專利名稱：復(fù)合納米修飾絲網(wǎng)印刷電極及檢測伏馬毒素b1的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用復(fù)合納米材料(碳納米管與膠體金) 修飾的絲網(wǎng)印刷電極及檢測伏馬毒素Bl的方法。
背景技術(shù)：
伏馬毒素Bl (Fumonisin Bi, FBI)是串珠鐮刀菌在一定濕度和溫度條件下繁殖所產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，在全世界范圍內(nèi)分布廣泛。1988年，Gelderblom等首次從串珠鐮刀菌培養(yǎng)液中分離出伏馬毒素。伏馬毒素能夠?qū)τ衩准捌渲破吩斐晌廴?，而且在以谷物為原料的一些產(chǎn)品中如面條、啤酒、調(diào)味品，甚至在蘆筍中也檢測到了伏馬毒素。據(jù)報道，伏馬毒素與馬腦白質(zhì)軟化癥，豬的肺水腫癥候群，大鼠肝癌等疾病有關(guān)。除上述疾病外，在南非的特蘭斯凱地區(qū)和中國林縣地區(qū)研究發(fā)現(xiàn)，食用伏馬毒素污染的玉米制品與人類食道癌相關(guān)。串珠鐮刀菌產(chǎn)生的毒素已經(jīng)被國際癌癥研究會(International Agency for Research on Cancer, IARC)劃分到2B類一可能的人類致癌物。加入WTO之后，農(nóng)產(chǎn)品及相關(guān)食品的國際貿(mào)易量日益增加，隨之對進(jìn)出口產(chǎn)品的生物安全性的要求也越來越高，為了保證這類產(chǎn)品的順利上市和食用者的健康，出入境檢疫、海關(guān)、生產(chǎn)企業(yè)、監(jiān)督部門等部門迫切需要一種特異、快速、簡便的伏馬毒素檢測方法。電化學(xué)傳感器是將感受的物理量、化學(xué)量等信息按一定規(guī)律轉(zhuǎn)換成便于測量和傳輸?shù)碾娦盘柕难b置。它由固定化的生物敏感材料作為識別元件，經(jīng)過理化換能器產(chǎn)生間斷的或連續(xù)的信號，再由接受裝置放大或直接收集處理。因為換能器產(chǎn)生的信號強度與被分析物濃度成比例，因此電化學(xué)傳感器在一定程度上能精確定量被測物。隨著電化學(xué)檢測方法的發(fā)展，利用納米材料作為電極修飾物從而提高電子轉(zhuǎn)移速度、放大檢測信號、提高檢測靈敏度，成為電化學(xué)傳感器的重要領(lǐng)域。其中，多壁碳納米管由于具有較大表面積、為電子轉(zhuǎn)移提供良好通道、孔穴結(jié)構(gòu)更能增強電子轉(zhuǎn)移的特點，在電化學(xué)傳感器的研究上廣泛應(yīng)用。而絲網(wǎng)印刷電極相比較普通玻碳電極而言，除了具有良好的電化學(xué)表現(xiàn)，還具有以下優(yōu)勢1.三電極系統(tǒng)整合在體積較小的基板上；2.可拋棄式，無須再次研磨；3.可大量使用，利于大規(guī)?，F(xiàn)場檢測；4.可進(jìn)行任意修飾，并保存較長時間。關(guān)于伏馬毒素的檢測國內(nèi)外已建立了多種方法。目前檢測伏馬毒素的方法主要為高效液相色譜法(HPLC)和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。然而，由于伏馬毒素本身既沒有特異的紫外吸收基團，同時也沒有熒光特性，但在一定條件下伏馬毒素可同某些物質(zhì)反應(yīng)形成具有熒光的衍生物，因此熒光衍生劑和衍生方法的選擇與HPLC檢測伏馬毒素的準(zhǔn)確度和靈敏性有密切關(guān)系。此外該法需要對檢測樣品進(jìn)行嚴(yán)格的預(yù)處理，還需要高效液相色譜儀等貴重儀器，同時要求有專業(yè)的操作人員，不利于現(xiàn)場常規(guī)檢測使用。而ELISA方法雖然較 HPLC簡單，可以大批量檢測，但是靈敏度有限，且不宜進(jìn)行現(xiàn)場檢測。本方法使用儀器體積小、重量輕，便于攜帶，適于現(xiàn)場檢測，同時具有檢測靈敏的特點
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種復(fù)合納米材料修飾絲網(wǎng)印刷電極及檢測伏馬毒素Bl的方法。本方法使用多壁碳納米管/膠體金/殼聚糖混合物作為電極的修飾系統(tǒng)，利用了多壁碳納米管由于具有較大表面積，能為電子轉(zhuǎn)移提供良好通道、孔穴結(jié)構(gòu)從而能增強電子轉(zhuǎn)移的特點以及膠體金由于具有球體結(jié)構(gòu)，在附著在多壁碳納米管上后有增強電子轉(zhuǎn)移的特點，實現(xiàn)了有效放大檢測信號，從而提高了檢測伏馬毒素Bl的靈敏度。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的本發(fā)明涉及一種復(fù)合納米修飾絲網(wǎng)印刷電極，所述絲網(wǎng)印刷電極的工作電極的工作區(qū)域涂覆有多壁碳納米管-膠體金-殼聚糖混合物膜層。優(yōu)選的，所述膠體金為16 18nm。本發(fā)明還涉及一種制備上述的復(fù)合納米修飾絲網(wǎng)印刷電極的方法，包括如下步驟步驟一、將多壁碳納米管活化，并制備膠體金，利用殼聚糖將多壁碳納米管和膠體金混合均勻；步驟二、將步驟一制得的混合物涂覆在絲網(wǎng)印刷電極的工作電極表面，37°C干燥成膜，即得。優(yōu)選的，步驟一中所述多壁碳納米管活化方法具體為5mg多壁碳納米管溶于 15ml體積比為1 3的HNO3和H2SO4混合而得的活化溶液中，超聲30min后，9000rpm離心 5min，去除上清后，加入超純水洗滌，9000rpm離心5min，去除上清，合并殘留物，60°C烘箱烘干，加入5ml水，配制成lmg/ml溶液，4°C貯存?zhèn)溆?。?yōu)選的，步驟一中所述膠體金的制備方法具體為將IOOml的HAuCl4溶液加熱至沸騰，之后加入1. 2ml的檸檬酸三鈉溶液，煮沸7 lOmin，最后加三蒸水至100ml，即得膠體金溶液；所述檸檬酸三鈉溶液中檸檬酸三鈉質(zhì)量占溶液總體積的百分比為1%，所述 HAuCl4溶液中HAuCl4質(zhì)量占溶液總體積的百分比為0. 01%。優(yōu)選的，步驟一中所述殼聚糖與多壁碳納米管和膠體金的混合具體為將體積比為1 5 5的多壁碳納米管溶液、膠體金溶液和殼聚糖溶液混合，超聲混勻；所述殼聚糖溶液中殼聚糖質(zhì)量占溶液總體積的百分比為2%。本發(fā)明還涉及一種用上述的復(fù)合納米修飾絲網(wǎng)印刷電極檢測伏馬毒素Bl的方法，包括如下步驟步驟一，將6μ1 FBl-OVA滴加在所述工作電極區(qū)域，37°C放置30min;使用 0. OIMPBST洗滌工作電極，晾干，滴加8 μ 1 BSA溶液，以封閉工作電極，37°C放置30min ；所述BSA溶液中BSA質(zhì)量占溶液總體積的百分比為；步驟二，取0.75g待測樣品，加入:3ml甲醇溶液，震蕩、靜置、離心，使用0. OlMPBS 稀釋5倍，取5μ1備用；步驟三，將抗FBl單克隆抗體分別與不同濃度的FBl標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品稀釋液混合，37 °C 孵育 60min ；步驟四，使用0. OlM PBST洗滌工作電極，晾干，滴加6 μ 1步驟三制得的抗FBl單克隆抗體和FBl標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品稀釋液的混合溶液，37°C放置30min ；步驟五，使用0. OlM PBST洗滌工作電極，晾干，滴加6 μ IHRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，
537°C 放置 30min ；步驟六，使用0. OlM PBST洗滌工作電極，并晾干，將絲網(wǎng)印刷電極放入IOml pH為 7. 4的0. OlM PBS的緩沖液中，測定背景電流，記錄為I0 ；步驟七，將絲網(wǎng)印刷電極取出，使用0. OlM PBST洗滌工作電極，并晾干，放入 IOmlpH為7. 4的0. OlM PBS的緩沖液中，再加入過氧化氫和氫醌，使其濃度分別為2mM和 0. ImM，攪拌溶液20min后，停止攪拌，測定電流，記錄為I，電流變化值ΔΙ = I-I0 ；步驟八；使用Excel軟件，將FBl標(biāo)準(zhǔn)品不同濃度與相對應(yīng)的ΔΙ繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 將待測樣品相對應(yīng)的ΔΙ帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，得到FBl濃度，并乘以稀釋因子，即為待測樣品中 FBl含量。優(yōu)選的，步驟二中，所述離心為3000轉(zhuǎn)離心15分。優(yōu)選的，步驟二中，所述甲醇溶液中甲醇與水的體積比為80 20。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果本發(fā)明檢測對象單一且針對性強， 準(zhǔn)確率高，靈敏度強，靈敏度大于常用的酶聯(lián)免疫吸附法；可以滿足糧食儲存銷售機構(gòu)、出入境、海關(guān)等檢驗部門快速、正確地判斷FBl毒素含量的要求，并且便于基層推廣和運用。


圖1為本發(fā)明實施例示意圖；其中，1為參比電極，2為工作電極，3為對電極，4為膠體金，5為多壁碳納米管，6 為OVA-FBl，7為抗FBl單克隆抗體，8為羊抗鼠HRP標(biāo)記二抗。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的實施例作詳細(xì)說明本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實施，給出了詳細(xì)的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。下面實施例中，未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例本發(fā)明實施例的示意圖如圖1所示，所述絲網(wǎng)印刷電極包括參比電極1、工作電極 2、對電極3 ；所述工作電極2的工作區(qū)域涂覆有多壁碳納米管5-膠體金4-殼聚糖混合物膜層；用所述絲網(wǎng)印刷電極檢測樣品中的伏馬毒素Bl (FBI)時，首先將0VA-FB16滴加在已涂覆有混合物膜層的工作電極上，干燥后再加入抗FBl單克隆抗體7與待測樣品萃取液的混合溶液，干燥后再加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗8，最后加入底物溶液H2O2和HQ。制備本發(fā)明的復(fù)合納米材料修飾絲網(wǎng)印刷電極以及用其檢測伏馬毒素Bl的方法具體步驟如下步驟一，碳納米管的活化將5mg碳納米管溶于15ml混合酸溶液(HNO3與體積比為1 幻中，超聲混勻30分鐘。將溶液分裝，置于離心機中，9000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，去除上清后，再用超純水洗滌一次，具體為9000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。去除上清后，合并殘留物，置于60°C烘箱烘干。最后加入5ml水，4°C儲存?zhèn)溆?。步驟二，膠體金的制備
先將IOOml的0. 001% (ff/V) HAuC14溶液加熱至沸騰，迅速加入1. 3ml的1 % (W/ V)檸檬酸三鈉水溶液，開始有些藍(lán)色，然后淺藍(lán)、藍(lán)色，再加熱出現(xiàn)紅色，煮沸7 IOmin出現(xiàn)透明的酒紅色，最后加三蒸水至100ml。使用電鏡鏡檢，確保制備的金顆粒盡量使其大小一致，均勻，顆粒直徑在16 18nm。步驟三，在絲網(wǎng)印刷電極上修飾復(fù)合納米材料將10 μ 1碳納米管溶液和50 μ 1膠體金溶液加入至50 μ 1 2% (ff/V)殼聚糖溶液中。超聲混勻5分鐘后，取6 μ 1滴加在絲網(wǎng)印刷電極的工作電極上，室溫干燥30分鐘即可。步驟四，樣品處理取0.75g待測樣品，加入:3ml甲醇溶液(甲醇與水的體積比為80 20)，震蕩 15min后，靜置10min，3000轉(zhuǎn)離心15分后，使用0. OlM PBS稀釋5倍，取5μ 1備用。步驟五，檢測過程將6 μ 1 FBl-OVA滴加在工作電極區(qū)域，37°C放置30min。使用0. OlM PBST洗滌工作電極，并晾干，滴加8μ 1 1% (W/V)BSA溶液，以封閉工作電極，37°C放置30min。將抗FBI單克隆抗體分別與FBl標(biāo)準(zhǔn)品(0,0. 1,0. 5、1、5、10、50、100ng/ml)和待測樣品稀釋液混合，37°C孵育60min。使用0. OlM PBST洗滌工作電極，并晾干，滴加6 μ 1抗 FBl單克隆抗體和FBl標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品稀釋液的混合溶液，37°C放置30min。使用0. OlM PBST洗滌工作電極，并晾干，滴加6μ 1 HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，37°C放置30min。使用0. OlM PBST洗滌工作電極，并晾干，將絲網(wǎng)印刷電極放入IOml 0.01M PBS(pH 7.4)的緩沖液中， 測定背景電流，記錄為Itl;將絲網(wǎng)印刷電極取出，使用0. OlM PBST洗滌工作電極，并晾干， 放入IOml 0.01M PBS (pH 7.4)的緩沖液中，再加入過氧化氫(H2O2)和氫醌(HQ)，使其濃度分別為2mM和0. ImM，攪拌溶液20min后，停止攪拌，測定電流，記錄為I，電流變化值ΔΙ = I-I0 ；使用Excel軟件，將FBl標(biāo)準(zhǔn)品不同濃度與相對應(yīng)的ΔΙ繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測樣品相對應(yīng)的ΔΙ帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，得到FBl濃度，并X稀釋因子0X5)，即為待測樣品中FBl含量(μ g/kg)ο綜上所述，本發(fā)明檢測樣品中FBl的方法是鑒于待測樣品若有FBl毒素，則與抗 FBl抗體競爭結(jié)合，使與電極上的FBl-OVA結(jié)合的抗體量減少，并由此使電極上HRP-羊抗鼠二抗的量也減少，并影響電流變化值ΔΙ ；該方法根據(jù)FBl標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線來判定谷物檢測樣品中FBl的含量?？梢钥闯?，本實施例的方法可直接定量檢測樣品中的FB1，不需要專業(yè)培訓(xùn)，操作方便、快速。
權(quán)利要求
1.一種復(fù)合納米修飾絲網(wǎng)印刷電極，其特征在于，所述絲網(wǎng)印刷電極的工作電極的工作區(qū)域涂覆有多壁碳納米管-膠體金-殼聚糖混合物膜層。
2.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合納米修飾絲網(wǎng)印刷電極，其特征在于，所述膠體金為16 18nm。
3.一種制備如權(quán)利要求1所述的復(fù)合納米修飾絲網(wǎng)印刷電極的方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一、將多壁碳納米管活化，并制備膠體金，利用殼聚糖將多壁碳納米管和膠體金混合均勻；步驟二、將步驟一制得的混合物涂覆在絲網(wǎng)印刷電極的工作電極表面，37°C干燥成膜， 即得。
4.如權(quán)利要求3所述的復(fù)合納米修飾絲網(wǎng)印刷電極的制備方法，其特征在于，步驟一中所述多壁碳納米管活化方法具體為5mg多壁碳納米管溶于15ml活化溶液中，超聲30min 后，9000rpm離心5min，去除上清后，加入超純水洗滌，9000rpm離心5min，去除上清，合并殘留物，60°C烘箱烘干，加入5ml水，配制成lmg/ml溶液，4°C貯存?zhèn)溆?；所述活化溶液為體積比為 1 3 的 HNO3 和 H2SO4。
5.如權(quán)利要求4所述的復(fù)合納米修飾絲網(wǎng)印刷電極的制備方法，其特征在于，步驟一中所述膠體金的制備方法具體為將IOOml的HAuCl4溶液加熱至沸騰，之后加入1.2ml的檸檬酸三鈉溶液，煮沸7 lOmin，最后加三蒸水至100ml，即得膠體金溶液；所述檸檬酸三鈉溶液中檸檬酸三鈉質(zhì)量占溶液總體積的百分比為1%，所述HAuCl4溶液中HAuCl4質(zhì)量占溶液總體積的百分比為0. 01%。
6.如權(quán)利要求5所述的復(fù)合納米修飾絲網(wǎng)印刷電極的制備方法，其特征在于，步驟一中所述殼聚糖與多壁碳納米管和膠體金的混合具體為將10 μ 1多壁碳納米管溶液和 50 μ 1膠體金溶液加入至50 μ 1殼聚糖溶液中，超聲混勻；所述殼聚糖溶液中殼聚糖質(zhì)量占溶液總體積的百分比為2%。
7.一種用如權(quán)利要求1所述的復(fù)合納米修飾絲網(wǎng)印刷電極檢測伏馬毒素Bl的方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一，將6μ 1 FBl-OVA滴加在所述工作電極區(qū)域，37°C放置30min ；使用0. 0IMPBST 洗滌工作電極，晾干，滴加8 μ 1 BSA溶液，以封閉工作電極，37°C放置30min ；所述BSA溶液中BSA質(zhì)量占溶液總體積的百分比為；步驟二，取0. 75g待測樣品，加入:3ml甲醇溶液，震蕩、靜置、離心，使用0. OlMPBS稀釋 5倍，取5μ 1備用；步驟三，將抗FBl單克隆抗體分別與不同濃度的FBl標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品稀釋液混合， 37 °C 孵育 60min ；步驟四，使用0. OlM PBST洗滌工作電極，晾干，滴加6 μ 1步驟三制得的抗FBl單克隆抗體和FBl標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品稀釋液的混合溶液，37°C放置30min ；步驟五，使用0. OlM PBST洗滌工作電極，晾干，滴加6 μ IHRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，37°C 放置30min ；步驟六，使用0. OlM PBST洗滌工作電極，并晾干，將絲網(wǎng)印刷電極放入IOml pH為7. 4 的0. OlM PBS的緩沖液中，測定背景電流，記錄為I0 ；步驟七，將絲網(wǎng)印刷電極取出，使用0. OlM PBST洗滌工作電極，并晾干，放入IOmlpH為 7. 4的0. OlM PBS的緩沖液中，再加入過氧化氫和氫醌，使其濃度分別為2mM和0. ImM，攪拌溶液20min后，停止攪拌，測定電流，記錄為I，電流變化值ΔΙ = I-I0 ；步驟八；使用Excel軟件，將FBI標(biāo)準(zhǔn)品不同濃度與相對應(yīng)的ΔI繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測樣品相對應(yīng)的ΔΙ帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，得到FBl濃度，并乘以稀釋因子，即為待測樣品中FBl含量。
8.如權(quán)利要求7所述的復(fù)合納米修飾絲網(wǎng)印刷電極檢測伏馬毒素Bl的方法，其特征在于，步驟二中所述離心為3000轉(zhuǎn)離心15分鐘。
9.如權(quán)利要求7所述的復(fù)合納米修飾絲網(wǎng)印刷電極檢測伏馬毒素Bl的方法，其特征在于，步驟二中所述甲醇溶液中甲醇與水體積比為80 20。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種復(fù)合納米修飾絲網(wǎng)印刷電極及檢測伏馬毒素B1的方法。所述絲網(wǎng)印刷電極的工作電極上涂覆有多壁碳納米管-膠體金-殼聚糖混合物膜層。制備過程為將多壁碳納米管活化，制備膠體金，利用殼聚糖將多壁碳納米管和膠體金混合均勻；將混合物涂覆在工作電極表面，37℃干燥成膜，即得。本發(fā)明檢測伏馬毒素B1的方法是鑒于待測樣品若有FB1毒素，則與抗FB1抗體競爭結(jié)合，使與電極上的FB1-OVA結(jié)合的抗體量減少，并由此使電極上HRP-羊抗鼠二抗的量也減少，并影響電流變化值ΔI；然后根據(jù)FB1標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線來判定谷物檢測樣品中FB1的含量。本發(fā)明檢測對象單一且針對性強，準(zhǔn)確率高，靈敏度強。
文檔編號G01N27/30GK102539499SQ20121000240
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月6日
發(fā)明者嚴(yán)亞賢, 孫建和, 王元凱, 王斌, 秦易 申請人:上海交通大學(xué)