專利名稱：小分子陣列及其制造和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及藥物研發(fā)和生物化學。在替代性實施方案中，本發(fā)明提供了例如陣列或微陣列等制品，其包含細胞和化合物(例如小分子或藥物)，用于例如藥物篩選或毒性測試。
背景技術(shù)：
常規(guī)的高通量小分子篩選是使用液體處理機器人(liquid handling robot)以多孔格式進行的。典型地，將細胞在多孔板(例如96到3456個孔)中培養(yǎng)，并將小分子添加到每個孔中。對于每種化合物，每個孔(例如就3456孔板而言)中的單位培養(yǎng)面積為約3_2。大規(guī)模的篩選需要昂貴的液體處理機器人。每個測試都需要Iμ I化合物。常規(guī)的微陣列藥物篩選將藥物固定在載玻片上的聚(dl-丙交酯-乙交酯)(PLGA)中，然后接種細胞，覆蓋整個載玻片。有效的藥物將會干擾細胞存活和增殖，從而產(chǎn)生細胞較少的點。然而，覆蓋整個載玻片需要較大數(shù)量的細胞。因為在每個點之間沒有屏障，所以細胞可以從一個點自由遷移到另一個點。受不同點影響的細胞可能相互作用，并導(dǎo)致實驗的獨立性較差。缺乏屏障還會引起閱讀區(qū)域的界限不夠分明，導(dǎo)致定量更困難且精確性更差。

發(fā)明內(nèi)容
在替代性實施方案中，本發(fā)明提供了包含陣列或微陣列或由陣列或微陣列組成的制品，以及其制造和使用方法。在替代性實施方案中，本發(fā)明提供了用于制造陣列或微陣列的方法，且本發(fā)明的制品包含通過本發(fā)明的方法制造的陣列或微陣列。在替代性實施方案中，本發(fā)明提供了制品，其包含:固體、半固體、凝膠或凝膠狀、膠體或溶膠-凝膠基質(zhì)，所述基質(zhì)基本上包含防止或抑制細胞粘附或不能維持細胞粘附的表面或涂層(或涂料)，且所述表面或涂層(或涂料)包含能夠粘附一個或多個細胞的多個點或受限或限定區(qū)域，其中任選地，防止或抑制細胞粘附的表面或涂層(或涂料)包括聚丙烯酰胺或水凝膠、或涂布有聚丙烯酰胺或涂布有水凝膠的表面、或其組合，且任選地，包含表面或涂層(或涂料)的固體、半固體、凝膠或凝膠狀、膠體或溶膠-凝膠基質(zhì)的表面包括或者是涂布有聚丙烯酰胺或涂布有水凝膠的玻璃或載玻片，且任選地，在點樣或印刷之前對涂布有水凝膠的玻璃或載玻片進行脫水，且任選地，固體或半固體基質(zhì)包含玻璃或等同物或由玻璃或等同物組成，且任選地，將聚丙烯酰胺或水凝膠交聯(lián)到經(jīng)過硅烷活化的玻璃或載玻片上；且任選地，能夠粘附一個或多個細胞的多個點或受限區(qū)域包含一種或多種組合物或組合物的混合物，所述組合物能夠促進、啟動和/或維持細胞粘附于多個點或受限區(qū)域(且任選地，在包含能夠促進、啟動和/或維持細胞粘附的一種或多種組合物的點或受限區(qū)域中，所述一種或多種組合物或組合物的混合物直接粘附于固體、半固體、凝膠或凝膠狀、膠體或溶膠-凝膠基質(zhì)上，而不粘附于防止或抑制細胞粘附的表面或涂層或涂料上)，且任選地，能夠促進、啟動和/或維持細胞粘附的一種或多種組合物包含一種或多種細胞外基質(zhì)蛋白，或分子的細胞外基質(zhì)狀組合物或混合物，例如纖維狀蛋白和糖胺聚糖(GAG)的聯(lián)鎖網(wǎng)狀物，或蛋白聚糖(PG)、硫酸乙酰肝素(HS)、硫酸軟骨素(CS)、硫酸角質(zhì)素(KS)、透明質(zhì)酸、膠原蛋白、彈性蛋白、纖維粘連蛋白、層粘蛋白、細胞粘附分子(CAM)或CAM配體、整合素、鈣粘附蛋白、選凝素、地址素(addressin)或其混合物或其等同物，且任選地,細胞是哺乳動物細胞或人細胞。在替代性實施方案中，制品包含陣列或微陣列，或由陣列或微陣列組成，或被制造成陣列或微陣列的形式。在替代性實施方案中，本發(fā)明提供了通過包含以下步驟的方法制造的制品:(a)提供化合物、藥物、小分子或小分子藥物，和能夠聚合的單體溶液；(b)提供固體、半固體、凝膠或凝膠狀、膠體或溶膠-凝膠基質(zhì)；(c) (i)混合化合物、藥物、小分子或小分子藥物與單體溶液，且任選地還包含能夠啟動和/或催化單體聚合的第二溶液或組合物(或在所述第二溶液或組合物中混合)，并將混合物點樣或印刷到固體、半固體、凝膠或凝膠狀、膠體或溶膠-凝膠基質(zhì)的表面的多個受限區(qū)域(例如點)上，或(ii)將化合物、藥物、小分子或小分子藥物點樣或印刷到固體、半固體、凝膠或凝膠狀、膠體或溶膠-凝膠基質(zhì)的表面的多個受限區(qū)域(例如點)上，隨后將能夠聚合的單體溶液點樣或印刷到基本上每個被點樣或印刷的化合物、藥物、小分子或小分子藥物點或印記上面(之上)，其中任選地:(I)單體溶液起初包含能夠啟動和/或催化單體聚合的第二溶液或組合物，且單體溶液在點樣或印刷步驟后發(fā)生聚合，(2)將能夠啟動和/或催化單體聚合的第二溶液或組合物點樣或印刷到基本上每個被點樣或印刷的化合物、藥物、小分子或小分子藥物點或印記上面(之上)，以便啟動或催化單體聚合，或(iii)將化合物、藥物、小分子或小分子藥物點樣或印刷到固體、半固體、凝膠或凝膠狀、膠體或溶膠-膠凝基質(zhì)的表面的多個受限區(qū)域(例如點)上，并通過外部來源，例如通過暴露于光輻射(例如紫外光)或熱量誘導(dǎo)單體溶液發(fā)生聚合；其中任選地，每種化合物、藥物、小分子或小分子藥物的點樣或印刷區(qū)域大約介于約0.0lmm2和0.05mm2之間，或大約介于約0.02mm2和0.04mm2之間，或大約為0.03mm2 ；且任選地，用噴墨打印機或等同物或液體處理機器人進行混合物或單體的點樣或印刷，且任選地，將化合物、藥物、小分子或小分子混合物溶液制備成期望濃度和/或與預(yù)聚物溶液混合，或制備到封裝脂質(zhì)、脂質(zhì)體或粒子或納米封裝粒子中，且任選地，可以使用微陣列機器人將溶液直接印刷到經(jīng)過脫水的凝膠載片上；或可以將化合物、藥物、小分子或小分子藥物/預(yù)聚物或被封裝的化合物、藥物、小分子或小分子藥物溶液印刷到經(jīng)過脫水的凝膠載片上。在替代性實施方案中，制品包含陣列或微陣列，或由陣列或微陣列組成，或被制造成陣列或微陣列的形式。
在替代性實施方案中，本發(fā)明提供了制品，其包含本發(fā)明的制品的組合或多個本發(fā)明的制品。在替代性實施方案中，本發(fā)明的制品另外包含基質(zhì)表面，所述基質(zhì)表面是由包含以下步驟的方法制造:點樣或印刷能夠促進、啟動和/或維持細胞粘附的一種或多種組合物于多個點、印記或受限區(qū)域，且任選地，能夠促進、啟動和/或維持細胞粘附的一種或多種組合物包含一種或多種細胞外基質(zhì)蛋白，或分子的細胞外基質(zhì)狀組合物或混合物，例如纖維狀蛋白和糖胺聚糖(GAG)的聯(lián)鎖網(wǎng)狀物，或蛋白聚糖(PG)、硫酸乙酰肝素(HS)、硫酸軟骨素(CS)、硫酸角質(zhì)素(KS)、透明質(zhì)酸、膠原蛋白、彈性蛋白、纖維粘連蛋白、層粘蛋白、細胞粘附分子(CAM)或CAM配體、整合素、鈣粘附蛋白、選凝素、地址素或其混合物或其等同物，或其混合物或其等同物。在替代性實施方案中，本發(fā)明的制品另外包含將細胞或多個細胞放置或點樣或印刷到多個點、印記或受限區(qū)域上，所述多個點、印記或受限區(qū)域上已經(jīng)層覆有能夠促進、啟動和/或維持細胞粘附的一種或多種組合物，例如細胞外基質(zhì)組分，包括蛋白質(zhì)和/或多糖，和/或分子的細胞外基質(zhì)狀組合物或混合物，例如纖維狀蛋白和糖胺聚糖(GAG)的聯(lián)鎖網(wǎng)狀物，或蛋白聚糖(PG)、硫酸乙酰肝素(HS)、硫酸軟骨素(CS)、硫酸角質(zhì)素(KS)、透明質(zhì)酸、膠原蛋白、彈性蛋白、纖維粘連蛋白、層粘蛋白、細胞粘附分子(CAM)或CAM配體、整合素、鈣粘附蛋白、選凝素、地址素或其混合物或其等同物，或其混合物或其等同物。在替代性實施方案中，用于確定化合物、藥物、小分子或小分子藥物對于細胞是否具有任何或期望作用或細胞反應(yīng)的本發(fā)明方法包括:(a)測量或觀察根據(jù)權(quán)利要求1到5中任一權(quán)利要求所述的(“測試”)制品(例如陣列、微陣列)(其中制品包含化合物、藥物、小分子或小分子藥物)上的細胞(例如對于細胞的任何或期望作用或細胞反應(yīng))，和任選地比較“對照”制品上的相同細胞，所述“對照”制品與根據(jù)權(quán)利要求1到5中任一權(quán)利要求所述的制品相同，但“對照”制品:不包含化合物、藥物、小分子或小分子藥物；包含不同的化合物、藥物、小分子或小分子藥物；包含已知對于細胞具有不同作用的化合物、藥物、小分子或小分子藥物；或包含與“測試”制品上的相同但濃度不同的化合物、藥物、小分子或小分子藥物；(b) (a)的方法，其中對于細胞的任何或期望作用或細胞反應(yīng)包括細胞死亡(例如細胞凋亡)、分泌生物分子(例如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖、核酸等)、增殖(例如有絲分裂)、細胞-細胞相互作用、細胞表面多肽周轉(zhuǎn)或再循環(huán)、囊泡釋放、膜去極化、離子(例如鈉、鈣或鉀)細胞內(nèi)波動或跨越細胞膜移動等。本發(fā)明的一個或多個實施方案的細節(jié)闡述于附圖和以下具體實施方式
中。根據(jù)具體實施方式
和附圖且根據(jù)權(quán)利要求書，本發(fā)明的其它特征、目標和優(yōu)勢將顯而易見。本文引用的所有公開案、專利、專利申請都以引用的方式明確并入本文中以用于所有目的。


本文所闡述的圖式用于說明本發(fā)明的實施方案且不打算限制由權(quán)利要求書涵蓋的本發(fā)明的范圍。
圖1圖示說明了如以下實施例1中所討論的用于制造本發(fā)明的示例性小分子微陣列的示例性方案。圖2圖示說明了如以下實施例1中所討論的用于制造本發(fā)明的示例性小分子微陣列的示例性方案。圖3圖示說明了用于將小分子粘附到本發(fā)明的制品上的示例性方案，其中如以下實施例1中所討論，將所述分子印刷到位于聚丙烯酰胺凝膠基質(zhì)上方的第一層上所展現(xiàn)的微陣列中。圖4說明了本發(fā)明的示例性組合物(制品)，其中A和B中的頭兩行點是被固定的熒光小分子點，其中第二個兩行是未固定的；如以下實施例1中所討論，圖4A說明了在介質(zhì)溶液中浸沒前的熒光小分子，且圖4B說明了在介質(zhì)溶液中浸沒10分鐘(min)后的熒光小分子。圖5說明了本發(fā)明的示例性組合物(制品)，其中如以下實施例1中所討論，在浸沒于介質(zhì)溶液中的同時在不同時間點對被固定的小分子微陣列的熒光強度進行成像(圖5A)，然后對熒光強度的變化作圖(如圖5B中圖示說明)。圖6說明了本發(fā)明的示例性組合物(制品)，其中如以下實施例1中所討論，以各種濃度將熒光抗癌藥物阿霉素(doxorubicin)(如圖6B所說明)印刷到示例性微陣列中(如圖6A所說明)。各個圖式中的相同參考符號表不相同兀件?，F(xiàn)在將詳細參考本發(fā)明的各個示例性實施方案，其實施例在附圖中加以說明。提供以下詳細說明以便于讀者更好地理解本發(fā)明的方面和實施方案的某些細節(jié)，且不應(yīng)被解釋成對本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制。
具體實施例方式在替代性實施方案中，本發(fā)明提供了包含陣列或微陣列或由陣列或微陣列組成的制品，所述陣列或微陣列包含固體、半固體、凝膠或凝膠狀、膠體或溶膠-凝膠基質(zhì)，所述基質(zhì)基本上包含防止細胞粘附或不能維持細胞粘附的表面、涂層或涂料，且所述表面、涂層或涂料包含能夠粘附一個或多個細胞的多個點或受限區(qū)域。在替代性實施方案中，本發(fā)明提供了包含陣列或微陣列或由陣列或微陣列組成的制品，所述陣列或微陣列包含固體、半固體、凝膠或凝膠狀、膠體或溶膠-凝膠基質(zhì)，所述基質(zhì)基本上包含多個印記或點，其中基本上每個印記或點都包含多層“夾層”，所述夾層包含:固定的小分子(例如藥物)，其任選地埋入聚合物(例如聚合的單體)中(在一個替代性實施方案中，在上面印刷或點樣有小分子的受限區(qū)域或斑塊不具有抑制或不維持或不促進細胞粘附的組合物，例如聚丙烯酰胺或等同物)，所述固定的小分子作為第一層，位于固體、半固體、凝膠或凝膠狀、膠體或溶膠-凝膠表面上，所述表面任選地自身可以層覆有(單層或多層)抑制或不維持或不促進細胞粘附的組合物(例如聚丙烯酰胺或等同物)；和能夠促進、啟動和/或維持細胞粘附的組合物，其作為第二層；和細胞或多個細胞，其作為第三層，其中任選地，細胞是患者的細胞，例如正?；虍惓＜毎?，例如癌細胞。在替代性實施方案中，本發(fā)明包括一種用于將小分子(多種小分子)或其它化合物固定在陣列(例如微陣列)格式中的方法，用于例如使用少量細胞對小分子或其它化合物和其組合的作用進行篩選(例如高通量篩選)。通過操縱用于固定的一種或多種聚合物，可以控制釋放到細胞中的一種或多種小分子的數(shù)量和釋放時間?？蒯寵C制可以通過改變聚合物性質(zhì)(例如聚合和交聯(lián)鏈的量、所用鏈的類型、鏈所產(chǎn)生的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(或網(wǎng)狀陣列)的幾何學、凝膠聚合物的化學性質(zhì)、聚合物的降解和/或具有不同性質(zhì)的聚合物層)來實現(xiàn)。在替代性實施方案中，用于實現(xiàn)控釋機制的其它方法包括納入對釋放藥物的納米膠囊或納米粒子和/或微粒進行固定的方式。在替代性實施方案中，可以鑒別誘導(dǎo)細胞反應(yīng)(例如期望細胞反應(yīng))的一種或多種單獨化合物或化合物混合物。在替代性實施方案中，所誘導(dǎo)的細胞反應(yīng)包括細胞死亡(例如細胞凋亡)、分泌生物分子(例如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖、核酸等)、增殖(例如有絲分裂)、細胞-細胞相互作用、細胞表面多肽周轉(zhuǎn)或再循環(huán)、囊泡釋放、膜去極化等。在替代性實施方案中，本發(fā)明的制品的用途(應(yīng)用)包括:.個體化治療，通過篩選藥物和其組合對于患者的正常、發(fā)育中和/或患病或被感染細胞的作用來進行。.個體化篩選，用于篩選對于患者的正常、發(fā)育中和/或患病或被感染細胞的作用，例如期望作用或不良作用。.使用少量細胞和化合物的高通量小分子篩選。在替代性實施方案中，與常規(guī)方法相比，本發(fā)明的制品的使用可以顯著減少高通量藥物篩選中必需的細胞數(shù)量和小分子化合物的量。舉例來說，在一個實施方案中，本發(fā)明的陣列(例如微陣列)格式對于每個小分子使用大約0.03mm2培養(yǎng)面積，小于大約3mm2的傳統(tǒng)單位培養(yǎng)面積的1/100，因此減少必需的細胞數(shù)量超過100倍。因此，這個實施方案允許使用來自一名患者的有限細胞進行藥物篩選，從而提供個體化治療設(shè)計的基礎(chǔ)。在一個實施方案中，本發(fā)明的陣列(例如微陣列)格式使用量少得多的被篩選化合物，例如每個測試一(I)納升(nl)，或常規(guī)體積一(I)微升(μ I)的1/1000。在替代性實施方案中，本發(fā)明的制品包含控釋機制；例如，可以通過控釋機制來控制化合物暴露于細胞的數(shù)量和時間。在替代性實施方案中，這是通過改變陣列(例如微陣列)聚合物性質(zhì)(例如聚合和交聯(lián)鏈的量、鏈的類型、鏈所產(chǎn)生的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的幾何學、凝膠聚合物的化學性質(zhì)、聚合物的降解、具有不同性質(zhì)的聚合物層等)來進行。在替代性實施方案中，本發(fā)明的制品包含非細胞粘附基質(zhì)、細胞外基質(zhì)蛋白點和“藥物點”;例如，非細胞粘附基質(zhì)可以針對細胞提供虛擬屏障。在一個實施方案中，細胞只存在于細胞外基質(zhì)蛋白點上。這可以提供界限分明的閱讀區(qū)?！八幬稂c”和“細胞外基質(zhì)”點的尺寸可以因為各種目的而不同。在一個實施方案中，單獨點上的細胞是和其它點上的細胞良好隔離的；這防止了細胞從一個點遷移到另一個點或防止點間的相互作用，并且從每個點提供更可靠且獨立性更強的結(jié)果。與先前的小分子微陣列方法相比，這是一個顯著差異。機器人和多孔篩詵本發(fā)明的高通量小分子篩選首先選擇阻止細胞粘附的基質(zhì)。一個實施方案包含涂布有聚丙烯酰胺或水凝膠的載玻片。玻璃表面可以首先使用硅烷進行活化。聚丙烯酰胺或水凝膠可以交聯(lián)到經(jīng)過硅烷活化的載玻片上。涂布有水凝膠的載玻片可以在微陣列印刷之前進行脫水。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明的制品包含涂布有聚丙烯酰胺或水凝膠的載玻片，所述載玻片具有經(jīng)過硅烷活化的表面。接下來，可將化合物或化合物-混合物溶液制備成期望濃度和/或與預(yù)聚物溶液混合或制備到納米封裝粒子中?？梢允褂梦㈥嚵袡C器人將溶液直接印刷到經(jīng)過脫水的凝膠載片上；或可以將化合物/預(yù)聚物或被封裝的化合物溶液印刷到經(jīng)過脫水的凝膠載片上?？梢詫⒓冾A(yù)聚物溶液印刷到化合物/化合物-混合物之上，并且可以誘導(dǎo)聚合以固定化合物。可以設(shè)計各種聚合物化學或封裝，以便具有期望的藥物保持和釋放參數(shù)。在替代性實施方案中，本發(fā)明的制品包含細胞外基質(zhì)蛋白。細胞外基質(zhì)蛋白可以印刷到化合物陣列之上，從而允許細胞粘附。在替代性實施方案中，將細胞接種到陣列上，例如具有細胞外基質(zhì)蛋白表面的陣列。在替代性實施方案中，陣列點上的細胞可以粘附于細胞外基質(zhì)蛋白表面。可以通過任何手段來鑒別誘導(dǎo)期望細胞反應(yīng)的單獨化合物或化合物混合物。所述反應(yīng)可以包括(但不限于)細胞死亡(例如細胞凋亡)、分泌生物分子(例如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖、核酸等)、增殖(例如有絲分裂)、細胞-細胞相互作用、細胞表面多肽周轉(zhuǎn)或再循環(huán)、囊泡釋放、膜去極化、離子(例如鈉、鈣或鉀)細胞內(nèi)波動或跨越細胞膜移動等。在替代性實施方案中，表面、涂層或涂料包含能夠粘附一個或多個細胞的多個點或受限區(qū)域，且這些點或受限區(qū)域可以通過例如基質(zhì)圖案化，例如通過光學產(chǎn)生可反應(yīng)的點的陣列，來制造。舉例來說，在一個實施方案中，用有機娃燒來洗漆玻璃板，所述有機娃燒吸附到玻璃上以涂布玻璃。用通過光學掩模的遠紫外光或用界定陣列圖案的微鏡陣列來照射有機硅烷涂層。照射使S1--C鍵裂解，形成反應(yīng)性Si自由基。與水的反應(yīng)導(dǎo)致Si自由基形成極性硅醇 基團。極性硅醇基團構(gòu)成陣列上的點，且可被另外修飾以將其它可反應(yīng)分子偶合到點上，如例如美國專利號(USPN) 5，324，591和6，653，124中所公開。舉例來說，含生物官能團(例如游離氨基部分)的硅烷可以和硅醇基團反應(yīng)。游離氨基是用作生物分子(例如細胞外基質(zhì)蛋白，或分子的細胞外基質(zhì)狀組合物或混合物)的共價粘附的位點。在另一個實施方案中，表面、涂層或涂料包含能夠粘附一個或多個細胞的多個點或受限區(qū)域，且這些點或受限區(qū)域可以通過例如在基質(zhì)上形成基本上規(guī)則的結(jié)構(gòu)陣列(如例如USPN6，649，491中所述)來制造，其中將第一材料的表面層放置在第二材料的基質(zhì)上，且表面層足夠薄，因而表面層與基質(zhì)的界面處的應(yīng)力場導(dǎo)致形成分離區(qū)域；將粒子束以對應(yīng)的銳角引導(dǎo)到表面層上以影響分離區(qū)域的對準方向和/或相鄰分離區(qū)域的相對位置。通過將粒子束引導(dǎo)到表面層上，規(guī)定了分離區(qū)域的對準方向和/或相鄰分離區(qū)域的相對位置，這提供了可以在表面上形成具有高度規(guī)則性的納米級結(jié)構(gòu)的優(yōu)點。參考以下實施例進一步描述本發(fā)明，然而，應(yīng)理解本發(fā)明不受限于所述實施例。實施例
_9] 實施例1:制造本發(fā)明的陣列和i正明其功效本文呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)證明了用于制造本發(fā)明的陣列(例如小分子微陣列)的方法。在替代性實施方案中，本發(fā)明提供了小分子微陣列，其可用于例如患者特異性藥物篩選和低成本藥物篩選等領(lǐng)域中的藥物篩選中。下文描述產(chǎn)生這類小分子微陣列的方法和獲得的數(shù)據(jù)。在替代性實施方案中，為了篩選微陣列上的細胞反應(yīng)，細胞應(yīng)當只存在于微陣列點上以便清楚讀出。一種方法是使用具有防止細胞粘附的表面的微陣列基質(zhì)。涂布有聚丙烯酰胺的載玻片是一個選擇。因為細胞篩選在溶液中進行，所以小分子需要被固定以防止溶解在介質(zhì)溶液中。本文描述了示例性方法。在圖1所說明的替代性實施方案中，將小分子藥物和單體溶液混合；然后將藥物-單體混合物點樣到陣列格式的基質(zhì)上；然后誘導(dǎo)單體的聚合過程，從而形成固定小分子的聚合物凝膠。在圖2所說明的替代性實施方案中，首先將小分子藥物溶液印刷到基質(zhì)上的微陣列中。將單體溶液印刷到每個藥物點之上。然后誘導(dǎo)聚合過程以覆蓋和固定小分子藥物。在一個實施方案中，在小分子藥物被固定到微陣列格式中之后，將細胞粘附材料印刷到每個點之上。細胞外基質(zhì)蛋白或分子的細胞外基質(zhì)狀組合物或混合物(例如纖維狀蛋白和糖胺聚糖(GAG)的聯(lián)鎖網(wǎng)狀物，或蛋白聚糖(PG)、硫酸乙酰肝素(HS)、硫酸軟骨素(CS)、硫酸角質(zhì)素(KS)、透明質(zhì)酸、膠原蛋白、彈性蛋白、纖維粘連蛋白、層粘蛋白、細胞粘附分子(CAM)或CAM配體、整合素、鈣粘附蛋白、選凝素、地址素或其混合物或其等同物，或其混合物或其等同物)都是替代性的示例性選擇。在圖3所說明的替代性實施方案中，將小分子藥物印刷到位于聚丙烯酰胺凝膠基質(zhì)上方的第一層上所展現(xiàn)的微陣列中。將細胞外基質(zhì)(ECM)蛋白、或蛋白和GAG的混合物、或蛋白聚糖(PG)、硫酸乙酰肝素(HS)、硫酸軟骨素(CS)、硫酸角質(zhì)素(KS)、透明質(zhì)酸、膠原蛋白、彈性蛋白、纖維粘連蛋白、層粘蛋白、細胞粘附分子(CAM)或CAM配體、整合素、鈣粘附蛋白、選凝素、地址素或其混合物或其等同物、或其混合物或其等同物點樣到每個藥物點上。然后將細胞接種到微陣列上。因為未點樣的聚丙烯酰胺表面不允許細胞粘附，所以細胞只存在于每個點上。在圖4所說明的替代性實施方案中，A和B中的頭兩行點是被固定的熒光小分子點，其中第二個兩行是未固定的。在介質(zhì)溶液中浸沒10分鐘后，未固定的點(后兩行)損失大部分的突光信號，表明大部分的分子都從點中被去除。另一方面，被固定的點(頭兩行)有效地保留小分子含量，這是通過保留的熒光信號強度來表示。在圖5所說明的替代性實施方案中，在浸沒于介質(zhì)溶液中的同時在不同時間點對被固定的小分子微陣列的熒光強度進行成像(A)。然后對熒光強度的變化作圖(B)。熒光強度的損失表示點中保留的小分子的減少的量。曲線還表明了釋放到溶液中的小分子釋放速率的量。這個速率可以通過例如聚合和交聯(lián)的量、固定聚合物的降解、化學性質(zhì)等各種因素來控制。在圖6所說明的替代性實施方案中，以各種濃度將熒光抗癌藥物阿霉素印刷到微陣列中。在介質(zhì)溶液中浸沒2小時后獲取圖像。已經(jīng)描述了本發(fā)明的許多實施方案。然而，應(yīng)理解可以在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下進行各種修改。因此，其它實施方案屬于以下權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種制品，其包含: 固體、半固體、凝膠或凝膠狀、膠體或溶膠-凝膠基質(zhì)，所述基質(zhì)基本上包含防止或抑制細胞粘附或不能維持細胞粘附的表面、涂層或涂料，且所述表面、涂層或涂料包含能夠粘附一個或多個細胞的多個點或受限區(qū)域， 其中任選地，防止或抑制細胞粘附的所述表面、涂層或涂料包括聚丙烯酰胺或水凝膠、或涂布有聚丙烯酰胺或涂布有水凝膠的表面， 且任選地，包含表面、涂層或涂料的所述固體、半固體、凝膠或凝膠狀、膠體或溶膠-凝膠基質(zhì)的表面是涂布有聚丙烯酰胺或涂布有水凝膠的玻璃或載玻片， 且任選地，涂布有水凝膠的玻璃或載玻片在點樣或印刷之前被脫水， 且任選地，所述固體、半固體、凝膠或凝膠狀、膠體或溶膠-凝膠基質(zhì)包含玻璃或等同物或由玻璃或等同物組成，且任選地，所述聚丙烯酰胺或水凝膠交聯(lián)到經(jīng)過硅烷活化的玻璃或載玻片上； 且任選地，能夠粘附一個或多個細胞的所述多個點或受限區(qū)域包含一種或多種組合物或組合物的混合物，所述組合物能夠促進、啟動和/或維持所述細胞粘附于所述多個點或受限區(qū)域(且任選地，在包含能夠促進、啟動和/或維持所述細胞粘附的所述一種或多種組合物的所述點或受限區(qū)域中，所述一種或多種組合物直接粘附于所述固體、半固體、凝膠或凝膠狀、膠體或溶膠-凝膠基質(zhì)上，而不粘附于防止或抑制細胞粘附的所述表面、涂層或涂料上)， 且任選地，能夠促進、啟動和/或維持所述細胞粘附的所述一種或多種組合物包含一種或多種細胞外基質(zhì)蛋白，或分子的細胞外基質(zhì)狀組合物或混合物，例如纖維狀蛋白和糖胺聚糖(GAG)的聯(lián)鎖網(wǎng)狀物，或蛋白聚糖(PG)、硫酸乙酰肝素(HS)、硫酸軟骨素(CS)、硫酸角質(zhì)素(KS)、透明質(zhì)酸、膠原蛋白、彈性蛋白、纖維粘連蛋白、層粘蛋白、細胞粘附分子(CAM)或CAM配體、整合素、鈣粘附蛋白、選凝素、地址素(addressin)或其混合物或其等同物，或其混合物或其等同物， 且任選地,所述細胞是哺乳動物細胞或人細胞， 且任選地，所述制品包含陣列或微陣列，或由陣列或微陣列組成，或被制造成陣列或微陣列的形式。
2.一種制品，其是通過包括以下步驟的方法制造: (a)提供化合物、藥物、小分子或小分子藥物，和能夠聚合的單體溶液； (b)提供固體、半固體、凝膠或凝膠狀、膠體或溶膠-凝膠基質(zhì)； (c)(i)混合所述化合物、藥物、小分子或小分子藥物與所述單體溶液，且任選地還包括能夠啟動和/或催化所述單體的聚合的第二溶液或組合物(或在所述第二溶液或組合物中混合)，并將混合物點樣或印刷到所述固體、半固體、凝膠或凝膠狀、膠體或溶膠-凝膠基質(zhì)的表面的多個受限區(qū)域(例如點)上，或 ( )將所述化合物、藥物、小分子或小分子藥物點樣或印刷到所述固體、半固體、凝膠或凝膠狀、膠體或溶膠-凝膠基質(zhì)的表面的多個受限區(qū)域(例如點)上，隨后將能夠聚合的單體溶液點樣或印刷到基本上每個被點樣或印刷的化合物、藥物、小分子或小分子藥物點或印記上面(之上)，其中任選地: (3)所述單體溶液起初包含能夠啟動和/或催化所述單體的聚合的第二溶液或組合物，且所述單體溶液在點樣或印刷步驟后發(fā)生聚合， (4)將能夠啟動和/或催化所述單體的聚合的第二溶液或組合物點樣或印刷到基本上每個被點樣或印刷的化合物、藥物、小分子或小分子藥物點或印記上面(之上)，以便啟動或催化所述單體的聚合，或 (iii)將所述化合物、藥物、小分子或小分子藥物點樣或印刷到所述固體、半固體、凝膠或凝膠狀、膠體或溶膠-凝膠基質(zhì)的表面的多個受限區(qū)域(例如點)上，并通過外部來源，例如通過暴露于光輻射如紫外光或熱量誘導(dǎo)所述單體溶液發(fā)生聚合； 其中任選地，每種化合物、藥物、小分子或小分子藥物的受限區(qū)域、點樣區(qū)域或印刷區(qū)域大約介于約0.0lmm2和0.05mm2之間，或大約介于約0.02mm2和0.04mm2之間，或大約為0.03mm2 ； 且任選地，用噴墨打印機或等同物或液體處理機器人進行所述混合物或單體的所述點樣或印刷， 且任選地，將所述化合物、藥物、小分子或小分子混合物溶液制備成期望濃度和/或與預(yù)聚物溶液混合或制備到封裝脂質(zhì)、脂質(zhì)體或粒子或納米封裝粒子中， 且任選地，可以使用微陣列機器人將溶液直接印刷到經(jīng)過脫水的凝膠載片上；或可以將所述化合物、藥物、小分子或小分子藥物/預(yù)聚物或被封裝的化合物、藥物、小分子或小分子藥物溶液印刷到經(jīng)過脫水的凝膠載片上， 且任選地，所述制品包含陣列或微陣列，或由陣列或微陣列組成，或被制造成陣列或微陣列的形式。
3.一種制品，其包含根據(jù)權(quán)利要求1和/或權(quán)利要求2所述的制品的組合，或多個根據(jù)權(quán)利要求1和/或權(quán)利要求2所述的制品。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制品，其另外包含基質(zhì)表面，所述基質(zhì)表面是由包括以下步驟的方法制造:點樣或印刷能夠促進、啟動和/或維持所述細胞粘附的一種或多種組合物于多個點、印記或受限區(qū)域，且任選地，能夠促進、啟動和/或維持所述細胞粘附的所述一種或多種組合物包含一種或多種細胞外基質(zhì)蛋白，或分子的細胞外基質(zhì)狀組合物或混合物，例如纖維狀蛋白和糖胺聚糖(GAG)的聯(lián)鎖網(wǎng)狀物，或蛋白聚糖(PG)、硫酸乙酰肝素(HS)、硫酸軟骨素(CS)、硫酸角質(zhì)素(KS)、透明質(zhì)酸、膠原蛋白、彈性蛋白、纖維粘連蛋白、層粘蛋白、細胞粘附分子(CAM)或CAM配體、整合素、鈣粘附蛋白、選凝素、地址素或其混合物或其等同物，或其混合物或其等同物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制品，其另外包含將細胞或多個細胞放置或點樣或印刷到所述多個點、印記或受限區(qū)域上，所述多個點、印記或受限區(qū)域上已經(jīng)層覆有能夠促進、啟動和/或維持所述細胞粘附的一種或多種組合物。
6.一種用于確定化合物、藥物、小分子或小分子藥物對于細胞是否具有任何或期望作用或細胞反應(yīng)的方法，其包括: (a)測量或觀察根據(jù)權(quán)利要求1到5中任一權(quán)利要求所述的(“測試”)制品(例如陣列、微陣列)(其中所述制品包含化合物、藥物、小分子或小分子藥物)上的細胞(例如對于所述細胞的任何或期望作用或細胞反應(yīng))， 和任選地比較“對照”制品上的相同細胞，所述“對照”制品與根據(jù)權(quán)利要求1到5中任一權(quán)利要求所述的制品相同，但所述“對照”制品:不包含化合物、藥物、小分子或小分子藥物；包含不同的化合物、藥物、小分子或小分子藥物；包含已知對于所述細胞具有不同作用的化合物、藥物、小分子或小分子藥物；或包含與所述“測試”制品上的相同但濃度不同的化合物、藥物、小分子或小分子藥物； (b)(a)的方法,其中對于細胞的所述任何或期望作用或細胞反應(yīng)包括細胞死亡(例如細胞凋亡)、分泌生物分子(例如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖、核酸等)、增殖(例如有絲分裂)、細胞-細胞相互作用、細胞表面多肽周轉(zhuǎn)或再循環(huán)、囊泡釋放、膜去極化、離子(例如鈉、鈣或鉀)細胞內(nèi)波動或跨越細胞膜移動等。 ·
全文摘要
在替代性實施方案中，本發(fā)明提供了例如陣列或微陣列等制品，其包含細胞和化合物(例如小分子或藥物)，用于例如藥物篩選或毒性測試。
文檔編號G01N33/68GK103180729SQ201180050827
公開日2013年6月26日 申請日期2011年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月20日
發(fā)明者滕大愚, 錢煦, S·柯斯里, 江鵬斐 申請人:加利福尼亞大學董事會