成像細胞儀的內(nèi)部聚焦參考珠的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明一般地涉及可用于分析和測量細胞和生物樣品的分析和監(jiān)測系統(tǒng)。更具體地，本發(fā)明提供用于細胞成像儀的內(nèi)部校準和聚焦參考的系統(tǒng)和方法。
【專利說明】成像細胞儀的內(nèi)部聚焦參考珠
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明一般地涉及用于分析和測量細胞和生物樣品的分析和監(jiān)測系統(tǒng)。更具體地說，本發(fā)明涉及用于成像細胞儀的內(nèi)部校準和聚焦參考的系統(tǒng)和方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在醫(yī)療診斷和生物醫(yī)學研究領(lǐng)域的一個重要方面涉及通過測試生物樣品如血液、脊髓液、細胞培養(yǎng)物和尿液來對所感興趣的各種細胞和生物分子進行檢測、識別、量化和表征。醫(yī)療服務(wù)提供者和生物醫(yī)學研究人員對這些生物樣品的細胞與生物分子的微觀存在和濃度進行了常規(guī)分析。
[0003]例如，在用于輸血資格的患者血液樣本中需要確認白細胞數(shù)(即白血細胞)。通過使用成像細胞儀的方法(Cellometer,Nexcelom Bioscience,LLC),白細胞計數(shù)可以通過對薄腔室的大面積成像來測量，它允許在一個特定的掃描體積之內(nèi)計數(shù)所有的白細胞。全血中含有高濃度的紅血細胞，其經(jīng)常阻礙白細胞被肉眼看到，除非紅血細胞被溶解或采用專門用于染色白細胞的熒光方法。上面提到的檢測方法，去白細胞的專業(yè)人員使用熒光或者使用當紅血細胞溶解時的亮視野，將能夠聚焦于白細胞上。然而，大多數(shù)去白細胞的病人血液樣本中含有濃度非常低的白細胞。因此，成像系統(tǒng)可能無法檢測到任何白細胞的存在，這表示在圖像視野中沒有進行聚焦的對象。
[0004]因此，對于提供簡單和精確的校準和用于聚焦的內(nèi)部參考和質(zhì)量控制從而允許準確和快速成像以及超低濃度樣品測量的系統(tǒng)和方法存在長期需求。
[0005]發(fā)明概沭
[0006]本發(fā)明基于一個獨特的設(shè)計方法，其獲得用于成像細胞儀校準和內(nèi)部聚焦的顯著改善的系統(tǒng)。本發(fā)明提供了在測量、分析、計數(shù)或監(jiān)測顯微對象例如各種類型的生物細胞方面的改進。特別地，該系統(tǒng)允許對極低濃度下的細胞進行更精確的檢測和測量。該新穎的方法對于確認低濃度去白細胞血液樣品的細胞計數(shù)能有效并高效率地內(nèi)部聚焦和參考，并顯著地改善檢測限和從成像細胞儀獲得的結(jié)果的置信度。
[0007]在一個方面，本發(fā)明一般地涉及用于確定樣品中目標細胞的存在或濃度的方法。該方法包含:將待檢測的用于確定目標細胞的存在或濃度的樣品與預先確定量的微粒混合，其中所述目標細胞在第一激發(fā)波長下激發(fā)后能夠在第一檢測波長下發(fā)射熒光，并且其中所述微粒在第二激發(fā)波長激發(fā)后能夠在第二檢測波長下發(fā)射熒光；將樣品負載于熒光成像系統(tǒng)的樣品室；將光束導向樣品，其中所述光束包含第二激發(fā)波長；在第二檢測波長下獲得所述樣品的熒光圖像；用在第二檢測波長下獲得的熒光圖像校準熒光圖像系統(tǒng)；將第二光束導向樣品，其中所述第二光束包含第一激發(fā)波長；在第一檢測波長下獲得所述樣品的熒光圖像；并且確定樣品中目標細胞的存在或濃度。
[0008]在另一個方面，本發(fā)明一般地涉及用來校準用于在低濃度下測量目標細胞的熒光成像系統(tǒng)的方法。所述方法包含:制備一種包含預先確定量的、其上結(jié)合有能發(fā)射熒光的染料的微粒；將光束導向樣品，其中所述光束包含能對所述染料進行熒光激發(fā)的波長，從而導致所述微粒的可觀測熒光圖像；并且用觀測到的微粒熒光圖像作為參考校準熒光成像系統(tǒng)。
[0009]在還有另一個方面，本發(fā)明一般地涉及用于檢測樣品中生物物質(zhì)存在的方法。所述方法包含:將待檢測的用于確定生物物質(zhì)存在的樣品使用在激發(fā)波長的激發(fā)后能夠在檢測波長下發(fā)射熒光的染料進行染色；將待檢測樣品與預先確定量的、在激發(fā)波長下激發(fā)后能在檢測波長和參考波長兩者下發(fā)射熒光的微粒進行混合；在參考波長下獲得所述樣品的熒光圖像；在檢測波長下獲得所述樣品的熒光圖像；并且確定樣品中生物物質(zhì)的存在。
[0010]附圖簡沭
[0011]圖1顯示了一種示例性的現(xiàn)有技術(shù)細胞計數(shù)系統(tǒng)。
[0012]圖2顯示(左上)吖啶橙(AO)染色血液樣品的亮視野圖像；(右上)UV激發(fā)下的染色樣品，其導致沒有熒光信號；(左下)藍光激發(fā)下的染色樣品，其導致AO染色白細胞的明亮熒光信號。
[0013]圖3顯示了(左)紫外激發(fā)下的微球，其導致明亮的熒光信號；(右)在藍光激發(fā)下的微球，其不產(chǎn)生突光信號。
[0014]圖4顯示了(左)紫外激發(fā)下的微球，其導致明亮的熒光信號；(右)在藍光激發(fā)下的AO染色的微球，顯示出AO結(jié)合于微球并發(fā)射綠色熒光。
[0015]圖5顯示了(左)紫外激發(fā)下的微球，其導致明亮的熒光信號；(右)在藍光激發(fā)下的微球以及AO染色的白細胞，對于這兩種粒子都顯示出AO明亮的熒光。
[0016]圖6顯示了(左)紫外激發(fā)下的微球，其導致明亮的熒光信號；(右)在藍光激發(fā)下的微球以及AO染色的白細胞，對于這兩種粒子都顯示出AO明亮的熒光。紅線圓圈是在兩個頻率(channel)中都發(fā)熒光的微球。
[0017]圖7顯示了紫外激發(fā)下的微球，其導致明亮的熒光信號，而PI染色的Jurkat細胞只發(fā)射輕微熒光；(右)只有在藍光激發(fā)下的PI染色的Jurkat細胞顯示出PI明亮的熒光。紅線圓圈是在兩個頻率中都發(fā)熒光的微球。
[0018]圖8顯示了紫外激發(fā)的珠(綠色)和碘化丙啶(藍色)的激發(fā)和發(fā)射光譜。紫外光激發(fā)珠和PI染色Jurkat細胞兩者，并且長通濾波器收集二者的熒光，除了 Jurkat細胞更弱一些。藍光只激發(fā)PI ;因此，只有Jurkat細胞能夠被檢測到。
[0019]發(fā)明詳沭
[0020]本發(fā)明提供了一種獨特設(shè)計方法以及一種用于成像細胞儀的校準和內(nèi)部聚焦的顯著改進的系統(tǒng)。特別地，本發(fā)明提供了在測量、分析、計數(shù)或監(jiān)測顯微可見對象例如各種類型的生物細胞方面的改進。本發(fā)明的系統(tǒng)允許對在極低濃度下的細胞進行更精確的檢測以及測量。該新穎的方法顯著地降低了檢測限和增加了從成像細胞儀獲得的結(jié)果的置信度。
[0021]很多疾病的生物機制已經(jīng)通過對體液或組織樣本的微觀檢查而被闡明。組織病理學檢查也為對多種疾病有效醫(yī)學治療的發(fā)展提供了機會。在標準的解剖病理學中，基于細胞形態(tài)和染色特征進行診斷。對經(jīng)由標準方法(例如蘇木精和曙紅)染色組織樣本的微觀檢查和分類已經(jīng)顯著促進了癌癥的治療。例如，腫瘤樣品可以被檢查從而描繪出腫瘤類型并提示患者是否可能響應(yīng)于特定類型的化療。
[0022]傳統(tǒng)地，對基于細胞分析的熒光檢測使用熒光顯微鏡、熒光板閱讀器(fluorescent plate reader)或流式細胞儀進行。這些突光檢測方法通常引入昂貴的激發(fā)光源例如激光或弧光燈，從而具有高強度的激發(fā)。通常，存在激發(fā)光源和具有用來收集特定熒光信號的發(fā)射濾光器的檢測探針。在一種儀器例如熒光顯微鏡中，通常需要二向色濾光器來反射從頂部正常入射到目標生物樣品的光。發(fā)射的熒光經(jīng)由二向色濾光器進入檢測器(相機、分光儀等)然后被收集。
[0023]以前，NexcelomBioscience fluorescent Cellometer 技術(shù)在由光學鏡片、相機和樣品夾持器的組合件中使用Omega Optical提供的濾管。它能提供細胞和其他生物樣品的足夠的熒光圖像(圖1)。該技術(shù)提供了簡單且有效率的方法來產(chǎn)生生物樣品熒光圖像，但是對于低熒光信號檢測缺乏靈敏度。一個可歸因的因素是激發(fā)光在濾管中通過發(fā)射濾光器的泄漏。只有一個特定的濾管和一個LED能被用于一種顏色，沒有太多的空間引入其他顏色。
[0024]如本文所公開的，在本發(fā)明的一個實施方式中，使用熒光微球來開發(fā)一種用于低濃度去白細胞血液樣品的簡單內(nèi)部聚焦和校準方法。目前的熒光檢測白細胞方法是用吖啶橙(AO)核酸染料染色，并且使用480nm/525nm波長激發(fā)/發(fā)射。通過使用能夠在紫外(UV)光下激發(fā)并發(fā)射綠色熒光(525nm)的熒光微球，人們可以改變激發(fā)光源來檢測UV激發(fā)下用于聚焦的微球然后計數(shù)藍光激發(fā)的AO染色的白細胞。
[0025]本發(fā)明顯著改善了靈敏度和檢測限。
[0026]在一個方面，本發(fā)明一般地涉及用于確定樣品中目標細胞的存在或濃度的方法。該方法包含:將待檢測的用于確定目標細胞存在或濃度的樣品與預先確定量的微粒混合，其中所述目標細胞在第一激發(fā)波長下激發(fā)后能夠在第一檢測波長下發(fā)射熒光，并且其中所述微粒在第二激發(fā)波長激發(fā)后能夠在第二檢測波長下發(fā)射熒光；將樣品負載于熒光成像系統(tǒng)的樣品室；將光束導向樣品，其中所述光束包含第二激發(fā)波長；在第二檢測波長下獲得所述樣品的熒光圖像；用在第二檢測波長下獲得的熒光圖像校準熒光成像系統(tǒng)；將第二光束導向樣品，其中所述第二光束包含第一激發(fā)波長；在第一檢測波長下獲得所述樣品的熒光圖像；并且確定樣品中目標細胞的存在或濃度。
[0027]在一些實施方式中，目標細胞能在不用染料染色時發(fā)射突光。在另一些實施方式中，目標細胞只能在用染料染色時發(fā)射熒光。
[0028]在一些實施方式中，微粒能在不用染料染色時發(fā)射熒光。在另一些實施方式中，微粒只能在用染料染色時發(fā)射熒光。
[0029]在某些優(yōu)選的實施方式中，目標細胞用在第一激發(fā)波長下激發(fā)后能在第一檢測波長下發(fā)射熒光的第一染料染色，并且微粒用在第二激發(fā)波長下激發(fā)后能在第二檢測波長下發(fā)射熒光的第二染料染色。
[0030]在某些實施方式中，本方法包含對待檢測的用于確定目標細胞的存在或濃度的樣品用第一染料進行染色，其中第一染料在第一激發(fā)波長下激發(fā)后能在第一檢測波長下發(fā)射熒光；并且將待檢測的樣品和預先確定量的、其上結(jié)合有在第二激發(fā)波長下激發(fā)后能在第二檢測波長下發(fā)射熒光的第二染料的微粒混合。
[0031]在一些優(yōu)選的實施方式中，其上結(jié)合有第二染料的微粒在第二激發(fā)波長下激發(fā)后能在第一檢測波長下發(fā)射熒光。并且檢測樣品中目標細胞的存在或濃度包含將在第二檢測波長下獲得的樣品的熒光圖像和在第一檢測波長下獲得的樣品的熒光圖像進行比較。[0032]在某些實施方式中，校準熒光成像系統(tǒng)包含在作為參考的微粒上聚焦熒光成像系統(tǒng)。
[0033]待檢測的樣品可以具有少于約IO8細胞/毫升的目標細胞(例如，少于約IO7細胞/毫升、少于約IO6細胞/毫升、少于約IO5細胞/毫升、少于約IO4細胞/毫升、少于約IO3細胞/毫升、或少于約IO2細胞/毫升的目標細胞)。在某些實施方式中，待檢測的樣品在第一檢測波長下獲得的熒光圖像中由單一目標細胞組成。
[0034]使用本發(fā)明方法可以分析的樣品包含獲自或衍生自活有機體的生物物質(zhì)。這樣的樣品包含，但不限于，頭發(fā)、皮膚、組織、培養(yǎng)的細胞、培養(yǎng)的細胞介質(zhì)和體液。目標細胞可以是適合于用本發(fā)明方法檢測和測量的任何細胞，例如，白細胞、干細胞、脊髓細胞、滑液、體液細胞、牛乳體細胞和免疫表型。
[0035]在某些優(yōu)選的實施方式中，微粒是微球，例如，選自不同熒光波長的聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯珠。
[0036]在一些實施方式中,微球具有基本上均一的直徑，例如，從約3 μ m至約50 μ m的直徑、從約4 μ m至約30 μ m的直徑或從約5 μ m至約15 μ m的直徑。
[0037]第一染料可以選自適于特定應(yīng)用的任何染料，例如，吖啶橙、碘化丙啶(PI)和溴乙錠。
[0038]第二染料可以選自能夠在UV波長下激發(fā)和發(fā)射出綠色熒光的任何染色劑，例如，ProQ Emerald 300 或 Firefli 突光綠染料。
[0039]在一些實施方式中，第一激發(fā)波長選自約470nm至約550nm,例如，選自約480nm至約525nm。在一些實施方式中，第二激發(fā)波長選自約350nm至約400nm,例如，約375nm至約395nm。在一些其它實施方式中，第一激發(fā)波長選自約580nm至約650nm、約590nm至約640nm、約600nm至約630nm。第二激發(fā)波長選自約470nm至約525nm。
[0040]在一些實施方式中，第一檢測波長選自約500nm至約640nm,例如，選自約510nm至約600nm。在一些實施方式中，第二檢測波長與第一檢測波長相同，例如選自約510nm至約600nm、約 690nm 至約 750nm 或約 700nm 至約 740nm。
[0041]在另一個方面，本發(fā)明一般地涉及一種用來校準用于在低濃度下測量目標細胞的熒光成像系統(tǒng)的方法。所述方法包含:制備一種包含預先確定量的、其上結(jié)合有能發(fā)射熒光的染料的微粒的樣品；將光束導向樣品，其中所述光束包含能對所述染料進行熒光激發(fā)的波長，從而產(chǎn)生所述微粒的可觀測熒光圖像；并且用觀測到的微粒熒光圖像作為參考來校準熒光成像系統(tǒng)。
[0042]在一些實施方式中，校準熒光成像系統(tǒng)包含用微粒作為定量參考來正確地聚焦熒光成像系統(tǒng)。
[0043]在一些其它實施方式中，校準熒光成像系統(tǒng)包含測量用作定量內(nèi)部參考的微粒的一種或多種性質(zhì)，例如，微粒的粒度和熒光強度。
[0044]在還有另一個方面，本發(fā)明一般地涉及用于檢測樣品中生物物質(zhì)存在的方法。所述方法包含:將待檢測的用于確定生物物質(zhì)存在的樣品用在激發(fā)波長下激發(fā)后能在檢測波長下發(fā)射熒光的染料染色；將待檢測的樣品與預先確定量的、在激發(fā)波長下激發(fā)后能在檢測波長和參考波長兩者下發(fā)射熒光的微粒進行混合；在參考波長下獲得所述樣品的熒光圖像；在檢測波長下獲得所述樣品的熒光圖像；并且確定樣品中生物物質(zhì)的存在。實施例
[0045]材料和儀器
[0046]首先，為了開發(fā)內(nèi)部聚焦參考方法，檢查了兩種類型的微球。兩種微球都能在UV下激發(fā)和發(fā)射綠色波長。微球#2也能被藍光激發(fā)和發(fā)射出綠光。測量微球在UV和藍光下的激發(fā)，以觀察其熒光輸出。血液樣品或者受試者，通過刺破他的手指來收集少量血。吖啶橙染料被制成10 μ g/ml用于染色血液樣品中的白細胞。在開發(fā)內(nèi)部聚焦參考微球時，使用The Cellometer Vision(Nexcelom)系統(tǒng)。該系統(tǒng)包含兩個過濾器套件。一個套件具有在UV范圍內(nèi)的激發(fā)和發(fā)射出綠光，另一個套件具有藍色范圍內(nèi)的激發(fā)和相同的綠光發(fā)射。
[0047]初始突光檢測測量
[0048]首先，用5 μ I的AO染色20微升血液樣品并用綠光發(fā)射濾光器觀察其在UV和藍色激發(fā)下的突光。染色的血液(20 μ I)被移液至Cellometer的計數(shù)室并使用CellometerVision系統(tǒng)來檢測熒光。接下來，微球被移至室并且在系統(tǒng)中也測量了他們的熒光。最后，將微球與AO混合并再次在系統(tǒng)中測量熒光。
[0049]內(nèi)部聚焦參考方法
[0050]選自之前的實驗中的合適的微球與AO染色的血液樣品混合。將20微升血液樣品、5 μ I的AO和5 μ I微球混合?；旌衔锉灰埔褐罜ellometer計數(shù)室并得到白細胞計數(shù)的圖像。
[0051]初始突光檢測測量
[0052]AO染色的血液樣品的熒光圖像顯示于圖2。AO染色白細胞的熒光信號在藍光激發(fā)下是高的，并且在UV激發(fā)下沒有信號。亮視野圖像也顯示于圖2中，其中紅血細胞覆蓋整個圖像，因而白細胞僅能在熒光下被觀察到。
[0053]微球的熒光圖像顯示于圖3。微球的熒光信號在UV激發(fā)下是高的，并且如同預期一樣在藍光激發(fā)下沒有信號。結(jié)果顯示AO染色的血液及微球混合物能用于在UV頻率下聚焦樣品并且在藍光色頻率下僅計數(shù)AO染色的白細胞。
[0054]與AO混合的微球的突光圖像顯不于圖4。如同預期一樣,微球突光信號在UV激發(fā)下是高的。然而，在藍光頻率，AO結(jié)合于微球并在藍光激發(fā)下發(fā)射熒光。微球用前面提及的第二種類型代替，其在兩種激發(fā)光源下都發(fā)射熒光。
[0055]內(nèi)部聚焦參考方法
[0056]與微球混合的AO染色血液樣品的突光圖像顯不于圖5?；旌衔锿还庑盘柋砻髟赨V激發(fā)下僅有明亮微球熒光，而在藍光激發(fā)下微球和AO染色白細胞兩者都是高的。
[0057]通過在UV激發(fā)頻率下識別微球并利用他們進行聚焦，通過從藍光頻率的總計數(shù)中減去微球計數(shù)從而可以在藍光頻率下計數(shù)實際的白細胞。該方法可用于當血液樣品中白細胞濃度非常低，其中只有一個或甚至沒有細胞被檢測到時。如果是這樣的話，聚焦參考微球能夠確保圖像被聚焦在對象的焦平面上，因而在去白細胞血液樣品是合格的情況下不產(chǎn)生偏差。
[0058]實施例1白細胞成像
[0059]用大幅照相機對大量血液進行成像，特別是用于確認去白細胞血液樣品的白細胞計數(shù)。拍攝了兩個圖像(圖6)，一個具有UV激發(fā)和另一個具有藍光。血液樣品用吖啶橙染色劑和在兩個頻率下都發(fā)射熒光的熒光珠稀釋至1:1。
[0060]在UV激發(fā)頻率下只計數(shù)珠并且在藍光激發(fā)頻率下計數(shù)所有的顆粒(珠+AO染色白細胞)，相減得到了血液樣品中白細胞濃度的測量值。
[0061]實施例2白細胞成像
[0062]使用PI染色的Jurkat，以及具有510nm長通濾波器的光學組件QMAX藍和具有51Onm長通濾波器的535nm_401nm，在UV和藍光激發(fā)下取得了兩個圖像(圖7和圖8)。
[0063]在檢測PI染色Jurkat的頻率下，沒有觀測到珠的熒光信號。方法將涉及用珠在UV激發(fā)下聚焦，然后轉(zhuǎn)換至藍光激發(fā)并計數(shù)PI染色的所有細胞。該方法相比于前面描述的方法更簡單，其中不需要進行相減。本方法是使用一種頻率用珠聚焦，并然后轉(zhuǎn)換至另一個頻率計數(shù)所有的細胞。
[0064]引入作為參考
[0065]在本公開中已經(jīng)參考并引用了其它文獻，例如專利、專利申請、專利公開、雜志、書籍、論文、網(wǎng)絡(luò)內(nèi)容。出于所有的目的，所有這些文件以其全部內(nèi)容在此通過引用并入本文。
[0066]等同物
[0067]代表性的實施例旨在幫助解釋本發(fā)明，并不旨在也不應(yīng)該被解釋成用于限制本發(fā)明的范圍。實際上，根據(jù)本文件的全部內(nèi)容(包含實施例和本文引入的對科學及專利文獻的引用)，對本領(lǐng)技術(shù)人員而言，除了本文顯示和描述的這些內(nèi)容，對本發(fā)明的各種修改及其許多其它實施方式都是顯而易見的。實施例包含重要的附加信息、例證和指導，其能在其各種實施方式及其等價物中來適應(yīng)于實施本發(fā)明。
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測樣品中目標細胞存在或濃度的方法，其包含: 將待檢測的用于確定目標細胞的存在或濃度的樣品與預先確定量的微?；旌?，其中所述目標細胞在第一激發(fā)波長下激發(fā)后能在第一檢測波長下發(fā)射熒光，并且其中所述微粒在第二激發(fā)波長下激發(fā)后能在第二檢測波長下發(fā)射熒光； 將樣品負載于熒光成像系統(tǒng)的樣品室； 將光束導向樣品，其中所述光束包含第二激發(fā)波長； 在第二檢測波長下獲得所述樣品的熒光圖像； 用在第二檢測波長下獲得的熒光圖像校準熒光成像系統(tǒng)； 將第二光束導向樣品，其中所述第二光束包含第一激發(fā)波長； 在第一檢測波長下獲得所述樣品的熒光圖像；和 測定樣品中目標細胞的存在或濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述目標細胞能在不用染料染色時發(fā)射熒光。
3.根據(jù)權(quán)利要求 1的方法，其中所述目標細胞能在用染料染色時發(fā)射熒光。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述微粒能在不用染料染色時發(fā)射熒光。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述微粒能在用染料染色時發(fā)射熒光。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述目標細胞用在第一激發(fā)波長下激發(fā)后能在第一檢測波長下發(fā)射熒光的第一染料染色，并且 其中所述微粒用在第二激發(fā)波長下激發(fā)后能在第二檢測波長下發(fā)射熒光的第二染料染色。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其包含: 將待檢測的用于確定目標細胞的存在或濃度的樣品用第一染料染色，其中所述第一染料在第一激發(fā)波長下激發(fā)后能在第一檢測波長下發(fā)射熒光；和 將待檢測的樣品與預先確定量的、其上結(jié)合有在第二激發(fā)波長下激發(fā)后能在第二檢測波長下發(fā)射熒光的第二染料的微?；旌稀?br> 8.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中在其上結(jié)合有第二染料的所述微粒在第二激發(fā)波長下激發(fā)后能在第一檢測波長下發(fā)射熒光，并且 其中確定樣品中目標細胞的存在或濃度包含將在第二檢測波長下獲得的樣品熒光圖像與在第一檢測波長下獲得的樣品熒光圖像進行比較。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中校準所述熒光成像系統(tǒng)包含將熒光成像系統(tǒng)聚焦在作為參考的微粒上。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述待檢測的樣品包含少于約IO8細胞/毫升的目標細胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述待檢測的樣品包含少于約IO5細胞/毫升的目標細胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述待檢測的樣品由在第一檢測波長下獲得的熒光圖像中的單一目標細胞組成。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述目標細胞選自白細胞、干細胞、脊髓細胞、滑液、體液細胞、牛乳體細胞和免疫表型。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述微粒是微球。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述微粒選自:各種熒光波長的聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯珠。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的方法,其中所述微球具有實質(zhì)上均一的直徑。
17.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述微球的直徑是約3μ m至約50 μ m。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述微球的直徑是約5μ m至約15 μ m。
19.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第一染料選自:吖啶橙、碘化丙啶和溴乙錠。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述第一染料是碘化丙啶。
21.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第二染料選自能在UV波長下激發(fā)并發(fā)射綠色熒光的染色劑。
22.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第二染料是ProQEmerald 300。
23.根據(jù)權(quán)利要求1的方法·，其中所述第二染料是Firefli熒光綠染料。
24.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第一激發(fā)波長選自約470nm至約550nm。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法,其中所述第一激發(fā)波長選自約480nm至約525nm。
26.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第二激發(fā)波長選自約350nm至約400nm。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法,其中所述第二激發(fā)波長選自約375nm至約395nm。
28.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第一檢測波長選自約500nm至約640nm。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法,其中所述第一檢測波長選自約510nm至約600nm。
30.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第二檢測波長與第一檢測波長相同。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法,其中所述第二檢測波長選自約510nm至約600nm。
32.一種用于校準用來測量低濃度下目標細胞的熒光成像系統(tǒng)的方法，其包含: 制備包含預先確定量的、其上結(jié)合有能發(fā)射熒光的染料的微粒； 將光束導向樣品，其中所述光束包含能對染料進行熒光激發(fā)的波長，從而產(chǎn)生微粒的可觀測熒光圖像；以及 用所述微粒的可觀測熒光圖像作為參考來校準所述熒光成像系統(tǒng)。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中校準所述熒光成像系統(tǒng)包含用微粒作為定量參考對熒光成像系統(tǒng)正確地聚焦。
34.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中校準所述熒光圖像系統(tǒng)包含測量作為定量內(nèi)部參考的微粒的一種或多種性質(zhì)。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述微粒的一種或多種性質(zhì)是粒度和熒光強度。
36.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述待測試的樣品包含少于約IO8細胞/毫升的目標細胞。
37.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述微粒是微球。
38.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述微粒是聚苯乙烯或聚甲基丙烯酸甲酯。
39.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中所述微球具有實質(zhì)上均一的直徑。
40.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中所述微球的直徑是約3μ m至約50微米。
41.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中所述微球的直徑是約5μπι至約15微米。
42.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述染料選自:吖啶橙、碘化丙啶和溴乙錠。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中所述染料是碘化丙啶。
44.根據(jù)權(quán)利要求32的方法,其中所述激發(fā)波長選自約470nm至約550nm。
45.根據(jù)權(quán)利要求44的方法,其中所述激發(fā)波長選自約480nm至約525nm。
46.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中獲得所述熒光圖像的波長選自約350nm至約400nm。
47.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中所述熒光圖像在約375nm至約395nm獲得。
48.一種用于檢測樣品中生物物質(zhì)存在的方法，其包含: 將待檢測的用于確定生物物質(zhì)存在的樣品用在激發(fā)波長下激發(fā)后能在檢測波長下發(fā)射熒光的染料染色； 將待檢測的樣品與預先確定量的、在激發(fā)波長下激發(fā)后能在檢測波長和參考波長二者下發(fā)射突光的微粒混合； 在參考波長下獲得樣品的熒光圖像； 在檢測波長下獲得樣品的熒光圖像；和 確定樣品中生物物質(zhì)的存在。
49.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述待檢測的樣品包含少于約IO8細胞/毫升的生物物質(zhì)。
50.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述微粒是微球。
51.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述微粒是聚苯乙烯或聚甲基丙烯酸甲酯。
52.根據(jù)權(quán)利要求50的方法,其中所述微球具有基本上均一的直徑。
53.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中所述微球的直徑是約3μ m至約50 μ m。`
54.根據(jù)權(quán)利要求53的方法，其中所述微球的直徑是約5μπι至約15μ m。
55.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述染料選自:卩丫啶橙、碘化丙唆、溴乙錠和其他核酸染色劑。
56.根據(jù)權(quán)利要求55的方法，其中所述染料是碘化丙啶。
57.根據(jù)權(quán)利要求48的方法,其中所述激發(fā)波長選自約470nm至約550nm。
58.根據(jù)權(quán)利要求57的方法,其中所述激發(fā)波長選自約480nm至約525nm。
59.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述參考激發(fā)波長選自約350nm至約400nm。
60.根據(jù)權(quán)利要求48的方法,其中所述檢測波長選自約510nm至約600nm。
【文檔編號】G01N33/53GK103443625SQ201180054859
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2011年10月20日 優(yōu)先權(quán)日:2010年10月21日
【發(fā)明者】L·L·常, J·丘, P·李, K·弗拉納根, T·史密斯 申請人:耐克思樂生物科學有限責任公司