專利名稱：用于體外基因毒性試驗的合適的肝細(xì)胞的制作方法
用于體外基因毒性試驗的合適的肝細(xì)胞本發(fā)明涉及借助于增殖的生理活性肝細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)對化學(xué)、生物和物理活性物質(zhì)或試劑進(jìn)行基因毒性試驗的方法。該方法特別適合人類和動物中已知藥物和新藥和活性物質(zhì)以及其組合的基因毒性試驗。而且，它適合測試食物、化妝品、紡織品、材料中的化學(xué)或生物學(xué)活性物質(zhì)和其它物質(zhì)在人類和動物中的基因毒性效應(yīng)。在許多工業(yè)領(lǐng)域如制藥、化妝品、食品和化學(xué)工業(yè)中，例如，新的化學(xué)品和/或生物學(xué)活性物質(zhì)和其組合被不斷地發(fā)展，其對人們健康的潛在的有害效應(yīng)通常是未知的。這里，完全不同的效應(yīng)可發(fā)生在人類或動物中。除了在治療意義內(nèi)的預(yù)期效應(yīng)，藥物、化學(xué)品或生物學(xué)活性物質(zhì)還可，例如，產(chǎn)生不希望的副作用如肝損傷、對心肌的損傷、神經(jīng)毒性或致畸性。就此可能導(dǎo)致器官的許多細(xì)胞喪失直至退行性器官疾病，例如心力衰竭或肝損傷。該毒性的原因可能在于細(xì)胞的基本所有區(qū)室和功能的受損傷或受影響，這是說，例如，細(xì)胞膜的損傷、對生理過程如細(xì)胞呼吸、胞內(nèi)運輸、信號傳導(dǎo)和基因表達(dá)的影響——僅舉幾個例子。本發(fā)明涉及試劑對人類或動物細(xì)胞中的遺傳物質(zhì)DNA構(gòu)成的直接或間接作用及其借助所謂的基因毒性試驗的適宜的測試。提供用于測試的適宜細(xì)胞是醫(yī)學(xué)和診斷的挑戰(zhàn)，特別在體外細(xì)胞體系——包括相關(guān)的細(xì)胞培養(yǎng)物——的發(fā)展中。因此，對建立與人類細(xì)胞盡最大程度可能相似的細(xì)胞培養(yǎng)物/細(xì)胞體系存在大的需求，以便可進(jìn)行有效的體外基因毒性試驗?，F(xiàn)有技術(shù)已建立了細(xì)胞系，其是可在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上無限地繁殖和永生的細(xì)胞。特別地已知腫瘤細(xì)胞或腫瘤樣細(xì)胞，如HeLa細(xì)胞-宮頸癌細(xì)胞系、COS細(xì)胞、HEK-293細(xì)胞-腎、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、HEp-2-人上皮細(xì)胞喉癌細(xì)胞系和更多的細(xì)胞系。這樣的細(xì)胞系的產(chǎn)生例如描述于EP833934(Crucell)，這樣的細(xì)胞系例如用于藥物檢測。然而，這樣的細(xì)胞系的缺點是遺傳改變(如點突變、染色體部分易位(重排)、基因拷貝數(shù)增加(基因擴增)、甚至染色體組改變(非整倍性))以及由于缺乏接觸抑制的腫瘤性質(zhì)，借此細(xì)胞能夠在軟瓊脂基質(zhì)上體外生長。腫瘤細(xì)胞額外具有由無限增殖性而產(chǎn)生的不受限的分裂能力。已知由于自發(fā)突變，這樣的細(xì)胞系的細(xì)胞在培養(yǎng)過程中逐漸轉(zhuǎn)變并可發(fā)展成惡性細(xì)胞群并在遺傳上不穩(wěn)定。基于發(fā)明人的認(rèn)識，僅大約60次細(xì)胞分裂之后，在培養(yǎng)物中出現(xiàn)累積突變的臨界閾。這些可以是導(dǎo)致癌基因的激活或腫瘤抑制基因的失活的突變。因此，能夠在細(xì)胞群中占優(yōu)勢的細(xì)胞是由于累積突變而顯示增加的細(xì)胞分裂活性的那些細(xì)胞。該選擇過程對應(yīng)于腫瘤進(jìn)展中的癌前狀態(tài)；另外，商業(yè)上可獲得的細(xì)胞系如果它們不源于惡性腫瘤細(xì)胞開始，通常已經(jīng)歷了未知數(shù)目的倍增過程。此外，以下的基因毒性試驗在現(xiàn)有技術(shù)中被描述:在所謂的埃姆斯試驗(Ames et al., 1973a; Ames et al.，1973b)中,將由于突變，例如基因中的點突變，不再能夠合成特定氨基酸(營養(yǎng)缺陷型突變體)的細(xì)菌施加到不含有該氨基酸的培養(yǎng)基(瓊脂)。因為這些細(xì)菌依賴該氨基酸用于它們繼續(xù)的生存，所以它們將死亡或不能在該營養(yǎng)缺乏的培養(yǎng)基上繁殖。然后將細(xì)菌暴露于潛在的誘變物質(zhì)，例如通過將在其中浸透的濾紙置于培養(yǎng)基上。如果在隨后的溫育之后所謂的細(xì)菌菌落形成，那么單一細(xì)菌已生長并已恢復(fù)合成相應(yīng)的氨基酸的能力。這些被稱作回復(fù)菌落，其中導(dǎo)致營養(yǎng)缺陷的基因中的點突變已被逆轉(zhuǎn)。在染色體畸變試驗中，將待測物質(zhì)與細(xì)胞溫育。確定的溫育時期之后，分析發(fā)生的染色體畸變，例如通過核型分析。該方法允許多個染色體畸變可見，如，例如，雙著絲粒染色體的發(fā)展、染色體斷裂和姐妹染色單體互換(Morita et al.，1989)。 Broschinski和同事們報道了 776化學(xué)物質(zhì)的常規(guī)基因毒性測試，其中細(xì)菌突變試驗(埃姆斯試驗)和染色體畸變試驗的組合為檢測誘變劑提供最佳的靈敏度(Broschinski et al., 1998)。許多試劑僅在動物或人類中發(fā)揮基因毒性，如果這些被肝臟的酶化學(xué)地修飾。分化的肝細(xì)胞，因為它們存在于未受損的肝臟中，在體內(nèi)具有許多種功能，這些功能對食物還有藥物或毒素中物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化是重要的(Elaut et al.，2006中概述)。細(xì)胞色素P450系統(tǒng)的I期酶對生物轉(zhuǎn)化是重要的。在人類中，發(fā)現(xiàn)了很多同工酶，如CYP1A1、CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7、CYP4A11，其執(zhí)行不同的功能。對于一些同工酶，已知多態(tài)性，其可以是產(chǎn)生藥物對肝臟的毒性作用中個體變異性的原因。CYP450酶是氧化還原酶，其造成包括藥物在內(nèi)的很多物質(zhì)的氧化降解或代謝。除了 I期酶還存在II期酶，例如N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶[NATs]以及UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(glucorony I transferases)和橫基轉(zhuǎn)移酶。一般而言，為了評價活性物質(zhì)候選物和化學(xué)品的潛在的肝毒性，CYP450系統(tǒng)、II期酶的功能性以及其它肝功能具有決定性的重要性。為了考慮該情況，埃姆斯試驗通常結(jié)合將利用肝臟酶測試的物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化來進(jìn)行。為了該目的，通常使用所謂的S9混合物，其是幾種肝臟酶的混合物以便模擬肝臟?？s寫“S9”指肝細(xì)胞提取物在9000g離心的上清液。例如，De Flora等報道了如果非那西丁的溫育對倉鼠肝臟的S9部分進(jìn)行，那么物質(zhì)非那西丁只在埃姆斯試驗中測試為陽性(De Flora S.et al.，1985)。只通過肝細(xì)胞中有活性的酶將該物質(zhì)轉(zhuǎn)變成可在埃姆斯試驗中檢測的誘變形式。檢測試劑的DNA損傷效應(yīng)的另一個選擇是所謂的彗星實驗，也被稱作單細(xì)胞凝膠電泳(Singh et al.，1988)。彗星實驗的原理基于將包埋入瓊脂糖中的細(xì)胞溶解(lysiert)。然后將細(xì)胞的DNA暴露于電場。如果DNA被物質(zhì)或物理作用損傷，那么其將從細(xì)胞核中出來并向著陽極移動，而未受損的染色體DNA不能如此。在UV顯微鏡下，現(xiàn)在觀察到損傷的細(xì)胞——其先前用熒光染料如溴乙啶染色——則具有由DNA碎片構(gòu)成的尾，給予它們彗星的外觀。彗星尾的長度是DNA損傷的量度。彗星實驗測量DNA鏈斷裂的水平，但是不提供關(guān)于潛在的DNA損傷的直接信息。已在過去的幾年里漸增使用的基因毒性試驗是所謂的微核試驗，通過該試驗可以比用染色體畸變試驗明顯更容易和更快速地檢測細(xì)胞遺傳學(xué)變化。微核含有細(xì)胞核的部分——其由于不同的分子原因(由于誘裂效應(yīng)的染色體損傷、由于非整倍體效應(yīng)的染色體分離的損傷)沒有進(jìn)入子核中，但在細(xì)胞質(zhì)中呈現(xiàn)為染色質(zhì)顆粒。微核發(fā)生的數(shù)目或頻率是細(xì)胞遺傳不穩(wěn)定性的量度。細(xì)胞分裂通常隨新的微核發(fā)展是必需的。在由于細(xì)胞松弛素B而在有絲分裂方面被抑制的細(xì)胞中，試驗處理產(chǎn)生的新的微核可在雙核細(xì)胞中被定量，而代表測量背景的“舊的”微核在單核細(xì)胞中測定(Fenech和MorIey，1985 )。由于引入了該技術(shù)，所以微核正被漸增地分析作為基因毒性的生物指示物。這主要由于與雙著絲粒染色體或另外畸變的染色體的評價相比，對微核的評價相對簡單和快速的事實。而且，微核計數(shù)的自動化比染色體畸變更容易做，或可能比彗星實驗更更容易做。微核試驗經(jīng)常在中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞V79細(xì)胞系或在人外周血淋巴細(xì)胞中進(jìn)行。在許多檢測中，常常將不同試驗組合以獲得最可靠的信息可能性:例如Rossi和同事們用埃姆斯試驗、染色體畸變試驗和微核試驗進(jìn)行了雌激素的潛在基因毒性的檢測(Rossi et al.，2007)。W02004/034013描述了可選的體外基因毒性試驗，其基于含有人類11號染色體的特定的CHO細(xì)胞系。該雜交細(xì)胞系表達(dá)人CD59蛋白，其將自身呈現(xiàn)在細(xì)胞表面上。突變可導(dǎo)致表面上喪失該呈現(xiàn)，這可通過合適的免疫學(xué)檢測方法來檢測。這些試驗的問題是至今它們不是十分可靠的，而且它們耗時且花費大。制藥工業(yè)招致基因毒性試驗的高成本。根據(jù)2004年12月劍橋健康技術(shù)進(jìn)步生命科學(xué)(CambridgeHealthtech Advances Life Sciences)報道的估計,不精確地預(yù)測的基因毒性占所謂的藥物失敗成本的大約30%。美國專利申請US2008/0138820A1描述了基于微核試驗的多參數(shù)基因毒性試驗。在那里，將利用GFP組成型表達(dá)來自著絲粒蛋白的融合蛋白的構(gòu)建物引入目標(biāo)細(xì)胞系。該功能允許微核被檢測到，其通過非整倍體機制形成。硝基還原酶編碼序列——其酶活性通過合成底物CytoCy5S (GE Healthcare)的熒光轉(zhuǎn)換可被檢測——存在于第二表達(dá)構(gòu)建物上。如果將硝基還原酶可操作地連接到受DNA損傷激活的啟動子(例如GADD45a啟動子)，那么誘裂的基因毒性效應(yīng)可被檢測。通過加入另外的細(xì)胞參數(shù)，如增殖指數(shù)和細(xì)胞毒性，可將適合各自細(xì)胞體系的算法應(yīng)用于潛在的基因毒性物質(zhì)的多參數(shù)分析。然而，對使用用于體外基因毒性試驗的合適的細(xì)胞——其非常接近人類細(xì)胞和具有有利的體外穩(wěn)定性和代謝功能性——存在很大需求。尤其用基因毒性試驗，現(xiàn)有技術(shù)中的問題已是人肝細(xì)胞的代謝在細(xì)胞系中不被充分考慮并因此在外測試環(huán)境中測試的試劑提供假陽性或甚至錯的結(jié)果。因此，本發(fā)明的目的是提供合適的肝細(xì)胞用于進(jìn)行體外基因毒性試驗。該目的通過權(quán)利要求1完全實現(xiàn)。增殖性肝細(xì)胞(增殖中的肝細(xì)胞)令人驚訝地顯示以下優(yōu)勢:根據(jù)本發(fā)明的增殖性肝細(xì)胞的生理學(xué)相關(guān)的性質(zhì)如下，其具有至少六種不同的I期酶功能中的至少四種(甚至在增殖期)，優(yōu)選選自CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4，其是產(chǎn)生藥物全部氧化代謝的大約90%的原因(Arimoto、2006)，和因此還特別地含有超過6種不同的I期酶，特別地十種不同I期酶，優(yōu)選CYP1A1、CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4,特別地十三種不同的 I期酶，特別地 CYPlAl、CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7、CYP4A11。另外，來自現(xiàn)有技術(shù)的假陽性和錯誤結(jié)果的問題也被完全解決，因為這些增殖性肝細(xì)胞:a.在增殖期間具有活性I期和II期活性；b.在酶供應(yīng)中具有顯著的活性——其對應(yīng)于體內(nèi)條件；c.具有保持?jǐn)?shù)天的I期活性；
d.具有通過試劑可被誘導(dǎo)的酶活性；e.因此消除了通過微粒體的外部代謝；f.相當(dāng)大地減少了來自不能透過細(xì)胞的活性試劑的假陽性結(jié)果；和g.在試劑已進(jìn)入細(xì)胞之后，試劑自身和產(chǎn)生的代謝物可作用于DNA，因此由于測試物質(zhì)的不充分的代謝，消除或相當(dāng)大地減少了假陰性結(jié)果。這樣的合適的肝細(xì)胞的富集，例如，在申請人的W02009030217中被描述，其優(yōu)選可從原代細(xì)胞獲得。而且，增殖性肝細(xì)胞可同樣從其它前體細(xì)胞，如干細(xì)胞、成體細(xì)胞和可被分化的其它細(xì)胞獲得。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，術(shù)語“原代細(xì)胞”將被理解為直接從體液或從體組織獲得的移出物，其具有正常的，即非退化的多細(xì)胞生物如人類、哺乳動物或合適的供體的細(xì)胞。原代細(xì)胞培養(yǎng)物是已被培養(yǎng)直到第一代的原代細(xì)胞。原代細(xì)胞具有天然的分化性質(zhì)并不是永生的。為了在體外保持細(xì)胞，必須利用補償每次細(xì)胞分裂發(fā)生的染色體端粒縮短的方法。一種這樣的選擇是利用端粒酶(Harley, C.B.and B.Villeponteau.1995.Telomeresand telomerase in aging and cancer.Curr.0pin.Genet.Dev.5:249—255)。倉泛補償端粒的損失例如通過端粒酶的細(xì)胞可生長無限數(shù)目的細(xì)胞分裂并具有永生性。然而，在細(xì)胞分裂過程中，存在突變發(fā)生的不可避免的缺點，突變發(fā)生遲早必定導(dǎo)致癌癥的發(fā)展。為了在體外保持人原代細(xì)胞或可分化的細(xì)胞，可進(jìn)行以下步驟:將原代細(xì)胞或可分化的細(xì)胞:a.)分離；bl.)將至少一個增殖基因或其基因產(chǎn)物功能性引入細(xì)胞；和/ 或b2.)用至少一個誘導(dǎo)細(xì)胞分裂停滯的細(xì)胞因子進(jìn)行失活；和/或b3.)瞬時地?zé)o限增殖；c.)培養(yǎng)和/或傳代。然而，使用的起始材料優(yōu)選是人原代肝細(xì)胞，其可通過例如，活組織檢查獲得。優(yōu)選，與原代細(xì)胞相比，可進(jìn)行超過十個另外的傳代，或超過20至60個另外的傳代。根據(jù)本發(fā)明，獲得如上面所描述的增殖性肝細(xì)胞，其高度適合進(jìn)行基因毒性試驗。特別有利地，可獲得細(xì)胞，其不呈現(xiàn)腫瘤細(xì)胞，更特別地惡性腫瘤細(xì)胞的任何性質(zhì)，如在軟瓊脂中生長或體內(nèi)腫瘤生長(異種移植動物模型中腫瘤的生長)。將這樣的細(xì)胞在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的細(xì)胞培養(yǎng)基上培養(yǎng)。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，增殖基因是在可被有限程度地增加的原代細(xì)胞中改善細(xì)胞分裂和賦予細(xì)胞分裂能力的基因，其中與來自現(xiàn)有技術(shù)的細(xì)胞系相比，細(xì)胞轉(zhuǎn)化或分化性質(zhì)改變的可能性顯著減小。根據(jù)本發(fā)明，增殖基因優(yōu)選選自病毒增殖基因:乳頭狀瘤病毒如HPV (人乳頭狀瘤病毒)和BPV (牛乳頭狀瘤病毒)的E6和E7 ;多瘤病毒如SV40、JK病毒和BC病毒的大的和小的腫瘤抗原(TAgs);腺病毒的ElA和ElB蛋白、EB病毒(EBV)的EBNA蛋白；以及HTLV和松鼠猴皰疹病毒的增殖基因和各自的編碼蛋白或其嵌合體，選自細(xì)胞增殖基因，特別地選自以下基因種類:myc、jun、ras、src、fyg、myb、E2F和Mdm2和TERT (酶端粒酶的催化亞基)，優(yōu)選人端粒酶(hTERT )。然而，根據(jù)本發(fā)明，病毒增殖基因是優(yōu)選的，HPV或BPV的E6和E7特別優(yōu)選。為此，可使用HPV型的增殖基因，其與惡性疾病相關(guān)。高危乳頭狀瘤病毒的最已知的實例是HPV16 和 HPV18。高危組的另外實例包括 HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73 和82。然而，還可能使用所謂的低危HPVs的E6和E7增殖基因。已知的實例包括HPV6和11型，低危組的其它HPV型包括HPV40、42、43、44、54、61、70、72和81。而且，相應(yīng)的嵌合體或嵌合基因產(chǎn)物可任意組合和使用。E6蛋白連同增殖的增加的意義首先的是在于p53途徑的失活和在于端粒酶的誘導(dǎo)。E7蛋白連同增殖的增加的意義首先是在于pRB途徑的失活。結(jié)合本發(fā)明，還可能組合一個病毒種或不同病毒種的不同血清型的增殖基因或甚至可能產(chǎn)生和使用一個病毒種或不同病毒種的不同血清型的嵌合增殖基因。例如，嵌合基因中的一個E6結(jié)構(gòu)域可源自HPV16，例如，而另一個源自HPV6。當(dāng)然增殖基因還可被截短或具有一個或多個堿基交換，而不背離本發(fā)明的范圍。前面提到的增殖基因代表優(yōu)選的實施方式并不期望限制本發(fā)明。增殖基因可任選地是合成的或人工產(chǎn)生的基因序列的主題。將這些因子“功能性引入”靶細(xì)胞，假定其細(xì)胞分裂能力增加，并且為了該目的，可使用以下基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，而不限于此:上面提到的基因功能的表達(dá)構(gòu)建物通過傳統(tǒng)的磷酸鈣方法(Wigler, M.et al.，1977.Cellll: 223-232)、通過脂轉(zhuǎn)染(Feigner, P.L.et al, 1987.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A84:7413-7417)、通過電穿孔(Wolf’H.etal., 1994.Biophys.J.66:524-531 )、通過顯微注射(Diacumakos, E.G.1973.Methods CellBiol.7:287-311)、通過結(jié)合物——其通過細(xì)胞受體或不依賴受體而獲得——轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞。上面提到的基因功能還可通過病毒載體轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞。實例包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、AAV載體、腺病毒載體和HSV載體，僅舉幾個載體的例子(病毒載體的概述在=Lundstrom, K.2004.Technol.Cancer Res.Treat.3: 467-477 ; Robbins, P.D.and S.C.Ghivizzan1.1998.Pharmacol.Ther.80:35-47中)。術(shù)語“功能地引入”包括特別地通過至少一個增殖基因?qū)Π屑?xì)胞進(jìn)行的轉(zhuǎn)染。上面提到的病毒或細(xì)胞增殖基因的表達(dá)可受強或弱的組成型啟動子、組織特異性啟動子或誘導(dǎo)型啟動子(Meyer-Ficca, M.L.et al.2004.Anal.Biochem.334:9-19)的調(diào)控，或表達(dá)盒可位于分子切除系統(tǒng)的特定序列兩側(cè)。實例包括Cre/Lox系統(tǒng)(美國專利4，959，317)，其使用導(dǎo)致表達(dá)構(gòu)建物從靶細(xì)胞基因組分子去除。在另外的實施方式中，像這樣或通過融合蛋白可同樣地將增殖基因的基因產(chǎn)物直接功能地引入靶細(xì)胞。優(yōu)選這些是信使蛋白(轉(zhuǎn)運蛋白)如VP22、HIV TAT (Suzuki etal.，277J.Biol.Chem.2437-24432002 和 Futaki245Int.J.Pharmaceut.1-7 (2002)，(HIV)REV, Antennapedia Polypeptid (W097/12912 和 W099/11809)或 Penetratin (Derossiet al., 8Trends Cell Biol.,84-87 (1998)、Engrailed (Gherbassi, D.&Simon, H.H.J.Neural Transm.Suppl47-55 (2006)> Morgan, R.580FEBS Lett., 2531-2533 (2006)、Han,K.et al.1OMol.Cells728-732 (2000))或 Hoxa-5 (Chatelin et al.55Mech.Dev.111-117 (1996))、由L-精氨酸或D-精氨酸氨基酸殘基形成的聚合物(Can.PatentN0.2，094，658; U.S.Pat.N0.4，701，521; W098/52614)、由 L-賴氨酸或 D-賴氨酸氨基酸殘基形成的聚合物(Mai et al.，277J.Biol.Chem.30208-30218 (2002)、Park etal.13Mol.Cells202-208 (2002)、Mi et al.2Mol.Ther.339-347 (2000))、轉(zhuǎn)錄因子如BETA2/neuro D、PDX-1 (Noguchi and Matsumoto60Acta Med.0kayamal-1I, (2006)、Noguchi et al.52Diabetesl732_1737 (2003)、Noguchi et al.332Biochem.Biophys.Res.Commun.68-74 (2005))、核定位信號(Yoneda et al.201Exp.Cell Res.313-320 (1992)、組蛋白衍生的妝(Lundberg and Johansson291Biochem.Biophys.Res.Comm.367-371(2002))、由陽離子大分子形成的聚合物、FGF-1和FGF-2、乳鐵蛋白等等，如文獻(xiàn)中所適當(dāng)描述的。本發(fā)明因此還涉及這樣的增殖性肝細(xì)胞，其被瞬時地?zé)o限增殖，優(yōu)選通過1.)具有細(xì)胞無限增殖化活性的多肽；i1.)在染色體末端合成端粒DNA的多肽或其各自的融合肽，其中第一部分中的融合肽由轉(zhuǎn)運蛋白組成，參見上面。這樣的具有細(xì)胞無限增殖化活性的多肽可，例如，從前面提到的病毒或細(xì)胞增殖基因獲得。而且，參考EP1175436B1來產(chǎn)生這樣的多肽。這樣的在染色體末端合成端粒DNA的多肽優(yōu)選選自端粒酶、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)、pl40、pl05、p48和p43。而且，參考EP1175436B1來產(chǎn)生這樣的多肽。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，“用至少一個誘導(dǎo)細(xì)胞分裂停滯的細(xì)胞因子失活”將被理解為指，例如，細(xì)胞分裂停滯在衰老程序中被激活(概述在:Ben Porath, 1.andR.A.Weinberg.2005.1nt.J.Biochem.Cell Biol.37:961-976.)或指分化程序的范圍內(nèi)在細(xì)胞中被激活的細(xì)胞分裂停滯。例如，在心肌細(xì)胞的情況下已知，它們在出生之后不久停止分裂，這通過細(xì)胞周期抑制劑如pl6、p21、p27的表達(dá)等來調(diào)節(jié)(Brooks, G.，etal.1998.Cardiovasc.Res.39，301-311 ；F1 ink, 1.L.et al.，1998.J.Mo 1.CellCardiol.30，563-578 ；Walsh, K.and Perlman, H.1997.Curr.0pin.Genet.Dev.7，597-602)。相似的方法當(dāng)然應(yīng)用于所有原代細(xì)胞類型的大多數(shù)。在分化的細(xì)胞中細(xì)胞周期抑制劑的失活因此可引起細(xì)胞恢復(fù)增殖。在本發(fā)明的上下文中，這還應(yīng)用于這里沒有提到的另外的細(xì)胞周期抑制蛋白。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，對控制細(xì)胞周期重要的蛋白p53和直接結(jié)合p53的所有蛋白、該P53途徑的上游和/或下游因子可通常被失活以達(dá)到增加的細(xì)胞分裂能力的目的(p53途徑概述在:Giono, L.E.and J.J.Manfred1.2006.J.Cell Physiol209:13-20 ；Farid, N.R.2004.Cancer Treat.Res.122:149-164)。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，對控制細(xì)胞周期重要的蛋白pl6/INK4a和直接結(jié)合pl6/INK4a的所有蛋白、該pl6途徑的上游和/或下游因子可通常被失活以達(dá)到增加的細(xì)胞分裂能力的目的(pl6/INK4a 途徑概述在:Shapiro, G.1.et al., 2000.Cell Biochem.Biophys.33:189-197)。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，對控制細(xì)胞周期重要的蛋白pRb、和pRb家族的所有成員(例如pl07、pl30)和直接結(jié)合pRb家族的所有蛋白、該pRb途徑的上游和/或下游因子可通常被失活以達(dá)到增加的細(xì)胞分裂能力的目的(pRb途徑概述在=Godefroy, N.et al.2006.Apoptosis.11: 659-661; Sevi I le, L.L.et al.2005.Curr.Cancer DrugTargets.5:159-170)。
細(xì)胞因子如p53、pRB, pl6等的失活可，例如，通過相應(yīng)因子的顯性失活突變體的表達(dá)(Herskowitz, 1.1987.Nature329:219-222 ;Kiipper，J.H.，et al.1995.Biochimie77:450-455)、通過在反義寡核苷酸(Zon, G.1990.Ann.N.Y.Acad.Sc1.616:161-172)、RNAi 分子(Aagaard, L.and J.J.Ross1.2007.Adv.Drug Deliv.Rev.59:75-86 ；Chakraborty, C.2007.Curr.Drug Targets.8:469-482)、嗎啉代(morpholinos) (Angerer, L.M.and R.C.Angerer.2004.Methods Cell Biol.74:699-711)、核酶(Sioud, M.and P.0.1versen.2005.Curr.Drug Targets.6:647-653)的輔助下抑制這些因子的表達(dá)或通過基因敲除(Le, Y.and B.Sauer.2000.Methods Mo 1.Biol.136:477-485 ；Yamamura, K.1999.Prog.Exp.Tumor Res.35:13-24)而發(fā)生。這些方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的并在文獻(xiàn)中的許多地方被描述。失活還可通過特異抗體(例如單鏈抗體、細(xì)胞內(nèi)抗體等的；概述在:Leath, C.A., III, et al.2004.1nt.J.0ncol.24:765-771 ；Stocks,M.R.2004.Drug Discov.Today9:960-966 中)的作用而發(fā)生。失活還可通過使用細(xì)胞因子的化學(xué)抑制劑，例如通過使用激酶抑制劑而發(fā)生。激酶抑制劑的一個實例是物質(zhì)伊馬替尼(Glivec4'.)。細(xì)胞增殖的減少通過這種方式獲得。伊馬替尼是特異性抑制劑，其在患病的細(xì)胞中阻斷Abl酪氨酸激酶的活性并由此抑制突變的血液干細(xì)胞的病理性增加的增殖。在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明因此同樣涉及建立試驗的方法，包括以下步驟:a.)提供載體材料；b.)在該載體材料上固定(immobilizing或fixing)增殖性肝細(xì)胞；和將來自b.)的細(xì)胞與試劑接觸和測定劑的基因毒性。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，試劑指任何任意的物質(zhì)，例如被批準(zhǔn)或研發(fā)中的藥物和藥物候選物和其前體；一般而言的化學(xué)品；生物學(xué)活性物質(zhì)，這是說由細(xì)胞產(chǎn)生的分子，如以該方式天然出現(xiàn)，或在生物體或病毒中以修飾的形式，或可在那里形成的蛋白；包括在物理效應(yīng)如電磁輻射、熱、冷能、聲音或類似物理效應(yīng)下。這樣的試劑的作用包括但不限于DNA損傷的產(chǎn)生如核苷酸氧化、脫氨基、堿基丟失、鏈斷裂、加合物、DNA-DNA交聯(lián)。引起DNA斷裂的試劑指誘變劑。試劑的間接的基因毒性效應(yīng)是，例如，對紡錘體的損傷，這是染色體或姐妹染色單體分離所需要的，并且其中，由于損傷，例如，細(xì)胞分裂期間染色體斷裂或不規(guī)則的染色體分布到子細(xì)胞可發(fā)生。影響染色體分布的試劑指非整倍體的。作為一種或多種試劑的這些基因毒性效應(yīng)的結(jié)果，細(xì)胞的基因構(gòu)成的改變發(fā)生，這可以但不是必定與引起細(xì)胞死亡的直接毒性聯(lián)系。另一方面，基因構(gòu)成的改變可在改變的基因活性中顯示自身，這導(dǎo)致改變的細(xì)胞代謝。測定基因毒性的陽性事件可用試驗試劑以更廣泛的意義來證明，例如通過熒光標(biāo)記的抗體或類似物。特別地，這里應(yīng)提到合適的生物分析方法，例如免疫組織化學(xué)、抗體陣列、Luminex/Luminol、ELISA、免疫熒光和放射免疫測定。術(shù)語“固體載體”包括實施方式如濾器、膜、磁性小球、硅晶片、玻璃、塑料、金屬、芯片、質(zhì)譜靶或基質(zhì)，例如由蛋白制成，或其它基質(zhì)，如PEG例如，等等。在根據(jù)本發(fā)明的排列的進(jìn)一步優(yōu)選實施方式中，該實驗對應(yīng)于具有微孔板(96孔、384孔或更多的孔)大小的格子、硅晶片、芯片、質(zhì)譜靶或基質(zhì)。載體材料(基質(zhì))可以以球形非聚集的顆?！Q作小球、纖維或膜的形式存在，其中基質(zhì)的孔隙度增加表面。例如，孔隙度可以以慣常的方式通過將成孔材料如環(huán)己醇或1-十二醇加入到懸浮聚合的反應(yīng)混合物中而增加。
實施例:實施例1:誘導(dǎo)增殖性肝細(xì)胞的CYP3A4活性首先，通過用W02009030217A2中描述的方法處理原代人類肝細(xì)胞來產(chǎn)生能夠增殖的肝細(xì)胞。為了分析本發(fā)明中描述的增殖性肝細(xì)胞的代謝能力，在多個倍增數(shù)字(PD23、32和36)測量CYP3A4活性的誘導(dǎo)。為了該目的，將細(xì)胞以2.3 X IO4細(xì)胞/cm2的密度接種在涂布膠原的細(xì)胞培養(yǎng)容器上并培養(yǎng)4天。此后，在通過基于發(fā)光的P450-Glo實驗(Promega)測量CYP3A4活性之前，每天用利福平(20 u M)處理細(xì)胞，進(jìn)行三天。以對照細(xì)胞的CYP3A4活性除以用利福平處理的細(xì)胞的CYP3A4活性(以RLU/s/孔))，計算X倍誘導(dǎo)(平均值土標(biāo)準(zhǔn)差，n=3)?？赡茉谒腥齻€測試的倍增時期里誘導(dǎo)增殖性肝細(xì)胞的CYP3A4活性(

圖1)。對于被分析的所有倍增時間，誘·導(dǎo)是相似的，并滿足針對人類肝細(xì)胞中的CYP3A4誘導(dǎo)的FDA標(biāo)準(zhǔn)(這是說大于四倍)。實施例2:正確地鑒定基因毒性試驗的陽性和陰性物質(zhì)為了檢查關(guān)于基因毒性試驗在專利中描述的可增殖性肝細(xì)胞的適合性，將細(xì)胞用被認(rèn)為是基因毒性的陽性和陰性物質(zhì)處理。利用FACS實驗，與對照組相比，通過誘導(dǎo)的微核的部分定量基因毒性。詳細(xì)地，測試了陽性物質(zhì)絲裂霉素C (MMC)和環(huán)磷酰胺(CPA)和陰性物質(zhì)姜黃素。如果該物質(zhì)先前用CYP酶提取物(S9混合物)轉(zhuǎn)化，那么CPA首先必須被代謝以具有基因毒性效應(yīng)和僅在目前使用的微核試驗中用V79細(xì)胞檢測。在基于嚙齒動物細(xì)胞系的標(biāo)準(zhǔn)基因毒性試驗中，將姜黃素分類為假陽性。將本發(fā)明中描述的增殖性肝細(xì)胞以3000細(xì)胞/cm2的密度鋪到涂布膠原的細(xì)胞培養(yǎng)容器上，并用多種濃度的前面提到的物質(zhì)來處理。在根據(jù)OECD的規(guī)定測試的范圍內(nèi)，測試發(fā)生達(dá)50%的細(xì)胞毒性，這通過MTT生存能力實驗預(yù)先測定每種物質(zhì)。由于在48小時肝細(xì)胞的細(xì)胞分裂速度小于V79細(xì)胞系，所以針對處理(每種情況中指出的)選擇較長的溫育和恢復(fù)時期。對于MMC和CPA，觀察微核形成的劑量-效果關(guān)系，以便這些物質(zhì)被清楚地識別為陽性(圖2和3)。正確地鑒定的CPA的基因毒性證實了細(xì)胞的代謝能力。相比之下，姜黃素沒有誘導(dǎo)增加的微核形成，并因此被正確地分類為陰性物質(zhì)(圖4)。文獻(xiàn)目錄Agarwal, M.L.，Taylor, W.R.，Chernov, M.V.，Chernova, 0.B.and Stark, G.R.(1998).
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權(quán)利要求
1.增殖性肝細(xì)胞的用途，其用于就基因毒性進(jìn)行的體外試驗方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的增殖性肝細(xì)胞的用途，其特征在于進(jìn)行埃姆斯試驗、染色體畸變試驗、彗星實驗、微核試驗。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的增殖性肝細(xì)胞的用途，其特征在于這些增殖性肝細(xì)胞包括至少四種選自 CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYPlAl、CYP3A5、CYP3A7 和 CYP4A11 的 I 期酶。
4.根據(jù)在前權(quán)利要求中任一項的增殖性肝細(xì)胞的用途，其特征在于這些增殖性肝細(xì)胞在軟瓊脂中不顯示生長能力或在體內(nèi)不顯示腫瘤生長。
5.根據(jù)在前權(quán)利要求中任一項的增殖性肝細(xì)胞的用途，其特征在于來自人類或哺乳動物的原代細(xì)胞的這些增殖性肝細(xì)胞具有 a.)增殖基因，特別地細(xì)胞和/或病毒增殖基因；和/或 b.)至少一個誘導(dǎo)細(xì)胞分裂 停滯的細(xì)胞因子被失活，和/或 c.)瞬時地?zé)o限增殖。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的增殖性肝細(xì)胞的用途，其特征在于該細(xì)胞增殖基因選自myC、jun、ras、src、fyg、myb、E2F和Mdm2和TERT,或所述病毒增殖基因選自下組:乳頭狀瘤病毒如HPV的E6和E7 ;多瘤病毒如SV40、JK病毒和BC病毒的大的和小的TAg ;腺病毒的ElA和ElB蛋白，EB病毒(EBV)的EBNA蛋白；以及HTLV和松鼠猴皰疹病毒。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的增殖性肝細(xì)胞的用途，其特征在于所述病毒增殖基因是HPV或BPV 的 E6 和 E7,特別地 HPV16 和 HPV18 和 HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73 和82 和 / 或 HPV6 和 HPVll 以及 HPV40、42、43、44、54、61、70、72 和 81。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的增殖性肝細(xì)胞的用途，其特征在于所述細(xì)胞因子選自下組:p53、pl6、pRB、pl07、pl30或其各自的上游或下游因子、或在該途徑與其結(jié)合的蛋白，并且這樣的細(xì)胞因子的所述失活通過顯性失活突變體的表達(dá)而發(fā)生，或者通過利用反義寡核苷酸、RNAi分子、Morpholinos、核酶抑制這些因子的基因表達(dá)而發(fā)生，或者通過基因敲除、通過特異抗體的作用或通過化學(xué)抑制劑而發(fā)生。
9.根據(jù)權(quán)利要求5的增殖性肝細(xì)胞的用途，其特征在于所述瞬時無限增殖化通過1.)具有細(xì)胞無限增殖化活性的多肽， .)在染色體末端合成端粒DNA的多肽、或其各自的融合肽而發(fā)生。
10.根據(jù)權(quán)利要求5的增殖性肝細(xì)胞的用途，其特征在于所述瞬時無限增殖化通過1.)選自根據(jù)權(quán)利要求6或7的表達(dá)產(chǎn)物的具有細(xì)胞無限增殖化活性的多肽而發(fā)生。
11.根據(jù)權(quán)利要求5的增殖性肝細(xì)胞的用途，其特征在于所述瞬時無限增殖化通過i1.)選自端粒酶、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)、pl40、pl05、p48和p43的在染色體末端合成端粒DNA的多肽而發(fā)生。
12.根據(jù)權(quán)利要求5的增殖性肝細(xì)胞的用途，其特征在于所述瞬時無限增殖化通過融合肽而發(fā)生，其中第一部分是轉(zhuǎn)運多肽，特別地VP22、HIV TAT、(HIV) REV、觸角多肽、Penetratin、Engrailed、Hoxa_5、由L-精氨酸或D-精氨酸氨基酸殘基形成的聚合物、由L-賴氨酸或D-賴氨酸氨基酸殘基形成的聚合物、轉(zhuǎn)錄因子如BETA2/neuro D、TOX-1、核定位信號、組蛋白衍生的肽、由陽離子大分子形成的聚合物、FGF-1和FGF-2、乳鐵蛋白，并且第二部分是根據(jù)權(quán)利要求6或7的多肽。
13.建立試驗的方法，包括以下步驟: a.)提供載體材料； b.)在該載體材料上固定增殖性肝細(xì)胞，和 將來自b.)的這些細(xì)胞與試劑接觸并測定所述試劑的基因毒性。
14.根據(jù)權(quán)利要求9的建立試驗的方法，其特征在于所述試劑選自化學(xué)和生物學(xué)活性物質(zhì)、藥物和化 妝品。
全文摘要
本發(fā)明涉及借助于增殖的生理活性肝細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)對化學(xué)、生物和物理活性物質(zhì)或試劑進(jìn)行基因毒性試驗的方法。
文檔編號G01N33/50GK103221822SQ201180055099
公開日2013年7月24日 申請日期2011年10月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月4日
發(fā)明者A·J·C·M·布拉斯潘寧, S·海因茲, A·內(nèi)倫貝格, N·休伊特, J-H·屈佩爾 申請人:米迪賽特有限公司