印跡方法，使用者不能容易地比較在免疫檢測(cè)前和后從同一分離的蛋白質(zhì)樣品得到的結(jié)果。關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)western印跡方法的另ー個(gè)問(wèn)題是其包括多個(gè)步驟,所述多個(gè)步驟涉及若干不同設(shè)備，從而妨礙形成一體化，所述多個(gè)步驟還包括単獨(dú)的設(shè)備，需要用它來(lái)對(duì)已經(jīng)被探測(cè)到之后的最終樣品成像。另外，這些多個(gè)步驟的多數(shù)包括濕化學(xué)，所述濕化學(xué)可導(dǎo)致重現(xiàn)性降低。例如，最廣泛地使用檢測(cè)靶蛋白質(zhì)的方法為通過(guò)化學(xué)發(fā)光，并包括將照相膠片暴露于western印跡。為了定位與印跡接觸的照相膠片，使用照相膠片需要將印跡轉(zhuǎn)移到暗室，通常是遠(yuǎn)離實(shí)驗(yàn)室的ー些地方。通常，需要顯影暴露的膠片的照相膠片處理部件是昂貴的并且難于維護(hù)保養(yǎng)。使用照相膠片的另ー個(gè)問(wèn)題是獲得適用于定量分析的靶蛋白質(zhì)的不飽和圖像需要耗時(shí)的反復(fù)試驗(yàn)并會(huì)出錯(cuò)?？偟膩?lái)說(shuō)，標(biāo)準(zhǔn)western印跡方法為勞動(dòng)密集型的、耗時(shí)的并且使用大量試劑。

發(fā)明內(nèi)容
從而,需要非常迅速的和高效的western印跡分析技術(shù)。本發(fā)明的實(shí)施例提供了進(jìn)行western印跡分析技術(shù)的改良的方法，所述改良的方法通過(guò)提供快速的、高效的和方便的替代形式克服了多個(gè)上述問(wèn)題。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了進(jìn)行western印跡分析技術(shù)的方法，其中，所述方法包括依次執(zhí)行下述步驟a).預(yù)染色樣品中的蛋白質(zhì)；b).使用凝膠電泳分離蛋白質(zhì)；c).分析所分離的蛋白質(zhì)以確定總蛋白質(zhì)含量和/或至少ー個(gè)持家蛋白質(zhì)含量；d).將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到至少ー個(gè)膜上；e).探測(cè)分離的蛋白質(zhì)以檢測(cè)靶蛋白質(zhì)；并且f).分析所探測(cè)的蛋白質(zhì)以確定靶蛋白質(zhì)的分子量和/或靶蛋白質(zhì)的含量。在另ー個(gè)實(shí)施例中，提供了一種設(shè)備，其被配置用于執(zhí)行具有上述特征的方法。本發(fā)明已經(jīng)開(kāi)發(fā)出克服了至少部分下述缺點(diǎn)的系統(tǒng)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)western印跡的科學(xué)家通過(guò)觀察來(lái)比較實(shí)驗(yàn)內(nèi)的樣品和其它實(shí)驗(yàn)的樣品，例如，比較靶蛋白質(zhì)表達(dá)的濃度。通常，由眼睛來(lái)完成，以確定靶蛋白質(zhì)是否比另ー個(gè)更明亮。此方法在加載和初始樣品制備中很容易出現(xiàn)錯(cuò)誤。更嚴(yán)格地講，并且通常需要公開(kāi)的結(jié)果，需要比較靶蛋白質(zhì)和加載對(duì)照蛋白質(zhì)的亮度。為了進(jìn)行比較，膜需要進(jìn)行剝離和重新探查以加載對(duì)照蛋白質(zhì)，這會(huì)増加實(shí)驗(yàn)的時(shí)間并且進(jìn)ー步增加實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性。
與此種傳統(tǒng)的方法相比，本發(fā)明的示例性實(shí)施例具有樣品中的所有蛋白質(zhì)被預(yù)染色(步驟a)這樣的優(yōu)點(diǎn)。這使得該設(shè)備能夠在電泳(步驟b和c)之后測(cè)量總蛋白質(zhì)含量或加載對(duì)照蛋白質(zhì)的量。一旦已經(jīng)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜并且執(zhí)行western印跡(步驟d和e)，膜就可使用相同措施重新分析以確定相對(duì)于總含量或加載對(duì)照(在步驟c中測(cè)量)的靶蛋白質(zhì)的分子量和/或含量(步驟f)。本發(fā)明的方法具有顯著的優(yōu)點(diǎn)，即其不需要膜的剝離和重新探測(cè)以測(cè)量加載對(duì)照并且由于以相同的措施使用校準(zhǔn)特征圖像來(lái)進(jìn)行分析，可直接比較·電泳后和western印跡后的校準(zhǔn)特征圖像。通過(guò)使用本發(fā)明的這種實(shí)施例，科學(xué)家還可分析轉(zhuǎn)移后的膜并且使用轉(zhuǎn)移的結(jié)果作為質(zhì)量控制步驟以確保良好的轉(zhuǎn)移并作為加載對(duì)照。在標(biāo)準(zhǔn)的方法中，科學(xué)家將必然使用轉(zhuǎn)移后的Ponceau S染色作為QC測(cè)試并且隨后在探測(cè)前脫色。由于Ponceau S成像困難并且western印跡之后成像的不同方法，Ponceau S圖像不易于與western印跡之后的圖像比較。實(shí)施例的另外的優(yōu)點(diǎn)為其不需要運(yùn)行具體的western印跡分子量標(biāo)準(zhǔn)。由于電泳之后的原始圖像與western印跡膜的校準(zhǔn)，來(lái)自電泳的分子量標(biāo)準(zhǔn)提供了用于分子量的校準(zhǔn)。本發(fā)明的實(shí)施例的方法允許使用者在探測(cè)分離的蛋白質(zhì)中投入時(shí)間和精力之前檢查是否已經(jīng)成功地完成步驟b)和d)。另外，使用分離的蛋白質(zhì)的分析結(jié)果來(lái)確定總蛋白質(zhì)否定了在步驟e)之后所需要的加載對(duì)照的再探測(cè)。然后，使用此方法產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可用于執(zhí)行在整個(gè)不同通道和不同樣品中的靶蛋白質(zhì)的半定量分析。然后，可將總蛋白質(zhì)加載和/或持家蛋白質(zhì)含量與靶蛋白質(zhì)含量比較以獲得總蛋白質(zhì)和/或持家蛋白質(zhì)與靶蛋白質(zhì)的比率?？偟鞍踪|(zhì)含量和/或持家蛋白質(zhì)含量還可用作加載對(duì)照。這允許用于靶蛋白質(zhì)濃度的精確的通道對(duì)通道的比較。計(jì)算總蛋白質(zhì)或持家蛋白質(zhì)相對(duì)靶蛋白質(zhì)的比率的優(yōu)選的實(shí)施例使用適當(dāng)?shù)某上裣到y(tǒng)，所述成像系統(tǒng)能夠檢測(cè)和記錄熒光，所述熒光由熒光基團(tuán)在特定波長(zhǎng)處激發(fā)來(lái)產(chǎn)生，例如LAB901磁帶機(jī)。數(shù)據(jù)產(chǎn)生強(qiáng)度對(duì)沿著電泳凝膠的距離的圖?？偟鞍踪|(zhì)曲線下的面積，或者就持家蛋白質(zhì)或靶蛋白質(zhì)而言，單峰下的面積，被認(rèn)為是“含量”。然后，可計(jì)算總蛋白質(zhì)或持家蛋白質(zhì)相對(duì)靶蛋白質(zhì)含量的比率。在另ー個(gè)實(shí)施例中，可使用毛細(xì)管電泳而不是凝膠電泳以分離樣品中蛋白質(zhì)的混合物。在這種情況下，當(dāng)測(cè)量熒光的強(qiáng)度吋，時(shí)間軸線取代距離軸線，熒光的強(qiáng)度將在生物分子轉(zhuǎn)移通過(guò)毛細(xì)管時(shí)的固定點(diǎn)處被測(cè)量。因此，相對(duì)時(shí)間繪制強(qiáng)度，在蛋白質(zhì)分離開(kāi)始后的固定點(diǎn)處檢測(cè)所述熒光。可使用若干方法以確定樣品中存在的靶蛋白質(zhì)的濃度。一種這樣的方法是使用蛋白質(zhì)的已知濃度來(lái)產(chǎn)生校準(zhǔn)曲線。例如，可在western印跡分析化驗(yàn)時(shí)使用已知的濃度的蛋白質(zhì)并且使用此分析的含量數(shù)值以建立校準(zhǔn)曲線。然后，根據(jù)此校準(zhǔn)曲線讀取來(lái)自western印跡分析的靶蛋白質(zhì)含量以產(chǎn)生給定樣品內(nèi)的靶蛋白質(zhì)的濃度。優(yōu)選地，用于產(chǎn)生校準(zhǔn)曲線的蛋白質(zhì)為靶蛋白質(zhì)的已知濃度，然而，在多種情況下是不可能的并且會(huì)同樣地使用不同的蛋白質(zhì)來(lái)得到此校準(zhǔn)曲線。例如，通常使用牛血清白蛋白(BSA)和牛血清丙種球蛋白(BGG)以得到蛋白質(zhì)定量分析中的校準(zhǔn)曲線?？山柚谶m當(dāng)?shù)能浖统绦蚩刂朴?jì)算機(jī)來(lái)執(zhí)行靶蛋白質(zhì)含量的計(jì)算?？赏ㄟ^(guò)使用蛋白質(zhì)樣品的稀釋液系列來(lái)提高此計(jì)算的精確性。另ー個(gè)方法可涉及比較靶蛋白質(zhì)含量和通道內(nèi)標(biāo)記物中的已知含量。
可測(cè)量總蛋白質(zhì)含量和至少ー個(gè)持家蛋白質(zhì)含量?jī)烧咭杂米骷虞d對(duì)照。兩個(gè)加載對(duì)照計(jì)算的內(nèi)含物可提高校準(zhǔn)(用于靶蛋白質(zhì)的測(cè)量)的總精確度?？墒褂枚喾N化合物以預(yù)染色蛋白質(zhì)，所述多種化合物包括熒光基團(tuán)，例如可從Active Motif 獲得的基于染料的 pyrillium、可從 Molecular Probes 獲得的 Alexa Flu 或染料、可從Thermo Fisher Scientific獲得的Dylight染料、可從Atto Tec獲得的Atto染料以及可從GE Healthcarethe獲得的Cy染料?？墒褂脝蝹€(gè)熒光基團(tuán)或ー種以上熒光基團(tuán)預(yù)染色蛋白質(zhì)。凝膠電泳完成時(shí)，分離的蛋白質(zhì)位于凝膠的基質(zhì)內(nèi)。用于凝膠電泳中的凝膠可在使用時(shí)通過(guò)注入模具來(lái)制成，這就允許在使用后容易取得凝膠內(nèi)的分離的組分。然而，預(yù)包裝的凝膠(其中將凝膠包裝到容器內(nèi))，例如Lab90l ScreenTape 范圍已變得更普及地用于凝膠電泳中，特別用于蛋白質(zhì)分離。因?yàn)轭A(yù)包裝的凝膠使用更方便，以及提供更好的可重現(xiàn)性結(jié)果并且使用和處理更安全。因此，當(dāng)在凝膠電泳中使用預(yù)包裝凝膠作為在下游分析技術(shù)之前的上游制備技術(shù)時(shí)，需要分離的組分可被獲取并且可從預(yù)包裝凝膠內(nèi)提取。因此，本發(fā)明的實(shí)施例的方法可包括在凝膠電泳之后而不是在分析和/或探測(cè)分離的蛋白質(zhì)之前獲取容器內(nèi)的凝膠的附加步驟。另外，可使用程序控制計(jì)算機(jī)以控制凝膠電泳期間使用的電壓和時(shí)間。通常，使用凝膠電泳分離蛋白質(zhì)的步驟將允許蛋白質(zhì)的ー維分離，然而，蛋白質(zhì)的ニ維分離也可以。一維分離可根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量用于分離蛋白質(zhì)，而ニ維分離可根據(jù)它們的重量和它們的等電點(diǎn)來(lái)分離蛋白質(zhì)。通常，分析分離的蛋白質(zhì)以確定總蛋白質(zhì)含量包括捕獲凝膠內(nèi)預(yù)染色的分離蛋白質(zhì)的圖像。通常，將分離的蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到至少ー個(gè)膜以有助于探測(cè)分離的蛋白質(zhì)。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)移過(guò)程包括將單個(gè)大量的電泳凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到單個(gè)薄膜上。如果需要獨(dú)立地探測(cè)蛋白質(zhì)樣品，那么將膜切成含有蛋白質(zhì)樣品的單個(gè)部分。盡管此方法適用于本發(fā)明的實(shí)施例，但此方法為耗時(shí)的并且為獨(dú)立地探測(cè)多個(gè)樣品的不精確的方法。將使用一種更有利的方法，Lab90l’ sScreenTape 技術(shù)，所述技術(shù)提供了同時(shí)將16蛋白質(zhì)分離物傳輸?shù)?6單獨(dú)的預(yù)包裝凝膠上(如W006/085071所述)。如果使用預(yù)包裝凝膠以分離蛋白質(zhì)樣品，那么然后可使用ー些形式的凝膠提取措施以確保通過(guò)相對(duì)容器轉(zhuǎn)移凝膠來(lái)從容器提取分子分離凝膠。從容器提取凝膠的方法式可包括吸出、吹出、推擠、拉出或清洗出凝膠。然而，最優(yōu)選的推擠措施是通過(guò)推擠凝膠來(lái)相對(duì)于容器移動(dòng)凝膠。推擠凝膠可使用施用于容器的至少ー個(gè)凝膠推擠元件來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如，多個(gè)凝膠推擠元件可施用于容器內(nèi)的多個(gè)子容器。多個(gè)凝膠推擠元件可形成梳狀物并且可將所述推擠元件引導(dǎo)至特定區(qū)域。優(yōu)選地，往復(fù)于凝膠表面的各凝膠推擠元件的部件基本上符合推擠元件和凝膠之間的界面的形狀和尺寸。這有助于從容器轉(zhuǎn)移全部凝膠，同時(shí)保持凝膠的縱橫比。然而，所述凝膠推擠元件是彈性可變形的以允許所述子容器的內(nèi)部的形狀和尺寸以及所述凝膠推擠元件與所述容器的對(duì)準(zhǔn)等方面的小變化。ー種提供弾性可變形的凝膠推擠元件的措施為將各凝膠推擠元件的末端分流到通過(guò)狹縫分離的單獨(dú)的裂片中。另ー種提供弾性可變形的凝膠推擠元件的措施可涉及使用弾性體的涂層或推擠元件尖端處的蠟。
本發(fā)明的實(shí)施例還可包括物理處理凝膠容器的步驟以有助于提取凝膠。例如，旋轉(zhuǎn)容器、輕輕地施加壓カ或按壓容器以最小化凝膠和容器表面之間的表面張力。此物理處理可通過(guò)機(jī)械處理用手來(lái)完成。步驟d的轉(zhuǎn)移過(guò)程使用電場(chǎng)以將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至至少ー個(gè)膜。確保將蛋白質(zhì)從凝膠完全轉(zhuǎn)移到膜是western印跡成功的關(guān)鍵。因此，可使用程序控制計(jì)算機(jī)以控制在將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到至少ー個(gè)膜上期間使用的電壓和時(shí)間。轉(zhuǎn)移分離的蛋白質(zhì)可允許使用者將大量的分離的蛋白質(zhì)的樣品分成較小的分離的蛋白質(zhì)的子樣品，其允許將不同的探針用到各子樣品上。作為另外一種選擇，可將不同濃度處的單個(gè)探針用到各子樣品上以優(yōu)化探測(cè)方案。在另ー個(gè)實(shí)施例中，可轉(zhuǎn)移多個(gè)分離的蛋白質(zhì)的樣品以允許使用者同時(shí)探測(cè)多個(gè)分離的蛋白質(zhì)的樣品。可將多個(gè)膜用于多個(gè)子樣品或多個(gè)分離的蛋白質(zhì)的樣品。作為另外一種選擇，可將單個(gè)膜用于多個(gè)樣品或多個(gè)子樣品。使用分離成為部分的單個(gè)膜允許使用較小體積的探測(cè)溶液，進(jìn)ー步優(yōu)化分離的蛋白質(zhì)的探測(cè)。在實(shí)施例中，其中使用Lab901’s ScreenTape技術(shù)執(zhí)行蛋白質(zhì)分離直到可將分離的蛋白質(zhì)的16個(gè)樣品轉(zhuǎn)移到分離成個(gè)16部分的單個(gè)膜。用于本發(fā)明方法的合適的膜包括由PVDF或硝化纖維組成的那些膜。優(yōu)選地，膜為親水性的或已經(jīng)被處理為親水性的，由此可改善分離的蛋白質(zhì)和膜的表面的接觸。在另ー個(gè)實(shí)施例中，使用優(yōu)化的條件來(lái)執(zhí)行膜的轉(zhuǎn)移以防止較小的蛋白質(zhì)比較大的蛋白質(zhì)更快地遷移透過(guò)膜。這種現(xiàn)象稱為“滲漏”。滲漏導(dǎo)致接觸電極的表面與接觸凝膠表面之間的蛋白質(zhì)分布差異。針對(duì)此問(wèn)題，本文描述的方法可包括進(jìn)行轉(zhuǎn)移到優(yōu)化的緩沖液中以防止?jié)B漏的附加步驟。緩沖液的優(yōu)化可包括改變轉(zhuǎn)移緩沖液的pH、緩沖液的類型、使用不連續(xù)緩沖液，即，正極和負(fù)極印跡紙中不同的緩沖液以及膜中的再次不同，或通過(guò)每厘米地改變整個(gè)凝膠上的電壓。針對(duì)整個(gè)凝膠，每厘米地改變跨越凝膠的電壓以在凝膠的底部處提供較弱的強(qiáng)效電場(chǎng)，其中較小的蛋白質(zhì)在電泳之后轉(zhuǎn)移到此，并且在凝膠的頂部處提供更強(qiáng)效的電場(chǎng)，其中較大的蛋白質(zhì)在電泳之后轉(zhuǎn)移到此。在另ー個(gè)實(shí)施例中，在處理中使用的印跡紙具有某些特性和光滑度。確保蛋白質(zhì)有效地轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素是確保印跡紙和膜之間有效地接觸。不良接觸可導(dǎo)致妨礙有效分析蛋白質(zhì)的最終圖像的不均勻轉(zhuǎn)移并出現(xiàn)“斑點(diǎn)”。如此前狀態(tài)，傳統(tǒng)的western印跡方法將蛋白質(zhì)從單個(gè)電泳凝膠轉(zhuǎn)移到單個(gè)膜。如果需要獨(dú)立地探測(cè)轉(zhuǎn)移到膜的蛋白質(zhì)樣品，那么膜必須切成單個(gè)部分。如上所述，在實(shí)施例中，其中使用預(yù)包裝Lab90l ScreenTape 技術(shù)并且將凝膠片段提取到單個(gè)膜上，然后可使用處理的膜獨(dú)立地執(zhí)行不同樣品、或不同通道中同一樣品的不同處理以防止通道之間的流體轉(zhuǎn)移?？墒褂眉訜峄虺暫附觼?lái)處理膜(例如PVDF)的部分，以產(chǎn)生單個(gè)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移區(qū)域。處理操作使圍繞產(chǎn)生不漏液屏障的這些部分的膜固化。這些不漏液屏障防止流體從一個(gè)通道流(芯吸)到另ー個(gè)通道以使得只有未處理區(qū)域允許流體穿透膜。因此，可建立單個(gè)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移區(qū)域，其中可將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移并且隨后獨(dú)立地處理。轉(zhuǎn)移后和靶蛋白質(zhì)檢測(cè)前的附加步驟可捕獲電泳凝膠轉(zhuǎn)移后的圖像，作為轉(zhuǎn)移效率的質(zhì)量控制步驟?？墒褂么藞D像與轉(zhuǎn)移之前獲取的凝膠的圖像比較以確保已經(jīng)出現(xiàn)的蛋白質(zhì)完全轉(zhuǎn)移。如果蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移不完全或不成功，那么添加的此步驟可節(jié)省寶貴的時(shí)間和資源。另ー個(gè)質(zhì)量控制步驟是對(duì)轉(zhuǎn)移到至少ー個(gè)膜上的總蛋白質(zhì)進(jìn)行成像。在將蛋白質(zhì)已經(jīng)轉(zhuǎn)移到至少ー個(gè)膜上之后捕獲分離的蛋白質(zhì)的圖像允許檢查轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)，以確保在凝膠提取和轉(zhuǎn)移步驟期間蛋白質(zhì)沒(méi)有翹曲或變形。在確認(rèn)轉(zhuǎn)移過(guò)程已經(jīng)成功發(fā)生之后，可隨后探測(cè)膜以檢測(cè)步驟e中的靶蛋白質(zhì)。傳統(tǒng)上，此方法涉及很大程度的膜的物理處理和大體積的培育溶液(如抗體溶液)。首先，封閉膜以防止ー級(jí)抗體非特異性的結(jié)合到膜。然后，將ー級(jí)抗體培育物被涂敷到膜上并且在振動(dòng)器上培育。培育之后，將ー級(jí)抗體溶液移除并且洗若干次。然后，涂敷ニ級(jí)抗體并且利用振蕩法再次培育。隨后，將ニ級(jí)抗體移除并且再次洗膜。針對(duì)膜的探測(cè)的傳統(tǒng)的方法適合于當(dāng)前的發(fā)明的實(shí)施例，然而，還可使用培育設(shè)備以減小必需液體的體積并且能夠獨(dú)立地探測(cè)不同的樣品通道。培育設(shè)備可包括掩模和至少ー個(gè)膜，其中掩膜中的小孔形成分離的部分。分離的部分由掩模形成，所述掩模包括凸起的屏障，以及其中至少ー個(gè)膜位于各分離部分內(nèi)。培育設(shè)備還可包括圍繞部分形成的溢流區(qū)域，使得可使用較大體積的液體以同時(shí)覆蓋全部部分。因此，可將小體積的液體設(shè)置到部分中以獨(dú)立地處理膜的部分或可將較大體積的液體設(shè)置到填充所有部分的所有樣品上方，但將液體保持在可控制區(qū)域。培育設(shè)備可包括涂膜劑和可裝配的對(duì)準(zhǔn)特征。使用所述對(duì)準(zhǔn)特征，在掩模上的定位可對(duì)應(yīng)于凝膠電泳期間使用的容器上的相應(yīng)的對(duì)準(zhǔn)特征。這些對(duì)準(zhǔn)特征有助于蛋白質(zhì)分離的結(jié)果與培育的結(jié)果的比較。培育設(shè)備還可包括在界面處的流體密封的可變形的墊圈以及還包括在分離的部分周圍形成不透液密封件的膜。因此，由于流體密封性的可變形的墊圈，設(shè)置在一個(gè)通道上的流體不能溢出膜流到相鄰的通道，并且由于熱處理，所述流體不能透過(guò)膜流到相鄰的通道。流體密封性的可變形的墊圈有精確的尺寸以位于單個(gè)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移區(qū)域周圍，將有助于形成不漏液屏障以防止樣品通道之間的交叉污染。因此，可設(shè)計(jì)單個(gè)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移區(qū)域以精確地定位培育設(shè)備的分離的區(qū)域。作為另外一種選擇，可通過(guò)疏水性屏障將培育設(shè)備分成分離的區(qū)域。這些疏水性屏障可包括通過(guò)網(wǎng)版印刷涂敷的膠和/或油墨?？墒褂媒Y(jié)合到培育設(shè)備內(nèi)的抽真空裝置將施加到由培育設(shè)備產(chǎn)生的部分的流體移除?？墒褂谜婵粘槲ㄟ^(guò)膜將液體抽到設(shè)置在其下面的垃圾容器。通常，檢測(cè)靶蛋白質(zhì)涉及檢測(cè)發(fā)光或熒光標(biāo)記，其在步驟e)期間使用ー個(gè)或兩個(gè)步驟的方法被共價(jià)地鍵合到靶蛋白質(zhì)上。在一個(gè)步驟方法中，標(biāo)記被共價(jià)地鍵合到至少ー個(gè)能夠鍵合到靶蛋白質(zhì)的抗體。在兩個(gè)步驟方法中，能夠鍵合到靶蛋白質(zhì)的至少ー個(gè)未標(biāo)記抗體(ー級(jí)抗體)利用膜培育，然后洗膜并利用至少ー個(gè)抗體(ニ級(jí)抗體)培育，所述ニ級(jí)抗體能被共價(jià)地鍵合到標(biāo)記并且能夠鍵合到ー級(jí)抗體。通常使用的化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)標(biāo)記物的ー個(gè)示例是辣根過(guò)氧化物酶(HRP)。將此酶鍵合到抗體并且用于將不發(fā)光基底轉(zhuǎn)化為發(fā)光產(chǎn)物，所述發(fā)光產(chǎn)物可使用照相膠片來(lái)檢測(cè)。由于鍵合到膜的抗體的數(shù)量増加而增加大量的靶蛋白質(zhì)，所以發(fā)光產(chǎn)物的量由鍵合到那些抗體的HRP酶來(lái)產(chǎn)生。當(dāng)將熒光基團(tuán)鍵合到抗體并且用于蛋白質(zhì)檢測(cè)時(shí)，該過(guò)程與先前所述的大致相同，不同之處在于不需要化學(xué)發(fā)光標(biāo)記基底。而是在特定波長(zhǎng)處激發(fā)熒光基團(tuán)并且通過(guò)適當(dāng)?shù)某上裣到y(tǒng)來(lái)記錄產(chǎn)生的熒光。分析探測(cè)的蛋白質(zhì)以確定靶蛋白質(zhì)含量通常涉及捕獲靶蛋白質(zhì)的圖像。比較探測(cè)的蛋白質(zhì)的圖像和分離的蛋白質(zhì)的圖像，使使用者能夠確定樣品中存在的靶蛋白質(zhì)的量。因此，所述總蛋白質(zhì)和/或持家蛋白質(zhì)可與熒光基團(tuán)相關(guān)并且所述靶蛋白質(zhì)可與熒光基團(tuán)相關(guān)，所述熒光基團(tuán)在來(lái)自與所述總蛋白質(zhì)和/或持家蛋白質(zhì)相關(guān)的所述熒光基團(tuán)的不同波長(zhǎng)處激發(fā)并發(fā)射。分析分離的蛋白質(zhì)以及分析探測(cè)的蛋白質(zhì)可包括使用軟件分析技術(shù)處理分析數(shù)據(jù)。優(yōu)選地，使用單個(gè)分析設(shè)備分析分離的蛋白質(zhì)以確定總蛋白質(zhì)含量和/或持家蛋白質(zhì)以及分析探測(cè)的蛋白質(zhì)以確定靶蛋白質(zhì)含量。例如，可在分析步驟中均使用TapeStation (可從Lab90l獲得)。TapeStation 可檢測(cè)多個(gè)波長(zhǎng)并且因此在其中檢測(cè)熒光基團(tuán)的實(shí)施例中使使用者能夠確定總蛋白質(zhì)含量，并且檢測(cè)另ー個(gè)熒光基團(tuán)使使用者能夠確定靶蛋白質(zhì)含量，可使用TapeStation 來(lái)測(cè)量蛋白質(zhì)表達(dá)的變化。相似地，其中檢測(cè)ー個(gè)熒光基團(tuán)使使用者能夠確定“持家”蛋白質(zhì)的含量并且檢測(cè)另ー個(gè)熒光基團(tuán)使使用者能夠確定靶蛋白質(zhì)含量，均可使用TapeStation=S來(lái)檢測(cè)“持家蛋白質(zhì)”的量和使半定量分析成為可能的總蛋白質(zhì)含量。計(jì)算的量將不必很精確，然而，靶含量和總含量之間的比率為精確的并且可使用此比率來(lái)確定表達(dá)的變化和精確地定量?？墒褂脤?duì)準(zhǔn)特征(如穿孔、基準(zhǔn)邊、基準(zhǔn)面、光學(xué)基準(zhǔn)點(diǎn)、成型部件、或任何它們的組合)以有助于繪制分析分離的蛋白質(zhì)的結(jié)果和分析探測(cè)的蛋白質(zhì)的結(jié)果。凝膠容器可包括可用干與支撐體結(jié)合的對(duì)準(zhǔn)特征以確定與所述電泳容器內(nèi)的它們的初始定位相關(guān)的所述凝膠部分的定位。根據(jù)對(duì)準(zhǔn)特征的特性的這些對(duì)準(zhǔn)特征通過(guò)(例如)數(shù)字圖像捕獲設(shè)備(如，CMOS或CXD數(shù)字照相機(jī))并且通過(guò)已裝到分析設(shè)備上的軟件結(jié)合像素來(lái)分析。優(yōu)選地，在同一設(shè)備(如購(gòu)自Lab90l的TapeStation )上執(zhí)行兩個(gè)分析步驟，因此，這還有助于繪制分離的蛋白質(zhì)的分析結(jié)果和探測(cè)的蛋白質(zhì)的分析結(jié)果。由于能夠?qū)械鞍踪|(zhì)精確地繪制到初始分析，就有可能辨識(shí)第一分離內(nèi)的靶蛋白質(zhì)峰值。然后，可將第一分離內(nèi)的此峰值用于精確的定量，而不是根據(jù)抗體的親和力。作為另外ー種選擇，如果靶蛋白質(zhì)為可分離的和可獨(dú)立地定量的已知蛋白質(zhì)，那么可運(yùn)行樣品的稀釋液系列以提供校準(zhǔn)曲線，利用該校準(zhǔn)曲線可根據(jù)精確的定量倒推計(jì)算未知樣品?？墒褂脝蝹€(gè)計(jì)算機(jī)來(lái)控制用于蛋白質(zhì)分離和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移過(guò)程的設(shè)備，可使用所述單個(gè)計(jì)算機(jī)來(lái)設(shè)定用于這些過(guò)程的電壓和時(shí)間?？捎墒褂谜吒鶕?jù)用于各種蛋白質(zhì)類型或由使用者(其中，可以優(yōu)化它們以實(shí)現(xiàn)他們的特定需求)可編程的一個(gè)優(yōu)選的預(yù)設(shè)定的程序之中的ー個(gè)來(lái)選擇時(shí)間和電壓的分布。有助于繪制分離的蛋白質(zhì)的分析結(jié)果和探測(cè)的蛋白質(zhì)的分析結(jié)果的另ー個(gè)措施使用通道內(nèi)標(biāo)記物，該措施可在步驟a)期間插入添加。在本發(fā)明的實(shí)施例的背景下，“通道內(nèi)標(biāo)記物”是指在分離之前添加到樣品的蛋白質(zhì)，其中將分離之后在靠近后凝膠的頂部或底部位置接收蛋白質(zhì)。因此，道內(nèi)標(biāo)記物允許使用者辨識(shí)分離后的已知蛋白質(zhì)片段，以及從而允許使用者通過(guò)比較這些校準(zhǔn)片段來(lái)預(yù)測(cè)樣品中其它蛋白質(zhì)片段的尺寸。還可使用數(shù)字圖像捕獲設(shè)備(數(shù)字照相機(jī))并且結(jié)合可辨識(shí)所有分離的片段和通過(guò)比較通道內(nèi)標(biāo)記物預(yù)測(cè)它們的尺寸的軟件來(lái)執(zhí)行此過(guò)程。優(yōu)選地，為了輕松的辨識(shí)，將利用另ー個(gè)熒光基團(tuán)來(lái)標(biāo)記通道內(nèi)標(biāo)記物?？墒褂猛活愋偷臒晒饣鶊F(tuán)以預(yù)染色蛋白質(zhì)并且可使用同一類型的熒光基團(tuán)，同時(shí)還可使用探測(cè)分離的蛋白質(zhì)以使通道內(nèi)標(biāo)記物的辨識(shí)成為可能。此外，可使用分子量定徑標(biāo)記物以有助于繪制分離的蛋白質(zhì)的分析結(jié)果和探測(cè)的蛋白質(zhì)的分析結(jié)果?？蓪⒎肿恿慷◤綐?biāo)記物添加到電泳凝膠上的空通道并且與樣品在相同時(shí)間分離或此前運(yùn)行的數(shù)碼存儲(chǔ)。優(yōu)選地，使用對(duì)準(zhǔn)特征、分子量定徑標(biāo)記物和/或通道內(nèi)標(biāo)記物以有助于繪制分離的蛋白質(zhì)的分析結(jié)果和探測(cè)的蛋白質(zhì)的分析結(jié)果。在實(shí)施例中，其中膜經(jīng)過(guò)處理以形成分離的區(qū)域，單個(gè)地分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移區(qū)域和/或不透液區(qū)域充當(dāng)為可信的標(biāo)記物以有助于膜和其內(nèi)含有的蛋白質(zhì)的成像期間的校準(zhǔn)操作。在使用不止ー個(gè)熒光基團(tuán)(如用于預(yù)染色的第一熒光基團(tuán)、能夠測(cè)定靶蛋白質(zhì)含量的第二熒光基團(tuán)、以及能夠辨識(shí)通道內(nèi)標(biāo)記物的第三熒光基團(tuán))的實(shí)施例中，各熒光基團(tuán)可在不同波長(zhǎng)處激發(fā)并發(fā)射以使得各熒光基團(tuán)可在分析期間獨(dú)立地辨識(shí)。分析分離的蛋白質(zhì)和/或探測(cè)的蛋白質(zhì)可包括通過(guò)參考存儲(chǔ)的信息(例如附著到凝膠容器的條形碼和/或附著到在探測(cè)之前可將凝膠轉(zhuǎn)移到其內(nèi)或其上的任何夾持器的條形碼)辨識(shí)樣品的步驟。優(yōu)選地，條形碼耐受于免疫檢測(cè)中使用的化學(xué)品，例如甲醇。因此，可從準(zhǔn)備分離直到分析探測(cè)的樣品過(guò)程中對(duì)樣品進(jìn)行跟蹤。此外，使用此措施來(lái)辨識(shí)和跟蹤樣品就允許記錄附加的信息，例如在步驟b)、步驟c)、步驟d)、以及步驟e)之間用去的時(shí)間。由能夠辨識(shí)提取的凝膠的措施提供的可跟蹤的和附加的信息使得良好的實(shí)驗(yàn)室規(guī)范和良好的生產(chǎn)規(guī)范成為可能。通常,western印跡技術(shù)還用于診斷測(cè)試,例如HIV和BSE測(cè)試，其中整個(gè)測(cè)試過(guò)程的可跟蹤性是非常有益的。在實(shí)施例中，提供了進(jìn)行western印跡分析技術(shù)的方法，其中該方法包括依次執(zhí)行下述步驟a).提供含有蛋白質(zhì)的樣品；b).預(yù)染色樣品中的蛋白質(zhì)；c).使用凝膠電泳分離蛋白質(zhì)；d).分析所分離的蛋白質(zhì)以確定總蛋白質(zhì)含量；e).探測(cè)分離的蛋白質(zhì)；以及f).分析所探測(cè)的蛋白質(zhì)以確定靶蛋白質(zhì)含量。


本發(fā)明的實(shí)施例示出了以下示例和附圖，其中圖I為典型的western印跡方法的一個(gè)實(shí)施例的流程圖；圖2為使用Lab90l’ sScreenTape 和TapeStation 技術(shù)的本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例
的流程圖；圖3示出了由凝膠電泳(NuPAGE )分離蛋白質(zhì)之后直接分析分離的蛋白質(zhì)的結(jié)果，分離之后轉(zhuǎn)移分離的蛋白質(zhì)(Novex 半干轉(zhuǎn)移)并且隨后利用抗體(SNAPid )培育，根據(jù)示例I進(jìn)行制備。圖4示出了電泳之后的總蛋白質(zhì)、已經(jīng)轉(zhuǎn)移到膜的總蛋白質(zhì)、和根據(jù)示例I使用PVDF膜制備的靶蛋白質(zhì)的輪廓比較。
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圖5a)示出了，根據(jù)示例2進(jìn)行制備的，通過(guò)凝膠電泳使用Lab901ScreenTape系統(tǒng)(P200)分離蛋白質(zhì)之后直接分析分離的蛋白質(zhì)的結(jié)果，在轉(zhuǎn)移(LAB90iScreenTape 提取和轉(zhuǎn)移過(guò)程)分離的蛋白質(zhì)之后的結(jié)果，以及利用抗體(柱-Ab)培育之后的結(jié)果，根據(jù)示例2進(jìn)行制備；以及圖5b)示出了從圖5a)獲得的重疊的輪廓曲線。圖6a)示出了，根據(jù)示例3進(jìn)行制備的，通過(guò)凝膠電泳(P200)分離蛋白質(zhì)之后直接分析分離的蛋白質(zhì)的結(jié)果，在轉(zhuǎn)移(LAB901 ScreenTape 提取和轉(zhuǎn)移過(guò)程)分離的蛋白質(zhì)之后的結(jié)果，以及利用抗體(柱-Ab)培育之后的結(jié)果；以及圖6b)示出了從圖6a)獲得的重疊輪廓曲線。圖7示出了檢測(cè)到的等量總蛋白質(zhì)與靶蛋白質(zhì)的比率，所述比率與系統(tǒng)中使用的總蛋白質(zhì)稀釋液無(wú)關(guān)。圖8示出了檢測(cè)到的總蛋白質(zhì)與靶蛋白質(zhì)的比率，所述比率對(duì)應(yīng)于添加到系統(tǒng)的靶蛋白質(zhì)的濃度。
具體實(shí)施例方式示例 I凝膠電泳按如下方式制備含有蛋白質(zhì)的樣品a.在75°C利用20 μ I熒光染色劑培育20 μ I蛋白質(zhì)樣品7分鐘；以及b.添加40 μ I加載緩沖液，混合并在75°C再培育5分鐘。另外，按如下方式制備對(duì)照樣品a.將20 μ I蛋白質(zhì)樣品與10 μ I還原劑和4x25 μ I的Invitrogen’s LDS緩沖液；以及b.在75°C培育5分鐘。將兩種樣品加載到NuPAGE電泳凝膠并且根據(jù)生產(chǎn)商的標(biāo)準(zhǔn)方案運(yùn)行以分離蛋白質(zhì)，并且隨后使用UV透射器和數(shù)字照相機(jī)來(lái)捕獲凝膠的圖像。將分離的樣品轉(zhuǎn)移到膜上該凝膠包括分成兩等分的分離的蛋白質(zhì)并且隨后將一半轉(zhuǎn)移到PVDF膜上以及將另一半轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上。使用濾紙將分離的蛋白質(zhì)分別電轉(zhuǎn)移到兩個(gè)膜上并且在20%甲醇Tris-Glycinel轉(zhuǎn)移緩沖液中浸濕膜以組裝由3x印跡紙/膜/凝膠/3x印跡紙構(gòu)成的轉(zhuǎn)移夾層。在nvitrogen’ sNovex 半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中放置姆個(gè)轉(zhuǎn)移夾層并且將蛋白質(zhì)在25V處轉(zhuǎn)移45分鐘。探測(cè)分離的和轉(zhuǎn)移的樣品使用培育設(shè)備(例如Millipore’ s SN APk攸系統(tǒng))利用抗體按如下方式培育膜上的分離的蛋白質(zhì)a.將膜放置到預(yù)浸濕的印跡支撐架中；b.在磷酸吐溫緩沖液(PBST)中使用O. 05%脫脂奶粉(NFDM)來(lái)封閉非特異性鍵合位點(diǎn)；c. ー級(jí)抗體培育溶菌酶抗體按1:1000濃度并且培育10分鐘；d.利用 PBST洗3 次；
e. ニ級(jí)抗體培育羊抗兔 IgG-HRP (Goat anti-Rabb it IgG-HRP)按 1:10，000 濃度并且培育10分鐘；f.利用 PBST洗3 次；
g.從印跡支撐架取出膜并且設(shè)置到粘性薄膜上。h.添加四甲基聯(lián)苯胺(TMB)基底并且培育20分鐘；以及i.掃描該膜。使用GeneTools 軟件以針對(duì)電泳介質(zhì)、膜以及膜柱TMB來(lái)調(diào)控分離的位置使得輪廓曲線可為重疊的。圖3示出了GeneTools 分析的結(jié)果。示例2凝膠電泳按如下方式制備含有蛋白質(zhì)的樣品a.在75°C處利用2μ1熒光染色劑培育2μ1蛋白質(zhì)樣品7分鐘；b.添加4μ I加載緩沖液，混合并在75°C處培育5分鐘；以及c.添加2 μ I通道內(nèi)標(biāo)記物。將樣品加載到Lab90lP200 ScreenTape 電泳凝膠上并且根據(jù)生產(chǎn)商的標(biāo)準(zhǔn)方案運(yùn)行以分離蛋白質(zhì)。使用Lab901 TapeStation 對(duì)所用的ScreenTape 進(jìn)行成像(參見(jiàn)圖5a 中"P200")。將分離的樣品轉(zhuǎn)移到膜上包括分離的蛋白質(zhì)的所用的ScreenTape 從TapeStation 恢復(fù)，移除其載體層
并且使用兩個(gè)刀片以切除ScreenT叩e 的頂部和底部，暴露包含在16個(gè)子容器內(nèi)的凝膠柱的頂部和底部。將包括16個(gè)凝膠推擠元件的梳狀物用于推動(dòng)各子容器內(nèi)的凝膠以使得凝膠被抽取到在20%甲醇Tris-Glycine轉(zhuǎn)移緩沖液中浸濕的PVDF膜上。該膜位于在20%甲醇Tris-Glycine轉(zhuǎn)移緩沖液中浸濕的一片印跡紙的頂端，印跡紙和膜均被支撐在正極上。將在20%甲醇Tris-Glycine轉(zhuǎn)移緩沖液中浸濕的第二片印跡紙?jiān)O(shè)置到負(fù)極上并且將負(fù)極封閉到正極上，以及在50V/cm處將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移10分鐘。將印跡紙和凝膠從膜移除并且將膜轉(zhuǎn)移到抗體探測(cè)程序。質(zhì)量控制步驟使用Lab90l TapeStation 將后轉(zhuǎn)移膜成像。將電泳之后記錄的總蛋白質(zhì)圖像使用可信標(biāo)記物和對(duì)準(zhǔn)特征重疊到被轉(zhuǎn)移到膜上的總蛋白質(zhì)的圖像之上。然后，在進(jìn)行免疫檢測(cè)程序之前評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)移程序的效率。在此分析之后，隨后將膜轉(zhuǎn)移到抗體培育設(shè)備。探測(cè)分離的和轉(zhuǎn)移的樣品使用Millipore SNAPid 系統(tǒng)利用抗體按如下方式對(duì)膜上的分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行
培育a.將膜放置到預(yù)浸濕的印跡支撐架中；b.在磷酸吐溫緩沖液(PBST)中使用0.05%脫脂奶粉來(lái)封閉非特異性鍵合位點(diǎn)；c. ー級(jí)抗體培育溶菌酶抗體按1:1000濃度并且培育10分鐘；d.利用 PBST洗3 次；e. ニ級(jí)抗體培育羊抗兔 IgG_Alexa488 (Goat anti-Rabb it IgG_Alexa488)按1:10，000濃度并且培育10分鐘；
f.利用 PBST 洗 3 次；g.從印跡支撐架取出膜并且設(shè)置到粘性薄膜上；h.將膜成像到TapeStation (參見(jiàn)圖5a中的“柱Ab”)使用GeneTools 軟件將分離的蛋白質(zhì)和探測(cè)的蛋白質(zhì)的輪廓曲線重疊(圖5b)。示例3凝膠電泳按如下方式制備含有蛋白質(zhì)的樣品a.在75°C處利用2 μ I熒光染色劑培育2 μ I蛋白質(zhì)樣品7分鐘； b.添加4μ I加載緩沖液，混合并在75°C處培育5分鐘；以及c.添加2μ I通道內(nèi)標(biāo)記物。將樣品加載到Lab90lP20()ScreenTape_ i泳凝膠上并且根據(jù)生產(chǎn)商的標(biāo)準(zhǔn)方案運(yùn)行以分離蛋白質(zhì)。使用Lab90l TapeStation (參見(jiàn)圖6a中 〃Ρ200〃)成像所用的ScreenTape 。將分離的樣品轉(zhuǎn)移到膜上包括分離的蛋白質(zhì)的所用的ScreenTape 從TapeStation 恢復(fù)，移除其載體層
并且使用兩個(gè)刀片以切除ScreenTape 的頂部和底部，暴露包含在16個(gè)子容器內(nèi)的凝膠柱的頂部和底部。將包括16個(gè)凝膠推擠元件的梳狀物用于推動(dòng)各子容器內(nèi)的凝膠以使得凝膠被抽取到在20%甲醇Tris-Glycine轉(zhuǎn)移緩沖液中浸濕的PVDF膜上。具有單個(gè)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移區(qū)域的膜優(yōu)先通過(guò)熱處理PVDF膜來(lái)產(chǎn)生。該膜位于在20%甲醇Tris-Glycine轉(zhuǎn)移緩沖液中浸濕的一片印跡紙的頂端，印跡紙和膜均被支撐在正極上。將在20%甲醇Tris-Glycine轉(zhuǎn)移緩沖液中浸濕的第二片印跡紙放置到負(fù)極上并且將負(fù)極封閉到正極上，以及在50V/cm電壓處將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移10分鐘。將印跡紙和凝膠從膜移除。剩下的與印跡紙關(guān)聯(lián)的凝膠被后轉(zhuǎn)移且從膜上完全脫離。質(zhì)量控制步驟使用Lab901 TapeStation 將后轉(zhuǎn)移(post-tranfer)膜成像。將電泳之后記錄的總蛋白質(zhì)圖像使用可信標(biāo)記物和對(duì)準(zhǔn)特征重疊到被轉(zhuǎn)移到膜上的總蛋白質(zhì)的圖像之上。然后，在進(jìn)行免疫檢測(cè)程序之前評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)移過(guò)程的效率。在此分析之后，隨后將膜轉(zhuǎn)移到抗體培育設(shè)備。探測(cè)分離的和轉(zhuǎn)移的樣品將膜上的分離的蛋白質(zhì)按如下方式轉(zhuǎn)移到培育設(shè)備a)手動(dòng)地或自動(dòng)地將由不透液部件圍繞的單個(gè)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移區(qū)域構(gòu)成的膜重新定位到包括測(cè)量單個(gè)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移區(qū)域的確切尺度的部件的基底上；b)將膜設(shè)置到基底上以使得實(shí)現(xiàn)精確的校準(zhǔn)；c)將基底固定在垃圾盒的頂部，所述垃圾盒包括連接到真空歧管的裝置。d)然后，使用配合到基底掩模之上的上掩模將膜固定，所述基底掩模包括測(cè)量單個(gè)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移區(qū)域的確切尺度的部件。e) 一旦固定到培育設(shè)備內(nèi)，圍繞該部件的流體密封性的可變形的墊圈就形成流體密封性密封件。然后，按如下方式使用免疫檢測(cè)以探測(cè)膜a.在磷酸吐溫緩沖液中使用0. 05%脫脂奶粉來(lái)封閉非特異性鍵合位點(diǎn)；
b. 一級(jí)抗體培育溶菌酶抗體按1:1000濃度并且培育10分鐘；c.利用 PBST 洗 3 次；d. 二級(jí)抗體培育羊抗兔IgG-Alexa488按1:10，000濃度并且培育10分鐘；Θ.利用PBST洗3次；f.將膜成像到TapeStation (參見(jiàn)圖6a中的“柱Ab”)。使用Lab901的GeneTools 軟件，將分離蛋白質(zhì)的后電泳和后轉(zhuǎn)移的輪廓曲線重疊。示例 4為了證明系統(tǒng)的靈敏度和重現(xiàn)性，在稀釋范圍上以同一樣品計(jì)算靶蛋白質(zhì)含量與總蛋白質(zhì)含量的比率。將未稀釋的蛋白質(zhì)樣品以及按1:3和1:9稀釋的同一樣品用于LAB90Iwestern印跡方案(參見(jiàn)示例3)。將總蛋白質(zhì)測(cè)量安排在將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜之前的 質(zhì)量控制步驟中。免疫檢測(cè)步驟之后測(cè)量靶蛋白質(zhì)濃度。用三個(gè)濃度比較總蛋白質(zhì)含量和靶蛋白質(zhì)含量的比率，如圖7所示，其中示出在稀釋范圍內(nèi)比率一致。這表明系統(tǒng)對(duì)含有更高濃度的蛋白質(zhì)的樣品的靈敏度與對(duì)含有較低濃度的蛋白質(zhì)的樣品的靈敏度產(chǎn)生相同的比率。其還表明將總蛋白質(zhì)含量用作加載對(duì)照的能力。考慮到將同一樣品加載到不同通道或?qū)⒁阎♂尪鹊臉悠芬呀?jīng)制成并加載到不同通道，可歸一化通過(guò)不同通道的總蛋白質(zhì)的濃度變化以有助于比較和重現(xiàn)性。通常，樣品含量的輕微變化可引起蛋白質(zhì)濃度的半定量western印跡分析期間不規(guī)則的數(shù)值。使用來(lái)自不同通道定量的總蛋白質(zhì)進(jìn)行歸一化大大地提高了分析結(jié)果和質(zhì)量結(jié)果的重現(xiàn)性。示例5為了進(jìn)一步證明系統(tǒng)的靈敏度，將不同量的靶蛋白質(zhì)添加到7mg/ml的相同細(xì)胞裂解液以形成稀釋液系列。使用LAB901 ScreenTape 電泳凝膠來(lái)分離蛋白質(zhì)樣品。分離之后，通過(guò)使用Lab90l TapeStation 系統(tǒng)成像來(lái)計(jì)算總蛋白質(zhì)含量。然后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜并且使用LAB901western印跡方案(參見(jiàn)示例3)來(lái)進(jìn)行靶蛋白質(zhì)的免疫檢測(cè)。使用總蛋白質(zhì)含量以歸一化靶蛋白質(zhì)含量的數(shù)值并且，如圖8可見(jiàn)，靶蛋白質(zhì)與總蛋白質(zhì)的比率顯示了與添加到樣品的靶蛋白質(zhì)的量對(duì)應(yīng)的靶蛋白質(zhì)的減少。這證明，該系統(tǒng)具有精確地并且重現(xiàn)性地檢測(cè)上下調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)的能力。應(yīng)該指出的是，術(shù)語(yǔ)“包括”不排除其它元素或步驟并且“一”或“一個(gè)”不排除多個(gè)。另外，結(jié)合不同實(shí)施例而描述的要素可組合。還應(yīng)該指出的是，權(quán)利要求中的參考標(biāo)記不應(yīng)被理解為限制權(quán)利要求的范圍。
權(quán)利要求
1.一種進(jìn)行western印跡分析的方法，其中，所述方法按以下順序執(zhí)行 a).預(yù)染色樣品中的蛋白質(zhì)； b).使用凝膠電泳分離這些蛋白質(zhì)； c).分析所分離的蛋白質(zhì)以確定總蛋白質(zhì)含量和/或至少ー個(gè)持家蛋白質(zhì)含量； d).將這些蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到至少ー個(gè)膜上； e).探測(cè)所分離的蛋白質(zhì)以檢測(cè)靶蛋白質(zhì)；以及 f).分析所探測(cè)的蛋白質(zhì)以確定所述靶蛋白質(zhì)的分子量和/或含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，將所述總蛋白質(zhì)含量和/或持家蛋白質(zhì)含量與所述靶蛋白質(zhì)含量比較，以獲得總蛋白質(zhì)和/或持家蛋白質(zhì)含量相對(duì)靶蛋白質(zhì)含量的比率。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中，所述蛋白質(zhì)含量被計(jì)算為相對(duì)于電泳凝膠中的熒光的位置而繪制或相對(duì)于從蛋白質(zhì)分離開(kāi)始的固定點(diǎn)處檢測(cè)到所述熒光的時(shí)間而繪制的熒光強(qiáng)度曲線下方的面積。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3所述的方法，其中，所述總蛋白質(zhì)含量被確定為相對(duì)于電泳凝膠中的熒光的位置而繪制或相對(duì)于從蛋白質(zhì)分離開(kāi)始的固定點(diǎn)處檢測(cè)到所述熒光的時(shí)間繪制的熒光強(qiáng)度曲線下方的全部面積。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4所述的方法，其中，所述靶蛋白質(zhì)含量和/或持家蛋白質(zhì)含量被確定為在相對(duì)于電泳凝膠中的熒光的位置而繪制或相對(duì)于從蛋白質(zhì)分離開(kāi)始的固定點(diǎn)處檢測(cè)到所述熒光的時(shí)間而繪制的熒光強(qiáng)度曲線上的特定峰值下的面積。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至5所述的方法，其中，靶蛋白質(zhì)的濃度是用下述方式計(jì)算的使用已知蛋白質(zhì)濃度的含量來(lái)建立校準(zhǔn)曲線，并將所述靶蛋白質(zhì)含量繪圖到所述校準(zhǔn)曲線上。
7.根據(jù)權(quán)利要求I至5所述的方法，其中，靶蛋白質(zhì)的濃度是用下述方式計(jì)算的使用通道內(nèi)標(biāo)記物的已知濃度的含量，并將這些數(shù)值與靶蛋白質(zhì)含量比較。
8.根據(jù)權(quán)利要求I至7所述的方法，其中，執(zhí)行所述靶蛋白質(zhì)的系列稀釋以提高確定靶蛋白質(zhì)濃度的計(jì)算的精確度。
9.根據(jù)權(quán)利要求I至8所述的方法，其中，所述總蛋白質(zhì)含量和/或持家蛋白質(zhì)含量用作含量対照。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，將所述總蛋白質(zhì)含量和/或持家蛋白質(zhì)含量用作含量對(duì)照，并使用這些數(shù)值來(lái)歸一化所述總蛋白質(zhì)含量和/或持家蛋白質(zhì)含量相對(duì)于靶蛋白質(zhì)含量的比率。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一個(gè)所述的方法，其中，使用至少ー個(gè)熒光基團(tuán)將所述樣品中的所述蛋白質(zhì)預(yù)染色。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，使用多于ー個(gè)熒光基團(tuán)，各熒光基團(tuán)在不同波長(zhǎng)處激發(fā)和發(fā)射，使得在分析期間可單獨(dú)地識(shí)別各熒光基團(tuán)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述總蛋白質(zhì)和/或持家蛋白質(zhì)與熒光基團(tuán)相關(guān)，所述靶蛋白質(zhì)與下述熒光基團(tuán)相關(guān)該熒光基團(tuán)相對(duì)干與所述總蛋白質(zhì)和/或持家蛋白質(zhì)相關(guān)的熒光基團(tuán)而言在不同波長(zhǎng)處激發(fā)和發(fā)射。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一個(gè)所述的方法，其中，分析所分離的蛋白質(zhì)以確定靶蛋白質(zhì)含量的步驟包括捕獲所分離的蛋白質(zhì)的圖像。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一個(gè)所述的方法，其中，分析所探測(cè)的蛋白質(zhì)以確定靶蛋白質(zhì)含量的步驟包括捕獲所探測(cè)的蛋白質(zhì)的圖像。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一個(gè)所述的方法，其中，分析所分離的蛋白質(zhì)以確定所述總蛋白質(zhì)含量和/或持家蛋白質(zhì)含量和/或分析所探測(cè)的蛋白質(zhì)以確定所述靶蛋白質(zhì)含量的步驟包括使用軟件分析技術(shù)來(lái)處理所述分析數(shù)據(jù)。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一個(gè)所述的方法，其中，分析所分離的蛋白質(zhì)以確定所述總蛋白質(zhì)含量和/或持家蛋白質(zhì)含量以及分析所探測(cè)的蛋白質(zhì)以確定所述靶蛋白質(zhì)含量的步驟是在單個(gè)分析設(shè)備上執(zhí)行的。
18.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一個(gè)所述的方法，其中，使用可編程的計(jì)算機(jī)來(lái)控制在凝膠電泳期間使用的電壓和時(shí)間。
19.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一個(gè)所述的方法，其中，使用對(duì)準(zhǔn)特征來(lái)幫助繪制所分離的蛋白質(zhì)的分析結(jié)果和所探測(cè)的蛋白質(zhì)的分析結(jié)果。
20.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一個(gè)所述的方法，其中，在步驟b)期間添加通道標(biāo)記物，來(lái)幫助繪制所分離的蛋白質(zhì)的分析結(jié)果和所探測(cè)的蛋白質(zhì)的分析結(jié)果。
21.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一個(gè)所述的方法，其中，使用分子量定徑標(biāo)記物來(lái)幫助繪制所分離的蛋白質(zhì)的分析結(jié)果和所探測(cè)的蛋白質(zhì)的分析結(jié)果。
22.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一個(gè)所述的方法，其中，分析所分離的蛋白質(zhì)以確定所述總蛋白質(zhì)含量和/或持家蛋白質(zhì)含量和/或分析所探測(cè)的蛋白質(zhì)以確定所述靶蛋白質(zhì)含量的步驟包括通過(guò)參考存儲(chǔ)的信息來(lái)辨識(shí)所述樣品。
23.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一個(gè)所述的方法，其中，使用可編程計(jì)算機(jī)來(lái)控制在將所分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到至少ー個(gè)膜上的過(guò)程中使用的電壓和時(shí)間。
24.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一個(gè)所述的方法，其中，所述方法包括捕獲所述電泳凝膠后轉(zhuǎn)移的圖像，作為蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移的效率的質(zhì)量控制步驟。
25.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一個(gè)所述的方法，其中，所述方法包括在所分離的蛋白質(zhì)已被轉(zhuǎn)移至所述至少一個(gè)膜上之后，捕獲這些蛋白質(zhì)的圖像。
26.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一個(gè)所述的方法，其中，通過(guò)包括下述項(xiàng)的方式來(lái)優(yōu)化轉(zhuǎn)移方法以防止或減輕滲漏改變轉(zhuǎn)移緩沖液的pH、緩沖液的類型、使用不連續(xù)緩沖液，S卩，在正極和負(fù)極印跡紙中使用不同的緩沖液以及在所述膜中使用不同的緩沖液，或通過(guò)改變整個(gè)凝膠上每厘米的電壓。
27.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一個(gè)所述的方法，其中，通過(guò)相對(duì)于所述容器移動(dòng)所述凝膠，來(lái)從所述容器中提取分子分離凝膠。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中，所述裝置適于相對(duì)于所述容器移動(dòng)所述凝膠，同時(shí)保持所述凝膠的縱橫比。
29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中，所述裝置適于通過(guò)推擠所述凝膠來(lái)相對(duì)于所述容器移動(dòng)所述凝膠。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中，所述裝置包括多個(gè)凝膠推擠元件，所述多個(gè)凝膠推擠元件作用于多個(gè)凝膠子容器上。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中，所述凝膠推擠元件形成梳狀物。
32.根據(jù)權(quán)利要求30或31所述的方法，其中，這些凝膠推擠元件被引導(dǎo)到位。
33.根據(jù)前述權(quán)利要求30至32中任一個(gè)所述的方法，其中，與所述凝膠的表面接觸的各凝膠推擠元件的部件的形狀和尺寸基本上對(duì)應(yīng)于所述推擠元件與所述凝膠之間的所述界面的橫截面積，使得整個(gè)凝膠從所述容器移位，同時(shí)保持所述凝膠的縱橫比。
34.根據(jù)前述權(quán)利要求30至33中任一個(gè)所述的方法，其中，這些凝膠推擠元件是彈性可變形的，以允許容忍這些子容器的內(nèi)部的形狀和尺寸以及這些凝膠推擠元件與所述容器在對(duì)齊方面的小變化。
35.根據(jù)前述權(quán)利要求30至34中任一個(gè)所述的方法，其中，所述凝膠容器受到物理操作來(lái)幫助所述凝膠的提取，例如，旋轉(zhuǎn)所述容器、輕輕地施加壓カ或按壓所述容器。
36.根據(jù)前述權(quán)利要求30至35中任一個(gè)所述的方法，其中，所述凝膠容器可包括用于與支撐體的對(duì)準(zhǔn)特征相結(jié)合的對(duì)準(zhǔn)特征，以與它們?cè)谒鲭娪救萜鲀?nèi)的初始定位相關(guān)地確定凝膠部分的位置。
37.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一個(gè)所述的方法，其中，所述免疫檢測(cè)培育是在培育設(shè)備中進(jìn)行的。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中，所述培育設(shè)備能夠單獨(dú)地培育至少ー個(gè)膜的部分。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中，所述培育設(shè)備包括掩模和至少ー個(gè)膜，其中，所述掩模中的小孔形成分離的部分。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中，這些分離的部分由所述掩模形成，所述掩模包括凸起的屏障，至少ー個(gè)膜位于各個(gè)分離的部分內(nèi)。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中，在這些部分周圍形成溢出區(qū)域。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中，這些分離的部分包括流體密封性可變形的密封件，所述流體密封性可變形的密封件是與所述膜的界面處的墊圏，以在這些分離的部分周圍形成流體密封性密封件。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中，所述培育設(shè)備被疏水性屏障分離成分離的區(qū)域。
44.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述疏水性屏障包括膠和/或油墨。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中，所述膠和/或油墨通過(guò)網(wǎng)版印刷來(lái)涂覆。
46.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一個(gè)所述的方法，其中，由不透滲透液體區(qū)域?qū)⑺鲋辽侃`個(gè)膜分離成各個(gè)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移區(qū)域。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中，各個(gè)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移區(qū)域是通過(guò)熱處理來(lái)產(chǎn)生的。
48.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中，各個(gè)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移區(qū)域是通過(guò)超聲焊接來(lái)產(chǎn)生的。
49.根據(jù)權(quán)利要求46至48所述的方法，其中，所述各個(gè)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移區(qū)域被設(shè)計(jì)為與所述培育設(shè)備的這些分離的區(qū)域精確地對(duì)準(zhǔn)。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中，所述各個(gè)分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移區(qū)域和/或所述不滲透液體區(qū)域充當(dāng)可信的標(biāo)記物，以幫助在所述膜和其內(nèi)包含的所述蛋白質(zhì)成像期間的校準(zhǔn)操作。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中，條形碼被結(jié)合到所述膜上，使得能夠跟蹤所述設(shè)備。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中，所述條形碼耐受于在免疫檢測(cè)中使用的化學(xué)品，例如，甲醇。
53.一種參照本申請(qǐng)中的實(shí)施例而描述的方法。
54.一種設(shè)備，被配置來(lái)執(zhí)行根據(jù)權(quán)利要求I至53所述的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及western印跡分析技術(shù)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明提供了進(jìn)行western印跡分析的方法，所述方法包括依次執(zhí)行下述步驟a)預(yù)染色樣品中的蛋白質(zhì)；b)使用凝膠電泳分離蛋白質(zhì)；c)分析分離的蛋白質(zhì)以確定總蛋白質(zhì)含量和/或至少一個(gè)持家蛋白質(zhì)含量；d)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到至少一個(gè)膜上；e)探測(cè)分離的蛋白質(zhì)以檢測(cè)靶蛋白質(zhì)；f)分析探測(cè)的蛋白質(zhì)以確定靶蛋白質(zhì)的分子量和/或靶蛋白質(zhì)的含量。
文檔編號(hào)G01N27/447GK102918387SQ201180025296
公開(kāi)日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2011年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月21日
發(fā)明者肯尼思·G·馬克拿瑪瑞, 斯圖爾特·保爾沃特 申請(qǐng)人:Lab901有限公司