專利名稱：組織學(xué)樣品中單個靶標(biāo)分子的定量的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于使用免疫化學(xué)手段來對樣品中的固定靶標(biāo)進(jìn)行可視化和定量的領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及對免疫染色的組織學(xué)樣品中的分子靶標(biāo)進(jìn)行定量的方法和試劑，以及所述方法和試劑在醫(yī)學(xué)診斷中的用途。
背景技術(shù)：
在免疫組織化學(xué)即IHC的領(lǐng)域中，通常使用酶法產(chǎn)生的染料對感興趣的生物靶標(biāo)進(jìn)行染色。然而，大多數(shù)現(xiàn)今的IHC酶體系由于受限的靈敏度而對靶標(biāo)可視化具有有限可用性:如果靶標(biāo)具有很低的豐度，則無法檢測出沉積的染料的量。同樣地，存在檢測上限，在該檢測上限之上時，進(jìn)一步的染料沉積不會引起可檢測的更強(qiáng)烈的染色。使用較低濃度的試劑，檢測上限可以折衷以允許高豐度靶標(biāo)與很高豐度靶標(biāo)之間的區(qū)別；然而，這也會引起檢測下限的增加，即檢測靈敏度的喪失。因此，大多數(shù)現(xiàn)今的體系具有有限的檢測動態(tài)范圍。此外，來自相同或不同供應(yīng)商的不同可視化體系之間的靈敏度差異使得難以比較染色結(jié)果。由于染料沉積不是靶標(biāo)濃度的線性函數(shù)，因此對免疫化學(xué)染色的靶標(biāo)的定量是另一挑戰(zhàn)。在檢測限的基線附近，強(qiáng)度作為靶標(biāo)濃度的直接函數(shù)迅速增加(從沒有可檢測的信號變化到信號，甚至具有低強(qiáng)度的信號，表示無限的增加)。相反，接近檢測上限時，甚至靶標(biāo)濃度的大量增加也幾乎不引起已經(jīng)很強(qiáng)的信號的可察覺的增加。另一困難來自于以下事實，即沒有國際公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)品存在，并且難以制備不變的參考樣品。即使同一組織樣品的連續(xù)切片也通常表現(xiàn)出生物變異。永生細(xì)胞系原則上可以提供無限的參考材料，然而在這種情況下培養(yǎng)條件、細(xì)胞循環(huán)周期和生物變異的不同也將引起靶標(biāo)表達(dá)的某些批次間差異。用肽或蛋白質(zhì)化學(xué)修飾的載玻片可以用作替代靶標(biāo)，然而與組織樣品的比較不直接。因此，需要生物樣品中固定靶標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化定量檢測。近來描述的一種對生物樣品(包括組織學(xué)樣品)中單個單元的固定靶標(biāo)進(jìn)行免疫化學(xué)染色的方法(PCT/DK2010/000137)提供了一種可視化體系，特征在于極度的靈敏度(即，可以使單個分子可視化并對其進(jìn)行檢測)以及靶標(biāo)表達(dá)的整個動態(tài)范圍內(nèi)的沉積染料量與靶標(biāo)表達(dá)的線性相關(guān)。本發(fā)明利用PCT/DK2010/000137體系的可視化潛力，并提供用于精確定量樣品(具體是生物樣品)中固定靶標(biāo)的方法，包括對特定靶標(biāo)分子的絕對數(shù)量的評估。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及對其中靶標(biāo)固定的樣品(例如，組織學(xué)樣品)中的靶標(biāo)(例如，分子靶標(biāo))進(jìn)行定量的方法，執(zhí)行該方法的試劑，利用該方法和試劑的檢定，以及該方法和檢定在醫(yī)學(xué)診斷和治療中的應(yīng)用。本發(fā)明的一個方面涉及用于對樣品中存在的靶標(biāo)進(jìn)行定量的方法，其中所述靶標(biāo)是固定的，該方法包括(a)將包括靶標(biāo)的單獨(dú)單元的群體的樣品與一種或多種結(jié)合劑孵育，其中(i)至少一種結(jié)合劑能夠與靶標(biāo)的單個單獨(dú)單元特異結(jié)合，且(ii)至少一種結(jié)合劑包括酶，且(ill) (i)或(ii)的至少一種結(jié)合劑對其在樣品中的結(jié)合配偶體的結(jié)合親和性是已知的，從而形成具有祀標(biāo)的單獨(dú)單個單元的部分子群(sub-population)的一個或多個離散的單個靶標(biāo)部位(target site)，其中各個離散的單個靶標(biāo)部位包括單獨(dú)單個單元的所述部分子群的一個單獨(dú)單元以及一種或多種結(jié)合劑的復(fù)合物，其中至少一種結(jié)合劑包括酶；(b)使包括酶的離散的單個靶標(biāo)部位可視化為視覺上明顯的點；(c)對視覺上明顯的點進(jìn)行定量，評估樣品中靶標(biāo)的量。在不同的實施方式中，可以由樣品中存在的靶標(biāo)的單個單獨(dú)單元的大部分或小部分形成靶標(biāo)部位。本發(fā)明的另一個方面涉及一種用于對樣品中存在的靶標(biāo)進(jìn)行定量的方法，其中所述靶標(biāo)是固定的，包括(a)將包括靶標(biāo)的單獨(dú)單元的群體的樣品與一種或多種結(jié)合劑孵育，其中( i )至少一種結(jié)合劑能夠與靶標(biāo)的單個單獨(dú)單元特異結(jié)合，且(ii)至少一種結(jié)合劑包括酶，從而形成具有靶標(biāo)的單獨(dú)單個單元的預(yù)定部分子群的一個或多個離散的單個靶標(biāo)部位，其中各個離散的單個靶標(biāo)部位包括包括單獨(dú)單個單元的所述部分子群的一個單獨(dú)單元以及一種或多種結(jié)合劑的復(fù)合物，其中至少一種結(jié)合劑包括酶；(b)使包括酶的離散的單個靶標(biāo)部位可視化為視覺上明顯的點；(c)對視覺上明顯的點進(jìn)行定量，(d)評估樣品中靶標(biāo)的量。在一些實施方式中，后一方法可以包括以下步驟:(a)將樣品與第一結(jié)合劑孵育，其中(i)所述第一結(jié)合劑能夠與靶標(biāo)的單個單獨(dú)單元特異結(jié)合并使樣品中的所有結(jié)合位點(binding site)基本上飽和；且(ii)預(yù)定部分的所述第一結(jié)合劑包括酶，從而形成離散的單個靶標(biāo)部位，各個靶標(biāo)部位包括靶標(biāo)的單個單獨(dú)單元和結(jié)合齊U，其中一部分的所述離散的單個靶標(biāo)部位包括含有酶的第一結(jié)合劑；(b)使包括酶的離散的單個靶標(biāo)部位可視化為視覺上明顯的點；(c)對視覺上明顯的點進(jìn)行定量，(d)評估樣品中靶標(biāo)的含量。在其它實施方式中，方法可以包括以下步驟:
(a)將樣品與第一和第二結(jié)合劑孵育，其中(i)第一結(jié)合劑能夠與靶標(biāo)的單個單獨(dú)單元特異結(jié)合并使樣品中的所有結(jié)合位點基本上飽和；且(ii)第二結(jié)合劑能夠與第一結(jié)合劑特異結(jié)合且預(yù)定部分的所述第二結(jié)合劑包括酶，從而形成離散的單個靶標(biāo)部位，各個靶標(biāo)部位包括靶標(biāo)的單個單獨(dú)單元、第一結(jié)合劑和第二結(jié)合劑，其中一部分所述離散的單個靶標(biāo)部位包括含有酶的結(jié)合劑；(b)使包括酶的離散的單個靶標(biāo)部位可視化為視覺上明顯的點；(c)對視覺上明顯的點進(jìn)行定量，( d )評估樣品中靶標(biāo)的量?？梢愿鶕?jù)近來描述的對樣品中固定靶標(biāo)的單個單獨(dú)單元進(jìn)行可視化的方法(參見PCT/DK2010/000137)或如本文中所描述地進(jìn)行對本發(fā)明的離散靶標(biāo)部位的可視化。本發(fā)明的可視化方法允許識別靶標(biāo)的基本上每個單個單元，并由此可以確定靶標(biāo)在樣品中的絕對或相對量。靶標(biāo)的絕對和相對量可以確定為樣品中單個靶標(biāo)單元的總數(shù)量或相對于一些標(biāo)記物的數(shù)量。這些方法可以適用于任何包括靶標(biāo)的樣品，該靶標(biāo)可由對該靶標(biāo)具有親和性的結(jié)合劑檢測出，其中靶標(biāo)是固定在固體支承物中/上。因此，通過本發(fā)明的方法能夠檢測并精確定量幾乎任何固定的靶標(biāo)，例如分子、顆?；蛭⑸?。通過使用特定的靶標(biāo)可視化技術(shù)并使用限定明確的用于靶標(biāo)檢測的結(jié)合劑(兩者的具體信息在下文中說明)來在本發(fā)明方法中保證靶標(biāo)的精確定量。本發(fā)明的方法特別有利于復(fù)雜組織學(xué)樣品中靶標(biāo)的精確定量，例如，用于診斷或治療靶標(biāo)例如生長因子受體例如Her2等的定量，因此，它們在診斷和治療應(yīng)用中的效用不能被過高估計。這些方法對手動和自動評估樣品中靶標(biāo)的精確量的適用性可以作為這些方法的額外有價值的特征進(jìn)行描述。用于本發(fā)明中的可視化體系還允許使同一樣品中兩種或更多種不同靶標(biāo)可視化(詳情參見W02011047680)，因此，可以使用本發(fā)明的方法來進(jìn)行一個樣品中兩種或更多種革巴標(biāo)的絕對或相對定量。此外，本發(fā)明的方法可用于允許使組織學(xué)和其它樣品中固定靶標(biāo)的單個單元可視化的任何體系，其中所述體系包括使用對樣品中結(jié)合配偶體具有特異親和性的結(jié)合劑的步驟。在本發(fā)明的方法中，可有利的是使用由可用于樣品中固定靶標(biāo)單元的可視化的試劑構(gòu)成的試劑盒，具體地本發(fā)明涉及包括能夠與結(jié)合配偶體特異結(jié)合的結(jié)合劑的試劑盒，其中預(yù)定部分的所述結(jié)合劑包括酶。本發(fā)明試劑盒的一些非限制性實施方式包括作為特異結(jié)合對成員的結(jié)合劑，例如，抗體或核酸；結(jié)合配偶體，其為樣品中的靶標(biāo)；結(jié)合配偶體，其為另一結(jié)合劑，例如，其中另一結(jié)合劑為能夠與樣品中靶標(biāo)結(jié)合的結(jié)合劑；靶標(biāo)，其為生物或化學(xué)靶標(biāo)分子、顆粒、分子或細(xì)胞復(fù)合物、分子或細(xì)胞結(jié)構(gòu)、病毒或微生物、或所述靶標(biāo)分子、顆粒、復(fù)合物、結(jié)構(gòu)、病毒或微生物的片段；酶，其為具有氧化還原酶活性的酶，例如具有過氧化物酶或酚氧化酶活性的酶，例如辣根過氧化物酶(HRP)等。在一個實施方式中，本發(fā)明的試劑盒可以包括參考樣品，其中靶標(biāo)的單個單元的量是預(yù)定的，例如，表達(dá)特定蛋白的參考細(xì)胞系，其中蛋白分子的數(shù)量是預(yù)定的。在一個方面，本發(fā)明涉及一種用于在個體中診斷或預(yù)測疾病、或用于預(yù)測治療處理的效力的方法，包括根據(jù)本發(fā)明方法在從所述個體得到的樣品中對與所述疾病或所述治療處理相關(guān)的生物標(biāo)記物的量進(jìn)行評估的步驟。診斷和治療應(yīng)用可以包括，但不限于，對作為疾病生物標(biāo)記物的分子靶標(biāo)進(jìn)行檢測和定量，例如，得知不同生長因子受體例如Her2FGFR等的水平已經(jīng)顯示出對癌癥的診斷和治療是重要的，且對治療處理的特定療程進(jìn)行確定在如今越來越基于疾病生物標(biāo)記物定
量的結(jié)果。


圖1示出根據(jù)傳統(tǒng)HRP-DAB法(B)和根據(jù)本發(fā)明(A)的組織學(xué)片子的示例性染色。圖2示出在靶標(biāo)部位處形成視覺上明顯的點的示意圖。圖3示出根據(jù)本發(fā)明可視化方法的Her陽性細(xì)胞的免疫染色結(jié)果:
a.0+Herceptest對照細(xì)胞系的IOX圖像的單色分割，每個圖像識別21個點(黑色)；
b.1+Herceptest對照細(xì)胞系的IOX圖像的單色分害I]，每個圖像識別36個點(黑色)；
c.3+Herceptest對照細(xì)胞系的IOX圖像的單色分割,每個圖像識別2567個點(黑色);d.乳房癌的IOX圖像的雙色分割，點為白，核為黑，背景為灰；e.3+Herc印test對照細(xì)胞系的IOX圖像的雙色分割，點為黑，核為白，背景為灰(與c相同的樣品)。圖4 7是相應(yīng)于實驗12.1、12.3a、12.3b和12.3c的表I 4的結(jié)果的圖示(詳情參見相應(yīng)描述)。
具體實施例方式基本而言，本發(fā)明涉及包括對樣品中存在的靶標(biāo)進(jìn)行檢測、可視化和定量的方法，其中靶標(biāo)是固定的。具體而言，本發(fā)明涉及在生物樣品中對單個分子靶標(biāo)進(jìn)行可視化及其定量的方法，然而，本發(fā)明的方法并不限制于生物樣品或分子靶標(biāo)，其可從以下討論中明顯得出。本發(fā)明的一個方面涉及一種用于對樣品中存在的靶標(biāo)進(jìn)行定量的方法，其中所述靶標(biāo)是固定的，包括(a)將包括靶標(biāo)的單獨(dú)單元的群體的樣品與一種或多種結(jié)合劑孵育，其中(i)至少一種結(jié)合劑能夠與靶標(biāo)的單個單獨(dú)單元特異結(jié)合，并且(ii)至少一種結(jié)合劑包括酶，并且(ill) (i)或(ii)的至少一種結(jié)合劑對其在樣品中的結(jié)合配偶體的結(jié)合親和性是已知的，從而形成具有靶標(biāo)的單獨(dú)單個單元的部分子群的一個或多個離散的單個靶標(biāo)部位，其中各個離散的單個靶標(biāo)部位包括靶標(biāo)的一個單獨(dú)單元以及一種或多種結(jié)合劑的復(fù)合物，其中至少一種結(jié)合劑包括酶；(b)使離散的單個靶標(biāo)部位可視化為視覺上明顯的點；(c)對視覺上明顯的點進(jìn)行定量，
( d )評估革巴標(biāo)的量。在不同的實施方式中，靶標(biāo)部位可以形成為具有樣品中存在的靶標(biāo)的單個單獨(dú)單兀的大部分或小部分。本發(fā)明的另一個方面涉及一種用于對樣品中存在的靶標(biāo)進(jìn)行定量的方法，其中所述靶標(biāo)是固定的，包括(a)將包括靶標(biāo)的單獨(dú)單元的群體的樣品與一種或多種結(jié)合劑孵育，其中( i )至少一種結(jié)合劑能夠與靶標(biāo)的單個單獨(dú)單元特異結(jié)合，且(ii)至少一種結(jié)合劑包括酶，從而形成具有靶標(biāo)的單獨(dú)單個單元的預(yù)定部分子群的一個或多個離散的單個靶標(biāo)部位，其中各個離散的單個靶標(biāo)部位包括單獨(dú)單個單元的所述部分子群的一個單獨(dú)單元以及一種或多種結(jié)合劑的復(fù)合物，其中至少一種結(jié)合劑包括酶；(b)使包括酶的離散的單個靶標(biāo)部位可視化為視覺上明顯的點；(c)對視覺上明顯的點進(jìn)行定量，(d)評估樣品中靶標(biāo)的量。在一些實施方式中，后一方法可以包括以下步驟:(a)將樣品與第一結(jié)合劑孵育，其中(i)所述第一結(jié)合劑能夠與靶標(biāo)的單個單獨(dú)單元特異結(jié)合并使樣品中的所有結(jié)合位點基本上飽和；且(ii)預(yù)定部分的所述第一結(jié)合劑包括酶，從而形成離散的單個靶標(biāo)部位，各個靶標(biāo)部位包括靶標(biāo)的單個單獨(dú)單元和結(jié)合齊U，其中一部分所述離散的單個靶標(biāo)部位包括含有酶的第一結(jié)合劑；(b)使包括酶的離散的單個靶標(biāo)部位可視化為視覺上明顯的點；(c)對視覺上明顯的點進(jìn)行定量，( d )評估樣品中靶標(biāo)的量。在其它實施方式中，方法可以包括以下步驟:(a)將樣品與第一和第二結(jié)合劑孵育，其中(i)第一結(jié)合劑能夠與靶標(biāo)的單個單獨(dú)單元特異結(jié)合并使樣品中的所有結(jié)合位點基本上飽和；且(ii)第二結(jié)合劑能夠與第一結(jié)合劑特異結(jié)合且預(yù)定部分的所述第二結(jié)合劑包括酶，從而形成離散的單個靶標(biāo)部位，各個靶標(biāo)部位包括靶標(biāo)的單個單獨(dú)單元、第一結(jié)合劑和第二結(jié)合劑，其中一部分所述離散的單個靶標(biāo)部位包括含有酶的結(jié)合劑；(b)使包括酶的離散的單個靶標(biāo)部位可視化為視覺上明顯的點；(c)對視覺上明顯的點進(jìn)行定量，(d)評估樣品中靶標(biāo)的含量。使用本發(fā)明的任何方法，在不同的優(yōu)選實施方式中，靶標(biāo)的量可以評估為樣品中靶標(biāo)的部分量(與樣品中單獨(dú)單個靶標(biāo)單元的部分子群相應(yīng))；評估為樣品中靶標(biāo)的總量(或單獨(dú)單個祀標(biāo)單元的總量)(在本文中也稱為“絕對量”)；評估為祀標(biāo)的相對量(祀標(biāo)或靶標(biāo)的單個單元相對于另一靶標(biāo)、參考標(biāo)記物等的相對量)。根據(jù)本發(fā)明，可以手動評估根據(jù)本發(fā)明染色的樣品中的靶標(biāo)的量，S卩，可以通過觀測者使用可得的顯微鏡來對點進(jìn)行計數(shù)。在其它實施方式中，可以使用可得的本領(lǐng)域軟件來自動采集和處理染色樣品的圖像。在實施例部分中描述染色樣品的處理的一些非限制性實例。在一個實施方式中，可以使用本發(fā)明的試劑盒對樣品中的靶標(biāo)進(jìn)行可視化并對靶標(biāo)量進(jìn)行評估。包括對樣品中固定靶標(biāo)進(jìn)行定量的部件的試劑盒是本發(fā)明的另一方面。具體而言，在一個實施方式中，本發(fā)明的試劑盒可以包括作為結(jié)合分子混合物的結(jié)合劑，其中預(yù)定部分的所述結(jié)合分子標(biāo)記有酶。在其它實施方式中，本發(fā)明的試劑盒可以包括權(quán)利要求中包括的任何試劑且任選地包括使用說明。在一個實施方式中，本發(fā)明的試劑盒可以包括參考樣品，其中靶標(biāo)的單個單元的量是預(yù)定的，例如，表達(dá)特定蛋白質(zhì)的參考細(xì)胞系，其中蛋白分子的數(shù)量是預(yù)定的。本發(fā)明的一個方面是用于診斷或預(yù)測疾病、或用于預(yù)測治療處理在個體中的效力的方法，其中所述方法包括根據(jù)本發(fā)明的方法在從所述個體得到的樣品中對與所述疾病或所述治療處理相關(guān)的生物標(biāo)記物的量進(jìn)行評估的步驟。因此，本發(fā)明的試劑盒可以用作為診斷試劑盒的一部分。診斷和治療應(yīng)用可以包括但不限于對作為疾病的生物標(biāo)記物的分子靶標(biāo)進(jìn)行檢測和定量，例如，得知不同生長因子受體例如Her2FGFR等的水平已經(jīng)顯示出對于癌癥的診斷和治療是重要的，并且現(xiàn)在對治療處理的特定療程的確定越來越基于疾病生物標(biāo)記物定量的結(jié)果。因此，本發(fā)明的試劑盒可以包括說明，其教導(dǎo)使用者如何將根據(jù)本發(fā)明的方法在樣品中確定的生物標(biāo)記物的量與相關(guān)疾病的診斷、預(yù)測或治療相關(guān)聯(lián)。在以下以及實施例部分中詳細(xì)討論本發(fā)明的以上和其它方面以及非限制性實施方式。術(shù)語“樣品”是指來自較大的整體或群組的代表性部分或單一項、推測含有將要檢測的靶標(biāo)的物質(zhì)或?qū)ο蟮牧炕虿糠?，例如，包括將要分析的靶?biāo)分子、顆粒、結(jié)構(gòu)的生物、化學(xué)、環(huán)境材料的部分或量，例如活檢樣品、食物樣品、土壤樣品等。典型的樣品顯示出物質(zhì)或?qū)ο蟮氖Ｓ嗖糠质鞘裁椿驊?yīng)該是什么等。在一個實施方式中，本發(fā)明的樣品可以是環(huán)境樣品，例如土壤樣品或泄漏物(spillage)樣品。在另一實施方式中，樣品可以是食物樣品。在另一實施方式中，樣品可以是有機(jī)分子庫的一部分。在另一實施方式中，樣品可以是戰(zhàn)爭樣品。在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的樣品是生物樣品。生物樣品可以是:1.包括懸浮細(xì)胞和/或細(xì)胞碎片的樣品，例如，血液樣品、克隆細(xì)胞的懸浮液、身體組織勻漿等；2.包括完整或損壞的動物體細(xì)胞、體組織、涂片或流體的樣品，或腫瘤樣品，例如活檢樣品；其可以是新鮮的組織樣品或保藏的組織樣品，例如福爾馬林固定石蠟包埋的組織樣品；3.包括活有機(jī)體的樣品，例如包括動物、植物、細(xì)菌、真菌等的介質(zhì)的樣品；4.包括病毒顆粒、其碎片、或病毒產(chǎn)物的樣品，例如包括病毒核酸、蛋白質(zhì)、肽等的體涂片；5.包括細(xì)胞器的樣品；6.包括天然或重組生物分子的樣品，例如血漿樣品、條件細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)等；7.包括植物細(xì)胞或其碎片的樣品。生物樣品的上述實施方式是示例性的且用于說明的目的，但不是本發(fā)明的限制?；瘜W(xué)樣品的實例可以通過化學(xué)化合物庫(例如，肽庫)的樣品來示例說明，但是不限制于這些樣品。環(huán)境樣品的實例可以通過土壤、水或空氣樣品和食物樣品來示例說明，但是不限于這些樣品。本發(fā)明涉及包括固定靶標(biāo)的樣品(例如，上述中的任何一個)，即涉及在本發(fā)明的檢測過程中不能自由移動的靶標(biāo)的樣品，例如，經(jīng)機(jī)械或化學(xué)手段基本上降低或消除靶標(biāo)移動的樣品，例如在樣品或靶標(biāo)附著某些支承物或介質(zhì)或在某些支承物或介質(zhì)內(nèi)的情況下。因此，在一個實施方式中包括感興趣靶標(biāo)的單個單獨(dú)單元的樣品可以在檢測過程之前固定到固體支承物上，例如，固定到載玻片上的固體體組織樣品。本發(fā)明的包括固定靶標(biāo)的樣品實例包括但不限于固定在玻璃片或塑料片上的體組織樣品、或包括固定到膜或ELISA板等上的生物或化學(xué)分子的樣品。這些實施方式中的樣品靶標(biāo)可以固定在樣品內(nèi)，例如固定在組織樣品內(nèi)的蛋白質(zhì)，或可以固定在某些材料表面上或某些材料內(nèi)，例如固體材料或凝膠的一部分，例如硝化纖維膜等。在一個實施方式中，固體支承物可以是三維結(jié)構(gòu)，例如膠原或瓊脂塊。在該實施方式中，靶標(biāo)，例如分子或顆粒，可以固定在該結(jié)構(gòu)內(nèi)。在一個實施方式中，本發(fā)明涉及不包括靶標(biāo)的樣品，例如，對照樣品。在另一實施方式中，本發(fā)明涉及推定包括靶標(biāo)的樣品，例如具有未知內(nèi)容物的樣品。上述的術(shù)語“固體支承物”是指一片任意材料，其在根據(jù)本發(fā)明的過程條件下不溶，例如，其可以是硝化纖維膜、載玻片等。適用于固定樣品和/或靶標(biāo)的支承物的實例包括但不限于合成的聚合物支承物，例如聚苯乙烯、聚丙烯、取代的聚苯乙烯，例如胺化或羧化的聚苯乙烯；聚丙烯酰胺；聚酰胺；聚氯乙烯；玻璃；瓊脂糖；硝化纖維；尼龍；聚偏氟乙烯；表面改性的尼龍等。本發(fā)明涉及在本文描述的條件下為化學(xué)惰性的固體支承物，即所選的支承物可對該方法的檢測結(jié)果不具有任何主要影響。相應(yīng)地，可以選擇配合所選的檢定形式例如IHC、ELISA、印跡等的適用于固定樣品或靶標(biāo)的任何惰性支承物。麵術(shù)語“靶標(biāo)”在本文中是指推定存在于樣品中且特征可在于特定物理和/或功能特征的感興趣對象。應(yīng)該理解，在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“靶標(biāo)”涉及該對象的基本上相同實體的整個池，而不是樣品中該對象的單個實體；在通過僅有的單個單元表示靶標(biāo)的樣品中，該僅有的單個靶標(biāo)單元將被理解為整個靶標(biāo)和樣品中靶標(biāo)的量。本文的術(shù)語“基本上相同”是指樣品中靶標(biāo)的總池的所有或幾乎所有單個實體具有一個或多個使得它們被識別為靶標(biāo)的特征。例如，靶標(biāo)可以是特定的蛋白質(zhì)，包括樣品中該特定蛋白質(zhì)的所有分子；本發(fā)明靶標(biāo)的另一實例可以是特定的分子復(fù)合物或結(jié)構(gòu)，包括含有該特定的分子復(fù)合物或分子結(jié)構(gòu)的樣品的基本上所有對象；本發(fā)明靶標(biāo)的另一個實例可以是病毒顆?；蚣?xì)菌，其中樣品中該病毒顆?；蛟摷?xì)菌的總?cè)菏前袠?biāo)。與作為特定細(xì)胞類型、組織、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生理條件等的特征的特點相關(guān)的生物對象，例如分子、分子復(fù)合物、結(jié)構(gòu)、顆粒或有機(jī)體經(jīng)常被稱為該特定細(xì)胞類型、組織、細(xì)胞結(jié)構(gòu)或生理條件的“生物標(biāo)記物”。這些生物標(biāo)記物的非限制性實例包括但不限于特定的核苷酸序列、蛋白質(zhì)或其它生物分子，例如碳水化合物或脂質(zhì)、染色體或膜結(jié)構(gòu)、病毒、細(xì)菌、微生物等。在本發(fā)明的一些實施方式中，術(shù)語“靶標(biāo)”與術(shù)語“生物標(biāo)記物”互換使用，并涉及作為特定細(xì)胞類型、組織、生理條件等的特征的分子、分子復(fù)合物、結(jié)構(gòu)或顆粒，其中測試樣品中的任何在后生物標(biāo)記物的總?cè)罕徽J(rèn)為是靶標(biāo)。在一個實施方式中，靶標(biāo)可以是蛋白質(zhì)，例如細(xì)胞膜受體或細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)，在另一實施方式中，靶標(biāo)可以是核酸，例如細(xì)胞質(zhì)核酸。在本發(fā)明一些實施方式中，任何在后提及的靶標(biāo)的衍生物，例如靶標(biāo)蛋白或核酸的片段、前體、突變體等也可以是的靶標(biāo)。因此，在本發(fā)明的不同實施方式中，靶標(biāo)可以是生物或化學(xué)靶標(biāo)分子、或顆粒、或分子或細(xì)胞復(fù)合物、或分子或細(xì)胞結(jié)構(gòu)、或病毒、或微生物、或所述靶標(biāo)分子、顆粒、復(fù)合物、結(jié)構(gòu)、病毒或微生物的片段。在化學(xué)和環(huán)境樣品中包含的靶標(biāo)中，樣品可以是不同的污染物、毒素、戰(zhàn)爭物質(zhì)、分子庫成員、工業(yè)無毒廢化合物等。具體地，本發(fā)明涉及可以在樣品中通過多個獨(dú)立的基本上相同的單元表示的靶標(biāo)，具體地，本發(fā)明涉及祀標(biāo)的單個單獨(dú)單元。術(shù)語“單元”是指在計算中視為整體的單個量的靶標(biāo)，并用于執(zhí)行一個特定的功能。術(shù)語“單獨(dú)”是指單元可與相同種類的其它單元或環(huán)境中的其它組分(通過功能的物理特征)分開，并且可以單獨(dú)考慮和計數(shù)。術(shù)語“單獨(dú)單元”與術(shù)語“單個單元”互換使用。本文中的術(shù)語“單個”是指由單獨(dú)的整體構(gòu)成的、由數(shù)量上僅一個構(gòu)成的、由與很多相對或相反的一個構(gòu)成的靶標(biāo)單元。例如，靶標(biāo)蛋白的單個/單獨(dú)單元是指靶標(biāo)蛋白的單個單獨(dú)蛋白分子，即多個相同種類分子中的一個分子。術(shù)語“基本上相同的單元”是指，靶標(biāo)的多個單個單元具有一個或多個使這些單元被認(rèn)為是靶標(biāo)的特征。術(shù)語“獨(dú)立的”是指靶標(biāo)的單個單元以明顯的實體存在，并不依賴于樣品中相同種類的其它明顯實體的存在。在一些實施方式中，本發(fā)明涉及作為分子的單個部分的單個單元。術(shù)語“分子的單個部分”是指分子的一部分，其具有使得分子的該部分被認(rèn)為是與相同分子的其它部分分開的特定特性，例如靶標(biāo)蛋白的蛋白水解部分、融合蛋白的一部分、靶標(biāo)蛋白的特定結(jié)構(gòu)域、核酸的特定結(jié)構(gòu)、表位等。因此，在一個實施方式中，本發(fā)明可以涉及作為單個單獨(dú)靶標(biāo)分子的靶標(biāo)的單個/單獨(dú)單元，即涉及存在于樣品中的多個單個單獨(dú)靶標(biāo)分子，在另一個實施方式中，本發(fā)明可以涉及作為分子的單個單獨(dú)部分的靶標(biāo)的單個/單獨(dú)單元，例如，存在于樣品的多個靶標(biāo)分子中的特定分子結(jié)構(gòu)，例如，表位。在另一實施方式中，本發(fā)明可以涉及構(gòu)成樣品中存在的病毒顆粒池的多個單個單獨(dú)病毒顆粒。在不同的實施方式中，可以通過單個單獨(dú)生物或化學(xué)分子、單個單獨(dú)單個顆粒、單個單獨(dú)分子或細(xì)胞復(fù)合物、單個單獨(dú)分子或細(xì)胞結(jié)構(gòu)、或單個單獨(dú)病毒或單個單獨(dú)微生物、或所述分子、顆粒、復(fù)合物、結(jié)構(gòu)、病毒或微生物的單個單獨(dú)片段來表示靶標(biāo)的多個單個單
J Li ο在一個優(yōu)選的實施方式中，靶標(biāo)是與癌癥相關(guān)的生物標(biāo)記物，例如核酸、激素的多肽、生長因子及其受體、細(xì)胞粘合分子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子、細(xì)胞周期調(diào)控分子等，例如包括生長因子TOGF、VEGF, TGF、HGF或EGF、其受體和通路相關(guān)的分子的群組的基因、RNA和蛋白質(zhì)，與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路例如JAK/STAT通路或Aktl/PKB細(xì)胞存活通路或5-FU通路相關(guān)的基因及其產(chǎn)物，雌激素受體ER及其基因(ERSl)等。本發(fā)明的方法允許對所述生物標(biāo)記物進(jìn)行簡單且快速的可視化和定量。本發(fā)明的方法允許對以較寬動態(tài)范圍存在于樣品中的靶標(biāo)的單個單獨(dú)單元進(jìn)行可視化和定量。很高量和很低量的靶標(biāo)均能在同一個樣品中進(jìn)行可視化和定量，或者它們可以在單獨(dú)的樣品中進(jìn)行評估。兩種或更多種不同靶標(biāo)可以在一個或同一樣品中進(jìn)行可視化，例如，蛋白靶標(biāo)和核酸靶標(biāo)，或兩種或更多種不同的蛋白靶標(biāo)，或兩種或更多種不同的核酸靶標(biāo)等。在一個實施方式中，靶標(biāo)的單個單元可以基本上均勻地分布在樣品中，在其它實施方式中，靶標(biāo)的單個單元可以在樣品的一個部分中更大量地存在而在其其它部分中少量地存在。在所有在后實施方式中，可以使用本發(fā)明的方法在同一個樣品中對靶標(biāo)的單個單元進(jìn)行可視化和定量。在一些實施方式中，其中單個靶標(biāo)單元與感興趣的另一靶標(biāo)相關(guān)，例如，以特定的分子締合或結(jié)構(gòu)存在，其中所述特定分子締合或結(jié)構(gòu)是病理條件的生物標(biāo)記物。也可以通過對樣品中的單個靶標(biāo)單元進(jìn)行可視化和定量來對所述感興趣的另一靶標(biāo)進(jìn)行可視化和定量。在一個實施方式中，本發(fā)明涉及存在于樣品中的單個靶標(biāo)單元的部分子群，例如，存在于樣品中的單個單獨(dú)靶標(biāo)單元的總數(shù)的大部分或小部分。本文中的術(shù)語“部分子群”是指單個靶標(biāo)單元總?cè)旱囊徊糠?，其等于或少于樣品中靶?biāo)單個單元的總量的99.9%，例如，等于或少于98%、97%、95%、94%、93%、92%、91%或90%，例如在90%與85%之間，少于85%，例如樣品中靶標(biāo)單元的總量的85% 80%、80% 75%，例如少于75%，例如為樣品中靶標(biāo)單個單元總量的1% 74%，例如為樣品中靶標(biāo)單元的總量的1% 60%、1% 50%、1% 40%、1% 30%或25%,等等。根據(jù)本發(fā)明將由總?cè)旱?0% 99.9%表不的單個祀標(biāo)單兀的部分子群限定為存在于樣品中的單個靶標(biāo)單元的大部分。根據(jù)本發(fā)明將由少于樣品中單個靶標(biāo)單元的總?cè)旱?0%表示的部分子群限定為存在于樣品中的單個靶標(biāo)單元的小部分。在一個實施方式中，單獨(dú)單個靶標(biāo)單元的大部分可以涉及本發(fā)明的離散的單個靶標(biāo)部位的形成；在另一實施方式中，單獨(dú)單個靶標(biāo)單元的小部分可以涉及本發(fā)明的離散的單個靶標(biāo)部位的形成。在一個實施方式中，優(yōu)選基本上靶標(biāo)的所有單獨(dú)單個單元涉及與一種或多種結(jié)合劑形成復(fù)合物，其中僅所述復(fù)合物的部分子群涉及本發(fā)明的離散的單個結(jié)合位點的形成。結(jié)合劑本發(fā)明的方法包括如下步驟，其中假定包括靶標(biāo)的樣品與一種或多種結(jié)合劑孵育。術(shù)語“結(jié)合劑”是指能夠與靶標(biāo)單個單元例如靶標(biāo)蛋白的單獨(dú)分子直接或間接特異結(jié)合的分子。術(shù)語“特異”是指，結(jié)合劑對靶標(biāo)具有特定的親和性，例如對靶標(biāo)分子的親和性，或?qū)Y(jié)合到靶標(biāo)的試劑的特定親和性，例如，對結(jié)合到靶標(biāo)蛋白的一抗的親和性、對與一抗結(jié)合的半抗原的親和性等。術(shù)語“直接”是指對靶標(biāo)的單個單獨(dú)單元具有特異親和性的結(jié)合劑與該單個單獨(dú)單元相互作用并在相互作用時形成立即的結(jié)合，例如，一抗與用作用于提升所述一抗的抗原的單個單獨(dú)靶標(biāo)分子直接結(jié)合。本文中使用的術(shù)語“間接”是指結(jié)合劑，其中所述結(jié)合劑對靶標(biāo)的單個單獨(dú)單元沒有特異親和性，但是其中所述結(jié)合劑對能夠與該單個單獨(dú)單元特異結(jié)合的另一物質(zhì)例如一抗具有特異親和性，或其中所述結(jié)合劑對與所述單個單獨(dú)單元相關(guān)或連接的物質(zhì)(例如，對半抗原)具有特異親和性；所述結(jié)合劑直接與在后物質(zhì)相互作用，并與所述物質(zhì)形成結(jié)合，從而結(jié)合劑變成與靶標(biāo)的單個單元間接結(jié)合。在本文中通常由第一結(jié)合劑表示能夠與靶標(biāo)單個單元直接特異結(jié)合的結(jié)合劑。通常由第二結(jié)合劑表示能夠與靶標(biāo)單個單元間接特異結(jié)合的結(jié)合劑。然而，根據(jù)本發(fā)明的檢測體系可以包括能夠與靶標(biāo)單個單元間接結(jié)合的其它結(jié)合劑，例如第三、第四和其它結(jié)合劑。通常而言，使用第一結(jié)合劑或，在一些實施方式中，第二或第三結(jié)合劑，來與樣品接觸以識別靶標(biāo)，與其結(jié)合并與其形成復(fù)合物。第二、第三和其它結(jié)合劑可以用于根據(jù)本發(fā)明的方法的其它步驟中，例如用于識別下述靶標(biāo)部位處可檢測分子的沉積。在一些實施方式中，使用第二、第三和其它結(jié)合劑來放大與靶標(biāo)相關(guān)的信號。這些結(jié)合劑還可用于對檢測體系增加靈活度，例如用于改變與靶標(biāo)相關(guān)的原始信號，例如將紅色熒光信號變?yōu)榫G色等。本發(fā)明的結(jié)合劑可以是不同特異結(jié)合對的成員。領(lǐng)域內(nèi)已知很多不同的特異結(jié)合對，這些是能夠特異地相互結(jié)合的兩個不同分子的配對。適用于實施本發(fā)明的特異結(jié)合對的成員可以是免疫或非免疫型。非免疫特異結(jié)合對包括其中兩個組分分享對相互的天然親和性而不是抗體的體系。示例性的非免疫結(jié)合對是生物素-親和素或生物素-鏈霉親和素、葉酸-葉酸結(jié)合蛋白、互補(bǔ)核酸、受體-配體等。本發(fā)明還包括相互形成共價鍵的非免疫結(jié)合對。示例性的共價結(jié)合對包括巰基反應(yīng)基團(tuán)例如馬來酰亞胺和鹵代乙酰基衍生物，以及胺反應(yīng)基團(tuán)例如異硫氰酸鹽(酯)、琥珀酰亞胺酯、磺酰鹵化物，以及耦合染料例如3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH)和3-( 二甲基-氨基)苯甲酸(DMAB)等。免疫特異結(jié)合對可以示例為抗體-抗體體系或半抗原-抗半抗原體系。在一個實施方式中，本發(fā)明的免疫特異結(jié)合對可以是包括兩種或更多種相互有親和性的抗體分子的抗體-抗體結(jié)合對，例如一抗和二抗對，其中一抗代表第一結(jié)合劑，并且二抗代表第二結(jié)合劑；包括3種或4種或更多種抗體成員的抗體體系可以用于另一個實施方式中。在本發(fā)明的其它實施方式中，可以由半抗原-抗半抗原體系表示免疫結(jié)合對。在這些實施方式中，可以由包括對靶標(biāo)具有親和性的分子和半抗原的結(jié)合物表示第一結(jié)合劑，例如與半抗原連接的一抗或核酸序列，且可以由抗半抗原抗體表示第二結(jié)合劑。術(shù)語“半抗原”是指能夠被認(rèn)為是分離的表位的小分子，對該表位可以制備抗體，盡管半抗原獨(dú)自在注射到動物中時不引發(fā)免疫應(yīng)答，其必須與載體(通常為蛋白)結(jié)合。因為半抗原是小分子，多個拷貝的半抗原可以連接到大分子，例如聚合物分子，例如蛋白、核苷酸序列、葡聚糖等。半抗原可以用作為用于其中放大信號是必須或有利的檢定形式的便利標(biāo)記分子。因此，結(jié)合的多個拷貝的半抗原提供增強(qiáng)的靈感度，例如，增加的信號強(qiáng)度。合適半抗原的非限制性實例包括熒光素(FITC)、2，4-二硝基酚(DNP)、myc地高辛(DIG)、酪氨酸、硝基酪氨酸生物素和染料，例如四甲基羅丹明、德克薩斯紅、丹酰、Alexa Fluor488,BODIPY FL、熒光黃和Alexa Fluor405/Cascade藍(lán)色熒光團(tuán)，US20080305497中描述的半抗原也可以用于本發(fā)明的目的。本文中使用的術(shù)語“抗體”是指免疫球蛋白或其一部分，并包括含有抗原結(jié)合位點的任何多肽，而不管來源、制造方法和其它特征。該術(shù)語包括，例如，多克隆的、單克隆的、單一特異性的、多特異性的、人化的、單鏈、嵌合的、合成的、重組的、雜交的、突變的和CDR接枝的抗體。抗體的一部分可以包括仍然能夠結(jié)合抗原的任何片段，例如，F(xiàn)ab、F(ab’)2、Fv、scFvo通過與制造方法無關(guān)的基因序列來限定抗體的來源。本發(fā)明上下文中的一抗是指抗體結(jié)合劑，例如，整個抗體分子、所述分子的片段或衍生物，例如包括抗體或聚合抗體的結(jié)合物，其與靶標(biāo)特異結(jié)合，更具體地與樣品中靶標(biāo)的單個單元結(jié)合，例如，與單個靶標(biāo)分子結(jié)合。在一些實施方式中，一抗可以是能夠與不同靶標(biāo)的兩個(或更多)單個單獨(dú)單元結(jié)合的二價抗體，例如能夠結(jié)合到受體二聚體(例如Her2/Her3 二聚體)的抗體。在該實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的靶標(biāo)的單個單元是單個的Her2/Her3二聚體，并且靶標(biāo)是樣品中Herf/Herf 二聚體的群體，包括樣品的所有所述二聚體。一抗可以源自任何熱血種屬例如哺乳類、鳥類。本發(fā)明上下文中的二抗是指抗體結(jié)合劑，例如，整個抗體分子、所述分子的片段或衍生物，例如包括抗體或聚合抗體的結(jié)合物，其具有與一抗、或沉積在靶標(biāo)部位處的半抗原、或直接或間接連接至一抗或另一結(jié)合劑的半抗原特異結(jié)合的抗原結(jié)合域。本發(fā)明上下文中的三抗是指抗體結(jié)合劑，例如整個抗體分子、所述分子的片段或衍生物，例如包括抗體或聚合抗體的結(jié)合物，其包括與二抗或連接至二抗的半抗原或連接至結(jié)合二抗的聚合物的半抗原或沉積在靶標(biāo)部位處的半抗原特異結(jié)合的抗原結(jié)合域。有時候抗體可以同時起到二抗和三抗的作用。本發(fā)明中使用的抗體，包括一抗、二抗和三抗，可以源自任何哺乳動物種屬，例如大鼠、小鼠、山羊、豚鼠、驢、兔、馬、美洲駝、駱駝、或任何鳥類種屬，例如雞、鴨。如本文中使用的源自任何哺乳動物或鳥類種屬是指編碼特定抗體的核酸序列的至少一部分源自特定哺乳動物例如大鼠、小鼠、山羊或兔，或特定的鳥例如雞、鴨的基因組序列?？贵w可以是任何同種型，例如 IgG, IgM, IgA、IgD, IgE 或任何亞類，例如 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4。在某些實施方式中，一抗含有抗原結(jié)合區(qū)，其能夠與生物標(biāo)記物特異結(jié)合，具體是與由生物樣品的細(xì)胞表達(dá)的所述生物標(biāo)記物的單個單獨(dú)單元結(jié)合。標(biāo)記物可以表達(dá)在細(xì)胞表面上或細(xì)胞膜內(nèi)即細(xì)胞的內(nèi)部，例如細(xì)胞質(zhì)內(nèi)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)等。在一些實施方式中，可以從細(xì)胞中提取生物標(biāo)記物，因此其存在于無細(xì)胞的介質(zhì)中，例如水溶液中，或者其是存在于細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)、血漿、腦脊液等中的可溶分子。上面描述相應(yīng)樣品的實例。在某些實施方式中，二抗含有與一抗例如與一抗的恒定區(qū)特異結(jié)合的抗原結(jié)合區(qū)。在某些實施方式中，二抗可以與聚合物結(jié)合。在一些實施方式中，2 20個二抗例如5 15個二抗可以與聚合物結(jié)合。在其它實施方式中，聚合物可以與I 10個二抗例如
1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 個二抗結(jié)合。在某些實施方式中，三抗可以含有與二抗例如與二抗的恒定區(qū)、或與連接至二抗的半抗原、或與結(jié)合有二抗的聚合物特異結(jié)合的抗原結(jié)合區(qū)。在某些實施方式中，三抗與聚合物結(jié)合。在一些實施方式中，I 20個三抗可以與聚合物結(jié)合。在其它實施方式中，I 5個三抗例如1、2、3、4或5個三抗可以與聚合物結(jié)合。在一些實施方式中，可以優(yōu)選包括單個結(jié)合單元的結(jié)合劑的聚合物，例如與一個分子的一抗、二抗或三抗結(jié)合的聚合物?？捎糜诒景l(fā)明目的的抗體包括單克隆和多克隆抗體，使用噬菌體展示或可選技術(shù)制造的含有嵌合的、CDR接枝和人工選擇抗體的工程抗體?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域熟知的多種方法中的任何一種來制造本發(fā)明的抗體結(jié)合劑，例如根據(jù) Harlow 和 Lane, Antibodies:a Laboratory Manual, (1988)(Cold SpringHarbor Press, Cold Spring Harbor, NY)。用于制備重組抗體分子的技術(shù)在上述文獻(xiàn)和多個其它文獻(xiàn)例如EP0623679、EP0368684和EP0436597中有過描述?？梢詮腸DNA庫中分離編碼抗體的核酸?？梢詮氖删w庫中分離編碼抗體的核酸(參見例如 McCafferty 等人 1990，Nature348:552，Kang 等人 1991，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88:4363;EP0589877B1 )?？梢酝ㄟ^已知序列的基因改組而獲得編碼抗體的核酸(Mark等人1992，Bio/Technol.10:779)。可以通過體內(nèi)重組而分離編碼抗體的核酸(Waterhouse等人1993，Nucl.Acid Res.21:2265)。用于本發(fā)明方法中的抗體包括人化的免疫球蛋白(參見US5585089，Jones等人1986，Nature332:323)?？梢砸匀魏慰赡艿姆绞礁淖儽景l(fā)明的抗體，假定它們保持它們的結(jié)合親和性，例如它們可以與效應(yīng)蛋白、毒素、標(biāo)記物等融合?？贵w與不同試劑結(jié)合的方法也在領(lǐng)域內(nèi)熟知并在本發(fā)明以下的示例性實施方式中描述。在本發(fā)明的一個實施方式中，由Fab區(qū)域表示抗體結(jié)合劑。在一個實施方式中，抗體結(jié)合劑可以是包括兩種或更多種不同抗體結(jié)合劑的組合物，例如包括第一抗體結(jié)合劑和第二抗體結(jié)合劑的組合物，其中該兩種或更多種不同抗體劑具有不同的免疫結(jié)合對。在一個實施方式中，在組合物中，兩種或更多種不同抗體結(jié)合劑中的至少一種是能夠與靶標(biāo)特異結(jié)合的抗體，且至少一種其它結(jié)合劑是包括酶的抗體。在另一個實施方式中，本發(fā)明涉及作為非免疫特異結(jié)合對的成員的結(jié)合劑，例如互補(bǔ)的核苷酸序列或核酸類似分子。包括核酸或核酸類似分子例如DNA分子、RNA分子、PNA分子的結(jié)合劑可以用于核酸靶標(biāo)的單個單獨(dú)單元的可視化和定量。用作本發(fā)明目的用結(jié)合劑的核酸序列可以化學(xué)合成或在重組細(xì)胞中產(chǎn)生。兩種產(chǎn)生模式在領(lǐng)域內(nèi)均公知(參見，例如Sambrook等人(1989)Molecular Cloning:ALaboratory Manual, 2nd ed.Cold Spring Harbor Press)。在一些實施方式中，核酸結(jié)合劑可以包括肽核酸(PNA)。肽核酸是其中通常存在于DNA和RNA中的脫氧核酸或核酸糖骨架(backbone)被肽骨架替換的核酸分子。制作PNA的方法在領(lǐng)域內(nèi)已知(參見，例如Nielson, 2001, Current Opinion in Biotechnologyl2:16)(并入本文以供參考)。在其它實施方式中，結(jié)合劑可以包括鎖核酸(LNA)(Sorenson等人2003，Chem.Commun.7 (17):2130)。在一些實施方式中，核酸結(jié)合劑可以包括至少一個寡核苷酸序列或至少一個聚核苷酸序列，其在特定的嚴(yán)格條件下與生物樣品中靶標(biāo)序列的單個單元(例如，單個mRNA序列)特異雜交。本文中使用術(shù)語“在嚴(yán)格條件下的雜交”來描述雜交的條件，在該條件下，顯著地相互互補(bǔ)例如至少70%、至少80%、至少85 90%互補(bǔ)的核苷酸序列保持相互結(jié)合。如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402 (并入本文以供參考)中所述地確定互補(bǔ)百分比。規(guī)定的嚴(yán)格條件在領(lǐng)域內(nèi)已知，并可以在Current Protocols in MolecularBiology, John ffiley&Sons, Inc.(Ausubel 等人 1995eds.)，第 2、4 和 6 節(jié)(并入本文以供參考)中找到。此外，在 Sambrook等人(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nded.Cold Spring Harbor Press,第7、9和11章(并入本文以供參考)中描述了規(guī)定的嚴(yán)格條件。在一些實施方式中，雜交條件為高度嚴(yán)格的條件。高度嚴(yán)格的雜交條件的實例是在65 70°C下在4X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中的雜交或是在42 50°C下在4X SSC加50%甲酰胺中的雜交，之后在65 70°C下在IXSSC中洗滌一次或多次。應(yīng)理解的是，其它的試劑可以添加到雜交和/或洗滌緩沖液中，例如，封閉劑(BSA或鮭魚精子DNA)、洗滌劑(SDS )、螯合劑(EDTA )、聚蔗糖、PVP等。在一些實施方式中，結(jié)合劑可以在中等嚴(yán)格的條件下與樣品中的靶標(biāo)序列雜交。本文中使用的中等嚴(yán)格包括能夠由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員基于例如DNA的長度而容易確定的條件。例不的條件在 Sambrook 等人 Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2ded.Vol.1, pp.1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)(并入本文以供參考)中提出，并包括使用5XSSC、0.5%SDS、1.0mM EDTA (pH8.0)的預(yù)洗液，42°C下50%甲酰胺、6 X SSC的雜交條件(或其它類似的雜交液，例如Stark溶液，在50%甲酰胺中，42°C)，以及60。。、0.5XSSC、0.1%SDS的洗滌條件。在一些實施方式中，結(jié)合劑在低嚴(yán)格條件下與樣品中靶標(biāo)序列雜交。本文中使用的低嚴(yán)格條件可以包括能夠由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員基于例如DNA的長度而容易確定的條件。例如，低嚴(yán)格可以包括在含有35%甲酰胺、5XSSC、50mM Tris-HCl (pH7.5)、5mM EDTA,0.1%PVP、0.1%聚蔗糖、1%BSA和500μ g/ml變性的鮭魚精子DNA的溶液中于40°C對DNA預(yù)處理6小時。在具有以下改變的相同溶液中進(jìn)行雜交:使用0.02%PVP、0.02%聚蔗糖、0.2%BSA、100 μ g/ml鮭魚精子DNA、10%(wt/vol)硫酸葡聚糖和5 20 X IO6CPM結(jié)合劑。在雜交混合物中于40°C孵育樣品18 20小時，之后在含有2XSSC、25mM Tris_HCl(pH7.4)、5mM EDTA和0.1%SDS的溶液中于55°C洗滌樣品1.5h。使用新鮮溶液替換洗滌液并再使其于60°C孵育 1.5h。在其它實施方式中，本發(fā)明可以涉及結(jié)合劑，其為源自非抗體蛋白的肽序列或包括該肽序列，例如源自不同蛋白的核酸結(jié)合域、不同細(xì)胞和核受體的配體及其衍生物的肽序列。這些結(jié)合劑的一些非限制性實例可以是能夠與抗體恒定區(qū)結(jié)合的補(bǔ)體級聯(lián)的經(jīng)典通路的clq蛋白，MHC分子例如I類MHC和II類MHC和非常規(guī)MHC，具有特異結(jié)合配偶體的分子例如涉及細(xì)胞信號通路的分子例如具有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的分子，例如fos/jun、myc、GCN4，具有SHl或SH2結(jié)構(gòu)域的分子，例如Src或Grb_2 ;免疫球蛋白受體，例如Fe受體；嵌合蛋白，即工程制備為將兩種或更多種特異結(jié)合配偶體的特征結(jié)合的蛋白，例如亮氨酸拉鏈可以被工程制備成抗體的Fe區(qū)，SH2結(jié)構(gòu)域可以被工程制備成在抗體的Fe區(qū)中表達(dá)。在其它實施方式中，融合蛋白可以被工程制備成包括具有取代的可變結(jié)構(gòu)域的抗體的Fe部。結(jié)合劑也可以是能夠與生物大分子的某些結(jié)構(gòu)單元特異結(jié)合的小分子。在一些實施方式中，結(jié)合劑可以包括可檢測的標(biāo)記物，例如，熒光物質(zhì)、半抗原、酶等。在一個實施方式中，本發(fā)明涉及標(biāo)記的結(jié)合劑，即能夠與樣品中結(jié)合配偶體(例如，靶標(biāo)單元、其它結(jié)合劑、沉積的可檢測分子)特異結(jié)合的標(biāo)記的第一、第二、第三或其它結(jié)合劑。這些結(jié)合劑可以用于本發(fā)明樣品中靶標(biāo)單元或靶標(biāo)部位的可視化。在一個實施方式中，本發(fā)明涉及包括作為酶的標(biāo)記物的結(jié)合劑。合適的酶標(biāo)記物的非限制性實例可以是辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(AP)、β -半乳糖苷酶(GAL)、葡萄糖_6_磷酸脫氫酶、β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、β -葡萄糖醛酸酶、轉(zhuǎn)化酶、黃嘌呤氧化酶、螢火蟲熒光素酶、葡糖氧化酶(GO)。在一個優(yōu)選實施方式中，結(jié)合劑可以包括HRP作為標(biāo)記物。在另一優(yōu)選實施方式中，結(jié)合劑可以包括AP作為標(biāo)記物。在以下討論其它優(yōu)選的酶實施方式。形成本發(fā)明靶標(biāo)部位所需的結(jié)合劑的量可以根據(jù)不同因素例如樣品種類、靶標(biāo)種類、結(jié)合劑種類、結(jié)合劑的結(jié)合親和性等而變化。使用一般常識，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇合適的結(jié)合劑并確定每個特定實施方式所需的量。在一些實施方式中，優(yōu)選調(diào)整用于形成靶標(biāo)部位的結(jié)合劑的量，使得并非樣品中存在的靶標(biāo)的所有單個單元、而是其部分子群涉及靶標(biāo)部位的形成，例如這些實施方式可以涉及包括大量靶標(biāo)、或以較寬動態(tài)濃度范圍存在的靶標(biāo)的樣品。在其它實施方式中，例如在靶標(biāo)或靶標(biāo)的單個單元的靶標(biāo)表達(dá)非常低的樣品的情況下，可以優(yōu)選靶標(biāo)的所有或基本上所有單個單元涉及本發(fā)明靶標(biāo)部位的形成。在后實施方式中，可以優(yōu)選以如下量使用結(jié)合劑，該量保證結(jié)合劑與樣品的單獨(dú)單個單元的大部分形成結(jié)合位點，即，存在靶標(biāo)的單個單元的大部分會涉及靶標(biāo)部位的形成。在一個實施方式中，結(jié)合劑可以是未標(biāo)記和標(biāo)記的相同種類的結(jié)合分子的混合物，其對相同的結(jié)合配偶體具有親和性，例如，對特定靶標(biāo)蛋白的標(biāo)記和未標(biāo)記的一抗的混合物，或針對特定種類的一抗的標(biāo)記和未標(biāo)記的二抗的混合物等等。根據(jù)本發(fā)明，使用在后結(jié)合分子混合物，其中一部分標(biāo)記的結(jié)合分子是預(yù)定的，使用通過該部分標(biāo)記的結(jié)合劑預(yù)定的單個靶標(biāo)單元的某個部分子群形成靶標(biāo)部位(之后可視化為視覺上明顯的點)。這允許確定樣品中單個祀標(biāo)單元的精確量,并由此確定祀標(biāo)的量,包括樣品中祀標(biāo)的相對量和總量。在實施例部分中詳細(xì)討論對組織學(xué)樣品中靶標(biāo)進(jìn)行定量的該方法和其它方法。在一些實施方式中，本發(fā)明涉及結(jié)合劑，例如特異結(jié)合對的成員，其對于其特異結(jié)合配偶體的結(jié)合親和性是已知的，例如，對樣品中的結(jié)合配偶體例如對靶標(biāo)或另一結(jié)合劑的的預(yù)定的結(jié)合親和性。通常通過解離常數(shù)來描述特異結(jié)合對的成員之間的親和性，例如，配體與受體、抗體和抗原等，即，配對中的一個結(jié)合配偶體(BPl)多緊密地與另一結(jié)合配偶體(BP2)結(jié)合?？梢酝ㄟ^雙 態(tài)過程來描述結(jié)合配偶體之間的復(fù)合物(BPl:BP2)的形成:BP1:BP2<=>BP1+BP2 ；相應(yīng)的解離常數(shù)限定為
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ΙΒΡ1ΛΡ2]其中[BP1]、[BP2]和[BP1:BP2]分別表示BPUBPl以及BPl與BP2的復(fù)合物的摩
爾濃度。解離常數(shù)具有摩爾單位(M)，其相應(yīng)于BP2的結(jié)合位點被占據(jù)一半的BPl的濃度，即BP2結(jié)合為[BP1:BP2]的BP2濃度等于沒有配體結(jié)合[BP2]的BP2濃度的BPl的濃度。解離常數(shù)越小，結(jié)合BPl越緊密，或者BPl與BP2之間的親和性越高。例如，具有納摩爾(nM)解離常數(shù)的BPl比具有微摩爾(μ Μ)解離常數(shù)的BPl更緊密地結(jié)合ΒΡ2。用于特定BPl與ΒΡ2相互作用的解離常數(shù)可以隨著溶液條件(例如，溫度、pH和鹽濃度)而顯著變化。不同溶液條件的作用是有效地改變將特定BPl:BP2復(fù)合物保持在一起的任何分子間相互作用的強(qiáng)度。在以下的其它部分中將討論用于本發(fā)明目的的與BP1:BP2復(fù)合物形成相關(guān)的介質(zhì)條件。在抗體(Ab)與抗原(Ag)結(jié)合的具體情況中，通常使用親和常數(shù)(Ka)。這是解離常數(shù)的倒數(shù)。
權(quán)利要求
1.一種用于對樣品中存在的靶標(biāo)進(jìn)行定量的方法，其中所述靶標(biāo)是固定的，包括 (a)將包括所述靶標(biāo)的單獨(dú)單元的群體的樣品與一種或多種結(jié)合劑孵育，其中 (i)至少一種所述結(jié)合劑能夠與所述IE標(biāo)的單個單獨(dú)單元特異結(jié)合； ( )至少一種所述結(jié)合劑包括酶，并且 (iii)(i)或(ii)的至少一種所述結(jié)合劑對其在所述樣品中的結(jié)合配偶體的結(jié)合親和性是已知的， 從而形成具有所述靶標(biāo)的單獨(dú)單個單元的部分子群的一個或多個離散的單個靶標(biāo)部位，其中各個離散的單個靶標(biāo)部位包括所述靶標(biāo)的一個單獨(dú)單元與一種或多種結(jié)合劑的復(fù)合物，其中至少一種所述結(jié)合劑包括所述酶； (b)使所述離散的單個靶標(biāo)部位可視化為視覺上明顯的點； (c)對所述視覺上明顯的點進(jìn)行定量； Cd)評估所述祀標(biāo)的量。
2.根據(jù)權(quán)利要 求1所述的方法，其中由所述樣品中存在的所述靶標(biāo)的單個單獨(dú)單元的小部分形成所述靶標(biāo)部位。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中由所述樣品中存在的所述靶標(biāo)的單個單獨(dú)單元的大部分形成所述靶標(biāo)部位。
4.一種用于對樣品中存在的靶標(biāo)進(jìn)行定量的方法，其中所述靶標(biāo)是固定的，包括 (a)將包括所述靶標(biāo)的單獨(dú)單元的群體的樣品與一種或多種結(jié)合劑孵育，其中 (i)至少一種所述結(jié)合劑能夠與所述靶標(biāo)的單個單獨(dú)單元特異結(jié)合；并且 ( )至少一種所述結(jié)合劑包括酶， 從而形成具有所述靶標(biāo)的單獨(dú)單個單元的預(yù)定部分子群的一個或多個離散的單個靶標(biāo)部位，其中各個離散的單個靶標(biāo)部位包括所述靶標(biāo)的一個單獨(dú)單元與一種或多種結(jié)合劑的復(fù)合物，其中至少一種結(jié)合劑包括所述酶； (b)使包括所述酶的所述離散的單個靶標(biāo)部位可視化為視覺上明顯的點； (c)對所述視覺上明顯的點進(jìn)行定量； Cd)評估所述樣品中靶標(biāo)的量。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，包括 (a)將所述樣品與第一結(jié)合劑孵育， 其中 (i)所述第一結(jié)合劑能夠與所述靶標(biāo)的單個單獨(dú)單元特異結(jié)合并使所述樣品中所有結(jié)合位點基本上飽和， ( )預(yù)定部分的所述第一結(jié)合劑包括酶， 從而形成離散的單個靶標(biāo)部位，各個靶標(biāo)部位包括所述靶標(biāo)的單個單獨(dú)單元和所述結(jié)合劑，其中一部分的所述離散的單個靶標(biāo)部位包括含有酶的所述結(jié)合劑； (b)使包括所述酶的所述離散的單個靶標(biāo)部位可視化為視覺上明顯的點； (c)對所述視覺上明顯的點進(jìn)行定量； Cd)評估所述樣品中靶標(biāo)的量。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，包括 (a)將所述樣品與第一和第二結(jié)合劑孵育，其中 (i)第一結(jié)合劑能夠與所述靶標(biāo)的單個單獨(dú)單元特異結(jié)合并使所述樣品中所有結(jié)合位點基本上飽和，且 (ii)第二結(jié)合劑能夠與所述第一結(jié)合劑特異結(jié)合，且預(yù)定部分的所述第二結(jié)合劑包括酶， 從而形成離散的單個靶標(biāo)部位，各個靶標(biāo)部位包括所述靶標(biāo)的單個單獨(dú)單元、所述第一結(jié)合劑和所述第二結(jié)合劑，其中一部分的所述離散的單個靶標(biāo)部位包括含有酶的所述結(jié)合劑； (b)使包括所述酶的所述離散 的單個靶標(biāo)部位可視化為視覺上明顯的點； (c)對所述視覺上明顯的點進(jìn)行定量； Cd)評估所述樣品中靶標(biāo)的量。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 6中任一項所述的方法，其中所述結(jié)合劑是特異結(jié)合對的成員。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 7中任一項所述的方法，其中所述酶是具有氧化還原酶活性的酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述酶具有過氧化物酶活性或酚氧化酶活性。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述酶是辣根過氧化物酶、大豆過氧化物酶或漆酶、或所述酶的功能性類似物。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中使所述離散的單個靶標(biāo)部位可視化為視覺上明顯的點的步驟包括: (I)在水溶液(A)中孵育包括一個或多個離散的單個靶標(biāo)部位的樣品，所述水溶液(A)包括 小于2mM的量的過氧化物， 與所述離散的單個靶標(biāo)部位相關(guān)的酶的第一底物，以及 所述酶的第二底物， 其中所述第一底物是水溶性富電子化合物，其 (1)能夠在與所述酶反應(yīng)時生成自由基；并且 (ii)能夠在所述酶與過氧化物的存在下使所述第二底物的分子交聯(lián)，從而生成所述第二底物的水不溶性聚合產(chǎn)物， 且其中所述第二底物是包括能夠用作為所述酶的底物的至少兩個化合物以及可檢測的標(biāo)記物的結(jié)合物分子，其中所述可檢測的標(biāo)記物選自熒光的、發(fā)光的、放射性的或發(fā)色的物質(zhì)或特異結(jié)合對的成員， (2)從而在所述離散的單個靶標(biāo)部位處形成所述第二底物的離散沉積，并使所述離散的單個靶標(biāo)部位可視化。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述具有氧化還原酶活性的酶的第一底物是包括式(I)結(jié)構(gòu)的化合物:
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的方法，其中所述化合物是3，3’- 二氨基聯(lián)苯胺或其衍生物。
14.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的方法，其中所述化合物是阿魏酸或其衍生物。
15.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的方法，其中所述化合物是α-氰基-4-羥基-肉桂酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中3，3’- 二氨基聯(lián)苯胺或其衍生物的量是約0.1至小于ImM。
17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中阿魏酸或其衍生物的量是約0.5mM至約5mM。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中α-氰基-4-羥基-肉桂酸的量是約1.5mM至約 15mM。
19.根據(jù)前述權(quán)利要求11 18中任一項所述的方法，其中所述結(jié)合物分子包括至少一個作為所述具有氧化還原活性的酶的底物且由式(II)限定的化合物:
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中至少兩個化合物由式(II)限定。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中由式(II)限定的至少兩個化合物是相同的化合物。
22.根據(jù)權(quán)利要求19所述 的方法，其中由式(II)限定的至少兩個化合物是不同的化合物。
23.根據(jù)權(quán)利要求19 23中任一項所述的方法，其中所述化合物選自肉桂酸、阿魏酸、咖啡酸、氨基肉桂酸或芥子酸、或其衍生物。
24.根據(jù)前述權(quán)利要求19 22中任一項所述的方法，其中所述結(jié)合物包括至少一個酪氨酸殘基作為所述酶的底物。
25.根據(jù)前述權(quán)利要求19 24中任一項所述的方法，其中在所述結(jié)合物中，能夠用作為與單個靶標(biāo)部位相關(guān)的所述酶的底物的所述至少兩個化合物中的每個在所述結(jié)合物分子中相互隔開30個或少于30個連續(xù)連接的原子，并且所述可檢測的標(biāo)記物與任意所述底物隔開30個或多于30個連續(xù)連接的原子。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中在所述結(jié)合物分子中將所述標(biāo)記物與所述具有氧化還原酶活性的酶的任意底物隔開的所述至少30個連續(xù)連接的原子包括下式(III)的2 10個重復(fù):
27.根據(jù)前述權(quán)利要求11 24中任一項所述的方法，其中由相同結(jié)合物分子的群體或不同結(jié)合物分子的群體表示所述第二底物，其中所述結(jié)合物分子是權(quán)利要求18 26中任一項限定的任意一種。
28.根據(jù)前述權(quán)利要求11 27中任一項所述的方法，其中所述方法包括步驟(I)之前的步驟(1’)，其中在水溶液(B)中孵育所述樣品，所述水溶液(B)除不包括第二底物之外具有與水溶液(A)相同的組成。
29.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述明顯的點是具有大約或大于0.4微米的視直徑的點。
30.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述方法在根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的步驟(a)、(b)和/或(c)之間包括至少一個洗滌步驟。
31.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述靶標(biāo)選自生物或化學(xué)的靶標(biāo)分子、顆粒、分子或細(xì)胞復(fù)合物、分子或細(xì)胞結(jié)構(gòu)、病毒或微生物、或所述靶標(biāo)分子、顆粒、復(fù)合物、結(jié)構(gòu)、病毒或微生物的片段。
32.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中靶標(biāo)的所述單獨(dú)單元選自單獨(dú)單個生物或化學(xué)分子、單獨(dú)單個顆粒、單獨(dú)單個分子或細(xì)胞復(fù)合物、單獨(dú)單個分子或細(xì)胞結(jié)構(gòu)、或單獨(dú)單個病毒或微生物、或所述分子、顆粒、復(fù)合物、結(jié)構(gòu)、病毒或微生物的單獨(dú)單個片段。
33.根據(jù)權(quán)利要求31或32所述的方法，其中所述靶標(biāo)是蛋白或核酸分子、或其片段或衍生物。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述蛋白是胞漿、胞內(nèi)或核膜蛋白，或細(xì)胞核、細(xì)胞器或胞質(zhì)蛋白，或細(xì)胞核、細(xì)胞器或胞質(zhì)核酸。
35.根據(jù)權(quán)利要求31 34中任一項所述的方法，其中所述靶標(biāo)是生物標(biāo)記物。
36.根據(jù)權(quán)利要求31 34中任一項所述的方法，其中所述靶標(biāo)是HER2或其產(chǎn)物。
37.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述樣品是生物、化學(xué)或環(huán)境樣品。
38.根據(jù)前述權(quán) 利要求中任一項所述的方法，其中手動、半手動或自動執(zhí)行對離散的視覺上明顯的點的定量。
39.根據(jù)權(quán)利要求4 36中任一項所述的方法，其中所述方法用于對樣品中靶標(biāo)的絕對量進(jìn)行定量。
40.根據(jù)權(quán)利要求1 36中任一項所述的方法，其中所述方法用于對樣品中靶標(biāo)的相對量進(jìn)行定量。
41.根據(jù)權(quán)利要求39或40所述的方法，其中所述樣品是組織學(xué)樣品。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中相對于所述樣品的單位面積或單位體積、或包括在所述樣品中的單位對象或單位參考標(biāo)記物而評估所述祀標(biāo)的量。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述對象是細(xì)胞結(jié)構(gòu)或細(xì)胞器。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述對象是細(xì)胞核。
45.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述參考標(biāo)記物是蛋白或核酸序列。
46.一種試劑盒，包括用于執(zhí)行權(quán)利要求1 45中任一項所述的方法的試劑。
47.一種用于在個體中診斷或預(yù)測疾病、或預(yù)測治療處理的效力的方法，包括根據(jù)權(quán)利要求I 45中任一項所述的方法在從所述個體得到的樣品中評估與所述疾病或所述治療處理相關(guān)的生物標(biāo)記物的量的步驟。
全文摘要
本發(fā)明屬于使用免疫化學(xué)手段對樣品中固定靶標(biāo)進(jìn)行可視化和定量的領(lǐng)域。本發(fā)明的方法利用允許使樣品中的單個靶標(biāo)單元可視化為明顯的點的免疫染色體系。具體地，本發(fā)明涉及用于對組織學(xué)樣品中免疫染色的分子靶標(biāo)進(jìn)行可視化和定量的方法和試劑以及所述方法和試劑在醫(yī)學(xué)診斷中的用途。然而本發(fā)明的可視化和定量方法可以應(yīng)用于不同樣品中的多種靶標(biāo)，并且允許對其相對和絕對量進(jìn)行精確定量。
文檔編號G01N33/58GK103201627SQ201180053856
公開日2013年7月10日 申請日期2011年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月8日
發(fā)明者J.洛澤, G.斯克拉蒂奇克瓦 申請人:丹麥達(dá)科有限公司