專利名稱：游離的維生素d的免疫分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于分析(測定)血液或血液成分樣品的游離的維生素D (freevitamin D)的免疫分析(免疫測定，immunoassay)方法。本發(fā)明還涉及免疫分析和用于進(jìn)行(引導(dǎo)，conduct)這樣的免疫分析的試劑盒，其中所述免疫分析包括重點(diǎn)照顧檢驗(yàn)(點(diǎn)照顧測試，point-of-care tests)。
背景技術(shù)：
被稱為“維生素D”的物質(zhì)包括一組脂肪可溶解的激素原以及其代謝物和類似物。體內(nèi)出現(xiàn)的維生素D的主要形式是維生素D2 (麥角鈣化醇)和維生素D3 (膽鈣化醇)。后者是維生素D的內(nèi)源性形式，人類可在太陽光的影響下在皮膚中形成維生素D3。前者是從食物中攝取的維生素D的外源性形式。在美國，維生素D2被用作藥物學(xué)維生素D補(bǔ)充物。除非另外指出，本公開內(nèi)容中的術(shù)語維生素D涉及維生素D的任何一種或多種形式，包含維生素D代謝物如25-輕基-維生素D或1，25 二輕基維生素D。雖然維生素D2和D3在它們的側(cè)鏈的分子結(jié)構(gòu)方面不同，但是它們在現(xiàn)有的激素原中共有相同的生物活性，在兩個(gè)步驟中，最終被代謝為也稱為鈣三醇(骨化三醇，calcitriol)的1，25 二羥基維生素D (1，25-(OH) 2-維生素D)，或1，25 二羥基膽鈣化醇。前述的代謝物，25-羥基維生素D (25-(OH)-維生素D)或鈣三醇，由肝中的轉(zhuǎn)變產(chǎn)生，且其被認(rèn)為是體內(nèi)維生素D的貯藏形式。循環(huán)的維生素D主要由25- (OH)-維生素D3和25- (OH)-維生素D2組成。生物學(xué)上，25-(OH)-維生素D2與25-(OH)-維生素D3—樣有效。循環(huán)中25-(OH)-維生素D2的半衰期較短。對于臨床實(shí)踐，推薦使用25-(OH)-維生素D分析，其測量25-(OH)-維生素D3以及25-(OH)-維生素D2 (I)。維生素D長期已被認(rèn)為是重要的物質(zhì)，其活化形式在骨的形成和維持中以及在人類或動(dòng)物身體的其他過程中發(fā)揮作用。因此，它通過促進(jìn)腸內(nèi)來自食物的鈣和磷的吸收和腎中鈣的重吸收，用于增加鈣到血流中的流量；使骨能夠正常礦化和預(yù)防低血鈣性抽搐。其也是造骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的骨成長和骨重建所必需的。維生素D缺乏引起削弱的骨礦化和導(dǎo)致骨軟化疾病，兒童佝僂病和成人軟骨病，并且可能產(chǎn)生骨質(zhì)疏松癥。維生素D在人類健康中發(fā)揮許多其他的作用，包括抑制從甲狀腺的降血鈣素釋放。降血鈣素直接地作用于破骨細(xì)胞，引起骨再吸收和軟骨降解的抑制。維生素D也能抑制從甲狀旁腺的甲狀旁腺激素分泌，調(diào)節(jié)神經(jīng)肌肉和免疫功能和減少炎癥。因此，具有適當(dāng)?shù)木S生素D水平對于人類和動(dòng)物的健康是基本的。然而，維生素D的過量(其可能由于過量用藥而發(fā)生)是有毒的。維生素D毒性的某些癥狀是由增加的腸鈣吸收引起的血鈣過多(血液中鈣的水平升高)。已知維生素D毒性是高血壓的原因。維生素D毒性的胃腸癥狀可包括厭食、惡心、和嘔吐。這些癥狀常常伴隨多尿(過多的產(chǎn)生尿)、煩渴(增加的口渴)、虛弱、神經(jīng)過敏、瘙癢癥(發(fā)癢)、和最終地腎衰竭。
明顯地，能夠診斷可能的維生素D缺乏的受試者是重要的。特別是對于補(bǔ)充維生素D的受試者，能夠檢驗(yàn)潛在的維生素D過量的受試者，也是重要的?？偟?5-(0H)_維生素D的血清水平被認(rèn)為是維生素D狀態(tài)的主要指示劑(2)。然而，這種觀念一直都有爭議。通過維生素D結(jié)合蛋白(88%)和白蛋白(12%)結(jié)合血清中幾乎所有循環(huán)的25-(OH)-維生素D。維生素D結(jié)合蛋白(DBP)是血清的主要成分，濃度為250_400mg/L血清。僅僅占據(jù)DBP的維生素D結(jié)合位點(diǎn)的小部分，大約為2%。25-(OH)-維生素D的非常小的部分(分?jǐn)?shù)，fraction),0. 04%以游離的、非蛋白質(zhì)結(jié)合形式循環(huán)。所有人類中DBP濃度都不是恒定的，并且可通過其他因素影響DBP的濃度，其他因素包括懷孕、口服避孕藥的使用、腎病和肝病。DBP濃度的認(rèn)識(shí)對于患者的真實(shí)的25-(0H)_維生素D狀態(tài)的準(zhǔn)確評價(jià)是至關(guān)重要的。例如，服用口服避孕藥的年輕女性可能具有處于正常范圍內(nèi)的總的25-(0H)_維生素D水平。然而，由于她的升高的DBP，可顯著地降低游離的25-(0H)_維生素D的濃度，使得她處于臨床25-(0H)_維生素D不足的增加的風(fēng)險(xiǎn)之中和那個(gè)條件承擔(dān)的所有風(fēng)險(xiǎn)之中。已經(jīng)顯示了，體內(nèi)甲狀腺和留醇激素的生理活性與她們的游離的、非蛋白質(zhì)結(jié)合的部分的相關(guān)性，比與血漿中荷爾蒙的總的濃度的相關(guān)性更好。特別是在升高或減少了結(jié)合蛋白水平的情形中，總的循環(huán)荷爾蒙的測量可導(dǎo)致錯(cuò)誤的診斷。在這樣的情形中，游離循環(huán)的荷爾蒙濃度的測量提供較好的信息。這種觀念被稱為“游離的荷爾蒙假設(shè)”。Mendel
(3)表明，游離的荷爾蒙假設(shè)很可能對于所有組織的甲狀腺荷爾蒙、皮質(zhì)醇、并且還對于維生素D的羥基化代謝物來說是正確的。Bikle等人(4)檢驗(yàn)1，25-(OH) 2-維生素D的游離的荷爾蒙假設(shè)的正確性。數(shù)據(jù)表明，甚至在患有肝病和減少的DBP水平的受試者中，盡管總的1，25- (OH) 2-維生素D顯著減少，好像也能很好地維持游離的1，25- (OH) 2-維生素D水平。在隨后的關(guān)于25_(0H)_維生素D的研究中，推薦相同的組，從而在具有更改的結(jié)合蛋白濃度的情形中測量游離的25-(0H)_維生素D。作者推論，總的維生素D代謝物測量可能誤導(dǎo)具有肝病的患者的維生素D狀況的評價(jià)，并且推薦在進(jìn)行維生素缺乏的診斷之前也確定游離的25-(OH)-維生素D水平。Bikle等人使用超濾作用以確定游離的25-(OH)-維生素D的水平(5)。這種方法需要高度純凈的放射性標(biāo)記的維生素D并且傾向于過高估計(jì)游離的維生素D的部分。Lauridsen等人(6)顯示，不同DBP表型的女性具有不同的1，25 (OH) 2維生素D和25 (OH)維生素D的濃度。這些作者表明，在較低的血漿25 (OH)維生素D水平下，具有Gc2_2的女性是維生素D充足的。某些背景技術(shù)可涉及有關(guān)的游離的分析物的確定。美國專利4366143描述涉及有機(jī)物質(zhì)或配體的游離部分的分析的發(fā)明，其中所述有機(jī)物質(zhì)或配體以結(jié)合的和游離的形式存在于生物流體中。該方法基本上是競爭性免疫分析，其中，在一個(gè)步驟中，將標(biāo)記的配體和特異性結(jié)合劑同時(shí)加入到樣品中。配體的游離部分和標(biāo)記的配體競爭與特異性結(jié)合劑反應(yīng)，且以依賴于樣品中存在的游離的配體部分的量的比例結(jié)合到特異性結(jié)合劑上。該公開方法的缺點(diǎn)是，由于特異性結(jié)合劑和標(biāo)記的配體兩者的存在，存在能夠干擾結(jié)合的和游離的配體之間的平衡的多個(gè)因素，其使得該方法幾乎不適用于以相對較低的量存在的游離的配體，如維生素D的情況。事實(shí)上，其并沒有公開如何使用游離的維生素D測量的分析。美國專利第4，292，296號(hào)公開了用于在樣品中確定游離的分析物的方法，其中所述樣品含有游離的分析物和受體結(jié)合的分析物。該方法涉及兩個(gè)步驟，第一步驟是將樣品與分析物的吸收劑接觸，以從溶液中去除分析物。第二步驟包括將吸收劑結(jié)合的分析物與標(biāo)記的分析物類似物接觸。因此，從吸收劑中去除溶解相，并且確定結(jié)合的和洗掉的相中的標(biāo)記的量。描述了用于確定游離的甲狀腺荷爾蒙的濃度的方法。美國專利申請2008/0182341涉及用于測量流體中游離的或未結(jié)合的分析物濃度的穩(wěn)定劑。其表明，穩(wěn)定劑防止配體與它的結(jié)合蛋白的分離。參考采用同時(shí)分析程序并且列舉了各種穩(wěn)定劑。提供的穩(wěn)定劑不包括烷基胺氟表面活性劑。沒有現(xiàn)有技術(shù)參考文獻(xiàn)具體地提供關(guān)于確定維生素D的分析，其反映了游離的維生素D的狀況。應(yīng)該注意，關(guān)于游離的維生素D的分析已經(jīng)知道了幾十年，但是這些使用方法如平衡透析或速率透析作為它們的基礎(chǔ)。這樣的方法對于研究人員和高度訓(xùn)練過的技術(shù)人員來說是可接受的，但是幾乎不適于常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室，其中所述常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室為了達(dá)到他們的財(cái)政目的需要高生產(chǎn)量自動(dòng)化檢驗(yàn)。因此，期望提供能夠自動(dòng)化的且適用于重點(diǎn)照顧檢驗(yàn)的游離的維生素D的分析。前述已編號(hào)的參考是I. Hollis BW. Measuring 25-hydroxyvitamin D in a clinical environment:challenges and needs.Am J Clin Nutr. 2008Aug;88 (2) :507S_510S.2. Holick MF. Vitamin D:extraskeletal health.Endocrinol Metab Clin North Am. 2010Jun;39(2):381-400.3. Mendel CM. The free hormone hypothesis: a physiological Iybasedmathematical model.Endocr Rev. 1989Aug; 10 (3) :232-74.4. Bikle D，Gee E, Halloran B，Haddad J. Free I, 25-Dihydroxyvitamin DLevels in Serum from Normal Subjects, Pregnant Subjects, and Subjects with LiverDisease.J Clin Invest. 1984;74:1966-1971.5. Bikle D，Gee E, Halloran B, Kowalski MAj Ryzen E，Haddad J. Assessment ofthe free fraction of 25-hydroxyvitamin D in serum and its regulation by albuminand the vitamin D-binding protein.J Clin Endocrinol Metab. 19860ct; 63 (4) : 954-9.6. Lauridsen AL, Vestergaard P，Hermann AP, Brot C，HeickendorffL，Mosekilde L，Nexo E.Plasma concentrations of 25-hydroxy-vitamin D andI,25-dihydroxy-vitamin D are related to the phenotype of Ge (vitamin D-bindingprotein): a cross-sectional study on 595early postmenopausal women.CalcifTissue Int. 2005Jul; 77 (I) : 15-22.
7. van Hoof HJj Swinkels LMj Ross HAj Sweep CG, Benraad TJ.Determination of non-protein-bound plasma 1，25-dihydroxyvitamin Dbysymmetric(rate)dialysis. Anal Biochem 1998May I;258 (2):176-83.

發(fā)明內(nèi)容
為了較好地解決一個(gè)或更多前述的期望，在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種用于分析存在游離的維生素D (包括維生素D代謝物如25-輕基-維生素D或1，25 二輕基維生素D)的血液或血液成分樣品的方法，包括(a)將對于25-0H維生素D的固定的結(jié)合蛋白或抗體加入到樣品中；(b)將樣品與稀釋劑(diluent)混合，所述稀釋劑包括氟烷基表面活性劑(fluoroalkyl surfactant)；(c)將樣品孵育有效量的時(shí)間，以使得期望量的25-0H維生素D結(jié)合到結(jié)合蛋白上；(d)通過洗滌去除未結(jié)合的血清和血清成分；(e)利用標(biāo)記的維生素D化合物，使包括結(jié)合到其上的25-0H維生素D的固定的結(jié)合蛋白或抗體經(jīng)受競爭性結(jié)合(competitive binding)；(f)確定結(jié)合到結(jié)合蛋白上的標(biāo)記的維生素D化合物的濃度。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及用于進(jìn)行前述方法的試劑盒。在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明涉及一種用于分析存在游離的維生素D的血液或血液成分的樣品的方法，所述方法包括在第一步驟中，在固定的結(jié)合劑(immobilized binder)如對于25-0H維生素D的固定的結(jié)合蛋白或抗體上捕獲維生素D，和在隨后的步驟中，使捕獲的25-0H維生素D相對于標(biāo)記的維生素D變體經(jīng)受競爭性結(jié)合分析，其中通過如此有限地螯合(sequestering)—定量的結(jié)合的維生素D以便滿足反復(fù)試驗(yàn)來實(shí)現(xiàn)游離的維生素D的捕獲，其中使從其中捕獲維生素D的樣品經(jīng)受捕獲維生素D和使捕獲的維生素D經(jīng)受相同的競爭性結(jié)合分析的相同步驟，并且其中在兩個(gè)競爭性結(jié)合分析之后測量的游離的維生素D的濃度基本上是相同的。在還有的進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明涉及一種用于分析存在游離的維生素D的血液或血液成分樣品的方法，該方法包括在第一步驟中，在固定的結(jié)合劑如對于25-0H維生素D的固定的結(jié)合蛋白或抗體上捕獲維生素D，和在隨后的步驟中，使捕獲的25-0H維生素D相對于標(biāo)記的維生素D變體經(jīng)受競爭性結(jié)合分析，其中捕獲0. 5-5wt%的結(jié)合的維生素D。在還有的另一個(gè)方面中，該方法可用于重點(diǎn)照顧檢驗(yàn)。后者是指在病患照顧的地點(diǎn)處或附近進(jìn)行檢驗(yàn)，即，而不是采取血液樣品和將這些發(fā)送給診斷實(shí)驗(yàn)室，可立即將樣品引入到便攜式的，優(yōu)選手持式裝置中，其能夠盡可能以有限的多個(gè)步驟進(jìn)行分析，和盡可能利用有限的多個(gè)手動(dòng)操作。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及氟烷基表面活性劑優(yōu)選全氟羧酸鹽表面活性劑并且更優(yōu)選全氟辛酸(PFOA)在用于確定游離的維生素D的免疫分析中作為維生素D的溶解性增強(qiáng)劑(solubility enhancer)中的應(yīng)用。


圖I代表在本發(fā)明的分析的第一和第二通道(pass)中游離的維生素D濃度之間的相互關(guān)系。示出的線由利用具有不同游離的維生素D水平的10個(gè)樣品進(jìn)行重復(fù)免疫提取而產(chǎn)生?；貧w線的斜率整體沒有顯著不同。
具體實(shí)施例方式廣義上，本發(fā)明涉及用于游離的維生素D的確定的兩步驟分析，包括從血液或血液成分特別是血清或血漿中免疫吸附非-蛋白質(zhì)結(jié)合的25 (OH)-維生素D，之后，測量吸收的維生素D?？梢员绢I(lǐng)域已知的任何方式，從受試者，特別是人類中采集這樣的樣品，期望在其血液中分析游離的25-0H-維生素D的存在。游離的維生素D是指維生素D的循環(huán)的、未結(jié)合的部分。這涉及維生素D的任何形式，包括維生素D2、維生素D3、和代謝物25(0H)_維生素D2、25_(OH)-維生素D3、1，25 (OH)2-維生素D2和1，25(0H)2-維生素D3。分析可用于單獨(dú)地或以組合測量游離的維生素D的這些形式中的任一種。優(yōu)選地，本發(fā)明的分析用于測量游離的25(0H)_維生素D，導(dǎo)致25 (OH)-維生素D2和25-(OH)-維生素D3的確定。術(shù)語“游離的(free)”和“未結(jié)合的”是指沒有結(jié)合到任何蛋白質(zhì)上的部分，主要包括維生素D結(jié)合蛋白(VDBP或DBP)。優(yōu)選在結(jié)合蛋白加入之前、期間、或之后稀釋樣品。樣品稀釋劑可以是水基的并且優(yōu)選是緩沖液(緩沖溶液，buffer solution)。優(yōu)選地,緩沖的pH在從6· O至8· O范圍內(nèi)。緩沖液包括氟烷基表面活性劑。應(yīng)該理解，可通過將稀釋劑加入到樣品中、通過將樣品加入到稀釋劑中、或通過同時(shí)將緩沖液和樣品加入彼此之中完成緩沖液與樣品的混合。出于實(shí)際的原因，優(yōu)選將稀釋劑加入到樣品中。不希望受到理論的束縛，本發(fā)明人認(rèn)為，表面活性劑以這樣的方式增強(qiáng)了維生素D的溶解性使得導(dǎo)致維生素D的有限的螯合。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及分析游離的維生素D的新的概念。關(guān)于分析游離的維生素D的問題是，游離的維生素D的初始濃度是非常低的，且不能通過現(xiàn)有的免疫分析測量。解決這個(gè)問題的現(xiàn)有的嘗試基于期望避免維生素D從DBP上的去除(例如，通過“穩(wěn)定”游離的和結(jié)合的維生素D之間的平衡的嘗試)，或僅僅涉及屈服于不能分析游離的DBP的事實(shí)，和這些分析僅僅涉及維生素D從DBP的轉(zhuǎn)移。在本發(fā)明中，可預(yù)見維生素D的有限的螯合，其中螯合的維生素D的分?jǐn)?shù)(部分，fraction)足夠低，優(yōu)選存在于樣品中的總的維生素D的O. 1-10%并且優(yōu)選不超過它的5%，從而仍然反映了最初的游離的維生素D的濃度。這可以在樣品中通過含氚的維生素D和稀釋緩沖液的加入無需過度的實(shí)驗(yàn)而證實(shí)。結(jié)合到維生素D結(jié)合蛋白上的維生素D不應(yīng)該減少超過5%?？商鎿Q地，樣品可被吸收到抗體涂覆的孔的壁上。在去除樣品之后，添加生物素化的維生素D，并且對吸收到抗體上的游離的維生素D定量。在第二個(gè)孔中引入從其上去除最初量的維生素D的樣品，且再一次孵育和定量。測量的游離的維生素D的濃度應(yīng)該與來自第一次孵育的結(jié)果相同。優(yōu)選通過添加按重量計(jì)O. 05至O. 5%的氟烷基表面活性劑，優(yōu)選O. 1-0. 25%的氟烷基表面活性劑實(shí)現(xiàn)維生素D的有限的螯合。優(yōu)選氟烷基表面活性劑是全氟烷基表面活性齊U，更優(yōu)選是全氟羧酸鹽表面活性劑(perfluoro carboxylate surfactant),并且最優(yōu)選是全氟辛酸(PFOA)。優(yōu)選使用0. I至0. 2%，更優(yōu)選0. 15%的PFOA。在這些條件下，樣品與不同水平的DBP但是相同濃度的總的維生素D的反應(yīng)，與通過對稱透析測量的游離的維生素D的濃度有關(guān)?？梢韵胂蟮兀诒景l(fā)明中，可以使用PFOA自身、或它的衍生物。這些衍生物通常是指包括全氟辛酸部分(perfluoro octanoic moiety),特別地包括PFOA鹽,如PFOA銨鹽的衍生物，以及是指相應(yīng)的磺酸，即PFOA磺酸鹽，簡寫為PFOS (全氟辛烷磺酸鹽，也被稱為全氟辛烷磺酸)。根據(jù)本發(fā)明確定游離的維生素D (包括維生素D代謝物)的方法的優(yōu)勢是，它提供了能夠自動(dòng)化的分析形式。這顯著地將本發(fā)明的分析與確定游離的維生素D的現(xiàn)有的分析區(qū)分開來。在本發(fā)明的分析中，添加對于25-0H-維生素D的結(jié)合蛋白。對于維生素D的結(jié)合蛋白，例如，抗體是本領(lǐng)域已知的，并且廣泛用于維生素D的現(xiàn)有的免疫分析中。這些相同的抗體以及其他結(jié)合蛋白，也可用于本發(fā)明中。例如，代替對于維生素D的抗體，可使用如利用噬菌體展示技術(shù)產(chǎn)生的抗體片段。適當(dāng)?shù)目贵w可以是單克隆抗體或多克隆抗體。它們可以以已知的方式獲得，例如，多克隆山羊抗維生素D、多克隆兔抗維生素D、或如來自維生素D的免疫分析應(yīng)用的領(lǐng)域中已知的任何其他適當(dāng)?shù)木S生素D抗體。例如從下列參考文獻(xiàn)中已知適當(dāng)?shù)目贵wHollis, Clin. Chem 31/11，1815-1819(1985) ；Hollis, Clin. Chem39/3，529-533(1993)。優(yōu)選以包括固體載體的顆粒形式加入結(jié)合蛋白。通常，將結(jié)合蛋白涂覆在固相(solid phase)上,例如,涂覆在微量滴定板上。在優(yōu)選的實(shí)施方式中,將結(jié)合蛋白涂覆到磁性粒子(magnetic particle)上,其在磁場中促進(jìn)它們的分離。在添加結(jié)合蛋白例如抗體之后，使樣品孵育(培養(yǎng)，incubate)。需要的時(shí)間將取決于環(huán)境，如試劑的濃度、結(jié)合蛋白的類型、和孵育期間的條件，例如，搖動(dòng)和溫度。通常，孵育時(shí)間的范圍從10秒至幾個(gè)小時(shí)，優(yōu)選I分鐘至2個(gè)小時(shí)。對于自動(dòng)化的平臺(tái)，優(yōu)選短的孵育時(shí)間(10秒至10分鐘，優(yōu)選30秒至30分鐘)?；旧希瑫r(shí)間段不具有特別的關(guān)聯(lián)性，只要在期望的時(shí)間段期間在環(huán)境下在校準(zhǔn)系統(tǒng)(calibration system)中確定要結(jié)合多少游離的維生素D。更短和更長的時(shí)間段明顯是可能的，條件是發(fā)生適當(dāng)?shù)男?zhǔn)。因此，優(yōu)選地，在相同的條件下，利用校準(zhǔn)器的比較涉及相同的時(shí)間段。在孵育時(shí)期之后，可以利用標(biāo)記的維生素D化合物以已知的方式使樣品經(jīng)受競爭性結(jié)合分析。許多標(biāo)記的化合物是已知的，其能夠在用于確定維生素D的免疫分析中用作競爭性結(jié)合抗原。典型的標(biāo)記是放射性標(biāo)記(radiolabel)、熒光標(biāo)記、發(fā)光標(biāo)記(luminescent label)、生物素標(biāo)記(biotin label)、金標(biāo)記(gold label)、酶標(biāo)記。競爭性結(jié)合分析對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，且不需要說明，特別地是因?yàn)榭梢岳靡阎m合于確定維生素D的任何標(biāo)記進(jìn)行本發(fā)明的方法的這個(gè)部分?？墒褂玫臉?biāo)記尤其是在現(xiàn)有的維生素D免疫分析的前述參考文獻(xiàn)中公開的那些標(biāo)記。因此，利用允許測量濃度的標(biāo)記，確定樣品中游離的維生素D的濃度。應(yīng)該理解，通過校準(zhǔn)測量，即通過相同的分析中的校準(zhǔn)器的響應(yīng)，確定測量的值的解釋?？商鎿Q地,借助于質(zhì)譜分析(質(zhì)譜法,mass spectroscopy),可以使捕獲的維生素D經(jīng)受定量分析。
通過提供校準(zhǔn)器可以完成用于本發(fā)明的分析的校準(zhǔn)，其中所述校準(zhǔn)器包括預(yù)定濃度的游離的25-0H-維生素D?？赏ㄟ^對稱透析確定這些校準(zhǔn)器中的游離的維生素D的部分。在對稱透析中，在透析細(xì)胞的一個(gè)側(cè)面上裝載血清樣品。利用其中添加痕量的放射性標(biāo)記的維生素D的相同樣品裝載其他的隔室(compartment)。放射性標(biāo)記的維生素D從一個(gè)透析隔室到另一個(gè)的移動(dòng)速率直接與維生素D的游離部分成比例(7)。根據(jù)本發(fā)明的游離的維生素D的測量在基本上不影響游離的維生素D的濃度的情況下，依賴于游離的維生素D的濃度的評價(jià)，還基于上述討論的維生素D的有限的螯合。在另一個(gè)方面，本發(fā)明以在血液或血液成分中用于確定25-0H維生素D的免疫分析的形式提供了產(chǎn)物，其中分析利用根據(jù)前述實(shí)施方式中任一個(gè)的方法。更具體地，將以用于進(jìn)行免疫分析的試劑盒的形式提供這樣的產(chǎn)物。這樣的試劑盒可包括所包含的單獨(dú)的試齊U，即，結(jié)合蛋白和標(biāo)記的維生素D化合物?？蓡为?dú)提供這些試劑，因此只在它們用于本發(fā)明的分析時(shí)形成試劑盒。優(yōu)選地，可以一起提供試劑，優(yōu)選一起包裝試劑，作為一個(gè)試劑盒套件(成套試劑盒，試劑盒部件，部件試劑盒，kit of part)。試劑盒可選地包括對于血液或 血液成分樣品的容器，但是按照慣例這也可被單獨(dú)提供。通常，試劑盒包括固定在固相上的結(jié)合劑和單獨(dú)結(jié)合的(conjugated)維生素D。按照本領(lǐng)域中的慣例,其他試劑盒成分可依賴于選擇的標(biāo)記，因?yàn)椴煌臉?biāo)記可需要不同的試劑。本發(fā)明還涉及氟燒基表面活性劑優(yōu)選全氟羧酸鹽(perfluoro carboxylate)表面活性劑并且更優(yōu)選全氟辛酸和/或全氟庚酸(perfluoroheptanoic acid)在用于確定游離的維生素D的免疫分析中作為維生素D的溶解性增強(qiáng)劑中的應(yīng)用。優(yōu)選的表面活性劑是全氟烷基表面活性劑，更優(yōu)選全氟羧酸鹽如全氟庚酸或全氟辛酸。更優(yōu)選地，表面活性劑是全氟辛酸(PF0A)、或它的衍生物。這些衍生物通常是指包括全氟辛酸部分的衍生物，特別地包括PFOA鹽，如PFOA銨鹽，以及是指相應(yīng)的磺酸，即PFOA磺酸鹽，簡寫為PFOS (全氟辛烷磺酸鹽，也稱為全氟辛烷磺酸)。還可使用其他全氟羧酸鹽表面活性劑的類似衍生物。應(yīng)該理解，本發(fā)明不限于上文描述的實(shí)施方式和配方。也應(yīng)該理解，在權(quán)利要求書中單詞“包括”不排除其他要素或步驟。其中當(dāng)涉及單數(shù)名詞例如“一個(gè)”或“一種”、“該”時(shí)使用不定冠詞或定冠詞，除非具體地地指出別的物件，否則這包括那些名詞的復(fù)數(shù)。將參考下列非限制性的實(shí)施例和所附非限制性的

本發(fā)明。實(shí)施例材料涂覆的微量滴定板利用抗小鼠IgG抗體以200ng/孔的濃度涂覆Nunc maxisorp微量滴定板。隨后，將單克隆抗_25(0H)維生素D抗體的層以2ng/孔的濃度吸收到抗小鼠IgG層上。利用含有BSA和蔗糖的硼酸鹽緩沖液封閉板。樣品稀釋劑樣品稀釋劑由含有防腐劑和0. 15%的PFOA的pH 8. 0的0. IM TRIS緩沖液組成。結(jié)合物(coniugate) (g卩，標(biāo)記的維牛素D化合物)是生物素化的維生素D。在含有0. 1%牛血清白蛋白和防腐劑的pH 7. 5的0. IMTris緩沖液中以25pg/ml的濃度提供結(jié)合劑。
鏈霉親和素-HRP和TMB來自商業(yè)來源。方案如下進(jìn)行分析。在微量滴定板的孔中，用滴管吸取90μ I的樣品稀釋劑。接下來，將10μ I的樣品加入到稀釋劑中。將這種混合物在37° C下孵育90分鐘。隨后，利用洗滌緩沖液將孔洗滌三次。將100 μ I的HRP結(jié)合物加入到試管中，且孵育30分鐘。再次利用洗滌緩沖液將孔洗滌三次。然后，通過辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素產(chǎn)生比色信號(hào)。在37° C下孵育20分鐘之后，利用洗滌緩沖液將孔洗滌三次。隨后，將100 μ I TMB溶液加入到孔中。在室溫下在黑暗中孵育20分鐘之后，加入100 μ I終止溶液，且在450nm上讀取吸收率?！ぴ诳字挟a(chǎn)生的信號(hào)與樣品或校準(zhǔn)器中的游離的25 (OH)維生素D的濃度成反比。通過將未知的信號(hào)與校準(zhǔn)器的響應(yīng)進(jìn)行比較，可計(jì)算出原始樣品中游離的25(0H)維生素D的濃度。結(jié)果在標(biāo)準(zhǔn)參考樣品上利用本發(fā)明的分析，產(chǎn)生關(guān)于游離的25(0H)維生素D的測量的
典型的校準(zhǔn)曲線，且在下面的表格中說明。
權(quán)利要求
1.一種用于分析存在游離的維生素D (包括維生素D代謝物如25-羥基-維生素D或.1，25 二羥基維生素D)的血液或血液成分的樣品的方法，包括 (a)將對于25-0H維生素D的固定的結(jié)合蛋白或抗體加入到所述樣品中； (b)將所述樣品與稀釋劑混合，所述稀釋劑包括氟烷基表面活性劑； (c)將所述樣品孵育有效量的時(shí)間，以使得期望量的維生素D結(jié)合到所述結(jié)合蛋白上； Cd)通過洗滌去除未結(jié)合的血清和血清成分； Ce)利用標(biāo)記的維生素D化合物使包括結(jié)合到其上的捕獲的維生素D的固定的結(jié)合蛋白或抗體經(jīng)受競爭性結(jié)合； Cf)確定結(jié)合到所述結(jié)合蛋白上的標(biāo)記的維生素D化合物的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述氟烷基表面活性劑是全氟羧酸，優(yōu)選選自由全氟辛酸、全氟庚酸、以及它們的混合物組成的組。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中，所述表面活性劑的濃度為按重量計(jì)O.05%至O.5%，優(yōu)選按重量計(jì)O. 1%-0. 25%。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述稀釋劑是緩沖液，所述緩沖液具有在從6. O至8. O范圍內(nèi)的緩沖的pH。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述結(jié)合蛋白是抗體。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述結(jié)合蛋白是維生素D結(jié)合蛋白。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述樣品是人類血清或血漿。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，以涂覆在磁性粒子上的形式提供所述結(jié)合蛋白。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述標(biāo)記的維生素D化合物包括選自由放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記、發(fā)光標(biāo)記、生物素標(biāo)記、金標(biāo)記、酶標(biāo)記組成的組中的標(biāo)記。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，參考對于游離的25-OH維生素D的校準(zhǔn)濃度來確定所述濃度。
11.一種用于分析存在游離的維生素D的血液或血液成分的樣品的方法，包括在第一步驟中，在對于維生素D的固定的結(jié)合劑上捕獲維生素D，和在隨后的步驟中，使捕獲的維生素D相對于標(biāo)記的維生素D變體經(jīng)受競爭性結(jié)合分析，其中通過如此有限地螯合一定量的結(jié)合的維生素D以便滿足反復(fù)試驗(yàn)來實(shí)現(xiàn)游離的維生素D的捕獲，其中使從其中捕獲維生素D的樣品經(jīng)受捕獲維生素D和使捕獲的維生素D經(jīng)受相同的競爭性結(jié)合分析的相同步驟，并且其中在兩個(gè)競爭性結(jié)合分析之后測量的游離的維生素D的濃度基本上是相同的。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)進(jìn)行。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的方法，其中，螯合的維生素D的分?jǐn)?shù)是所述樣品中存在的總的維生素D的O. l-10wt%，并且優(yōu)選不超過它的5wt%。
14.一種用于從血清或血漿樣品中對游離的維生素D定量的方法，包括根據(jù)權(quán)利要求I中限定的步驟(a)、(b)、(c)和(d)，以及借助于質(zhì)譜分析使捕獲的維生素D經(jīng)受定量分析。
15.一種用于確定血液或血液成分中的游離的維生素D的免疫分析，其中，所述分析利用根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法。
16.一種利用權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法用于進(jìn)行免疫分析的試劑盒，所述試劑盒包括固定在固相上的對于維生素D的結(jié)合蛋白、和標(biāo)記的維生素D化合物。
全文摘要
本發(fā)明公開的是從血液或血液成分，特別是血清或血漿中進(jìn)行游離的25(OH)維生素D的免疫吸附，之后，測量被吸收的材料。使用氟烷基表面活性劑來增強(qiáng)維生素D的溶解性并且可以測量游離的維生素D。因此，本發(fā)明采用結(jié)合蛋白來吸收游離的25(OH)維生素D。其后，利用標(biāo)記的維生素D化合物，優(yōu)選放射性標(biāo)記的、熒光標(biāo)記的、發(fā)光標(biāo)記的、生物素標(biāo)記的、金標(biāo)記的或酶標(biāo)記的化合物，使包括25-OH維生素D的結(jié)合蛋白經(jīng)受競爭性結(jié)合分析?？商鎿Q地，可通過質(zhì)譜分析對免疫捕獲的25-OH維生素D進(jìn)行定量。
文檔編號(hào)G01N33/82GK102985826SQ201180027487
公開日2013年3月20日 申請日期2011年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月1日
發(fā)明者米夏埃爾·弗朗西斯庫斯·威廉默斯·科內(nèi)利斯·馬滕斯, 喬治·亨利·帕森斯, 弗朗西斯庫斯·瑪麗亞·安娜·羅斯馬勒恩, 萊昂·瑪麗亞·雅各布斯·威廉默斯·斯文科爾斯 申請人:未來診斷有限公司