專利名稱：分泌抗喹諾酮類藥物單抗雜交瘤細(xì)胞株及其單抗應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種分泌抗喹諾酮類藥物單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其單抗的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
氟喹諾酮類藥物(Fluoroquinolones, FQs)是一類人工合成的廣譜、高效的抗菌藥物。作為獸藥和飼料添加劑而大量應(yīng)用于動(dòng)物，導(dǎo)致其殘留在動(dòng)物可食性產(chǎn)品中。這類殘留物可直接對(duì)人體造成危害引起軟骨毒性、關(guān)節(jié)疼痛和腫脹、皮膚過敏反應(yīng)、白細(xì)胞和血小板減少、嗜酸細(xì)胞增多、溶血、肝腎損傷等。更嚴(yán)重的是低濃度的殘留藥物可能會(huì)對(duì)FQs類藥物敏感的致病菌產(chǎn)生耐藥性，從而間接威脅人類健康。為此許多國(guó)家對(duì)喹喏酮類抗生素制定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)，我國(guó)該類抗生素的最高殘留限量達(dá)氟沙星在牛、羊、家禽肌肉中為200ii g/kg、奶中為30ii g/kg，二氟沙星在牛、羊、豬肌肉中為400ii g/kg、家禽中為300 ii g/kg，恩諾沙星在牛、羊、豬、家禽肌肉中均為IOOii g/kg。目前采用的檢測(cè)手段主要有微生物抑制分析法、熒光分光光度法、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜(GC)、薄層色譜和氣質(zhì)聯(lián)用，液相色譜方法及質(zhì)譜聯(lián)用方法等。目前主要用GC或HPLC進(jìn)行測(cè)定。這些方法雖然有較高的靈敏度，但需昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器，操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)錢、不能高通量檢測(cè)，故難以在基層普及應(yīng)用。而用抗體為基礎(chǔ)開發(fā)的免疫學(xué)檢測(cè)方法及其試劑盒和試紙條能有效克服這些不足。目前國(guó)內(nèi)外沒有檢測(cè)喹諾酮類藥物殘留的免疫試劑盒及試紙條，本發(fā)明專利應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA原理，以喹諾酮類藥物單克隆抗體為核心建立檢測(cè)喹諾酮類藥物殘留的競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，并組裝成有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)、廉價(jià)、靈敏的喹諾酮類藥物殘留檢測(cè)試劑盒，應(yīng)用免疫膠體金的原理，以膠體金標(biāo)記環(huán)丙沙星特異性單克隆抗體為核心研制喹諾酮類藥物殘留快速檢測(cè)的高靈敏度的免疫試紙條。發(fā)明專利的單抗及其免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒和試紙條完全滿足中國(guó)、歐盟、日本等地區(qū)對(duì)喹諾酮類藥物殘留的檢測(cè)要求。喹諾酮?dú)埩舻拿庖邔W(xué)檢測(cè)方法、免疫學(xué)試劑盒及免疫試紙條的國(guó)產(chǎn)化對(duì)保障我國(guó)食品安全及食品的出口創(chuàng)匯具有重要意義，可產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種分泌抗喹諾酮類藥物單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其單抗應(yīng)用。分泌抗喹諾酮類藥物單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，保藏號(hào)為CGMCC No. 5608，它能分泌抗喹諾酮類藥物單克隆抗體；
雜交瘤細(xì)胞株分泌抗喹諾酮類藥物單克隆抗體腹水間接ELISA效價(jià)達(dá)10_7以上，抗體類型及亞類為IgGl、kappa鏈，該單克隆抗體能與喹諾酮類藥物環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、達(dá)氟沙星、諾氟沙星、依諾沙星、麻保沙星、沙拉沙星和雙氟沙星有特異性免疫反應(yīng)?？灌Z酮類藥物單克隆抗體在食品中該類抗生素殘留檢測(cè)上的應(yīng)用是以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學(xué)檢測(cè)方法及其試劑盒和試紙條。本發(fā)明提供的雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗喹諾酮類藥物單克隆抗體特異性強(qiáng)、靈敏度高，能滿足開發(fā)免疫學(xué)檢測(cè)方法及試劑盒的要求；以該發(fā)明提供的單抗為核心建立的檢測(cè)食品中喹諾酮類藥物殘留的競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法及免疫學(xué)試劑盒和試紙條能特異、準(zhǔn)確、靈敏、簡(jiǎn)單、快速、高通量地檢測(cè)食品中喹諾酮類藥物的殘留。


圖I是試紙條的特異性分析，每個(gè)樣品的含量為IOOppb ；
圖2是試紙條的組織樣品檢測(cè)靈敏度分析；
圖3是試紙條的蜂蜜樣品檢測(cè)靈敏度分析；
圖4是試紙條的原奶樣品檢測(cè)靈敏度分析。
具體實(shí)施例方式分泌抗氟喹諾酮類藥物單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，于2011年11月28日，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏號(hào)為CGMCC No. 5608，分類命名為分泌抗氟喹諾酮類藥物單抗雜交瘤細(xì)胞；
雜交瘤細(xì)胞株分泌抗喹諾酮類藥物單克隆抗體腹水間接ELISA效價(jià)達(dá)10_7以上，抗體類型及亞類為IgGl、kappa鏈，該單克隆抗體能與喹諾酮類藥物環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、達(dá)氟沙星、諾氟沙星、依諾沙星、麻保沙星、沙拉沙星和雙氟沙星有特異性免疫反應(yīng)。抗喹諾酮類藥物單克隆抗體在食品中該類抗生素殘留檢測(cè)上的應(yīng)用是以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學(xué)檢測(cè)方法及其試劑盒和試紙條。本發(fā)明提供的雜交瘤細(xì)胞株能分泌抗喹諾酮類藥物單抗，且其特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性好。以該單抗為核心建立了檢測(cè)食品中喹諾酮類藥物的高通量的免疫學(xué)競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法及其免疫學(xué)試劑盒和試紙條，從而對(duì)保障我國(guó)食品安全及食品的出口創(chuàng)匯具有
重要意義。下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。I.環(huán)丙沙星半抗原與載體蛋白的交聯(lián)
I.環(huán)丙沙星(CIP)與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)產(chǎn)物的制備方
法
a)將60 mg環(huán)丙沙星和30 mg EDC溶于2 ml超純水中。然后立即快速加入30mg/ml的BSA (或者0VA)水溶液1ml，攪拌反應(yīng)12-18小時(shí)，合成CIP-BSA、CIP-OVA偶聯(lián)產(chǎn)物。b) CIP-BSA、CIP-OVA偶聯(lián)產(chǎn)物放入透析袋中，用0. OlM pH7. 2的磷酸鹽緩沖液在4°C透析2天；
c)透析后的CIP-BSA偶聯(lián)產(chǎn)物、CIP-OVA偶聯(lián)產(chǎn)物、CIP、BSA、OVA溶液進(jìn)行紫外掃描，分析鑒定偶聯(lián)產(chǎn)物及濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CIP-BSA偶聯(lián)產(chǎn)物的紫外掃描圖形與BSA、環(huán)丙沙星的掃描圖形明顯不同，CIP-OVA偶聯(lián)產(chǎn)物的紫外掃描圖形與0VA、環(huán)丙沙星的掃描圖形明顯不同，說明環(huán)丙沙星已與BSA、0VA偶聯(lián)成功，偶聯(lián)產(chǎn)物分裝后于_20°C冰箱保存，用于抗體制備及檢測(cè)食品中喹諾酮類藥物殘留的免疫學(xué)方法中的環(huán)丙沙星人工抗原。
分泌抗環(huán)丙沙 星單抗雜交瘤細(xì)胞獲得及其單抗制備 I)免疫動(dòng)物
用CIP-BSA偶聯(lián)物免疫四周齡體重18-20 g BALB/C雌性小鼠1 mg/ml CIP-BSA偶聯(lián)物0. 5-0. 7 ml與等體積福氏完全佐劑混合，充分乳化后，經(jīng)背腹部皮下多點(diǎn)加腹腔注射0. 2-0. 3ml/只，間隔3-4周，取與一免等量抗原和等體積的福氏不完全佐劑充分乳化后，第二次腹腔注射0. 2-0. 3ml/只，共進(jìn)行5次加強(qiáng)免疫，末免用不加佐劑的加倍劑量抗原進(jìn)行腹腔注射，3天后取脾細(xì)胞進(jìn)行融合。2)骨髓瘤細(xì)胞的制備
采用SP2/0為實(shí)驗(yàn)的骨髓瘤細(xì)胞，直接從細(xì)胞培養(yǎng)瓶中吹打懸浮的SP2/0，并計(jì)數(shù)細(xì)胞，活細(xì)胞數(shù)應(yīng)高于95%為合格；一般在準(zhǔn)備融合前的兩周就應(yīng)開始復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞，為確保該細(xì)胞對(duì)HAT的敏感性，每3-6月應(yīng)用8-氮-鳥嘌呤篩選一次，以防止細(xì)胞的突變。3)免疫脾細(xì)胞的制備
免疫3天后，小白鼠眼球放血后拉頸處死，收集血清并離心，上清凍存，做陽(yáng)性對(duì)照；將小鼠放于70%酒精中浸泡消毒5分鐘，取出固定于板上，在無菌條件下取脾；把脾放入5mL1640液中，輕輕洗去脾上的紅血球；用折彎后的巴氏管輕輕擠壓脾，制成脾細(xì)胞懸液，用吸管將懸液移入無菌離心管中；并以400g離心3-5 min (與此同時(shí)應(yīng)開始制備骨髓細(xì)胞);把沉淀用約10 mL的新鮮培養(yǎng)液再懸??；計(jì)數(shù)細(xì)胞，活細(xì)胞數(shù)高于80%為合格。4)細(xì)胞融合
取上述免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)按5-10 1的比例，在無血清的RPMI-1640 (Gibco)培養(yǎng)基中混勻，1500 rpm離心5 min，去除培養(yǎng)基，用50 % PEG (聚乙二醇，分子量為1500，Sigma)作為融合劑，在37°C下水浴下加入0. 5-0. 7ml，使其融合2 min,用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基終止融合后1500 rpm離心5 min,沉淀用HAT篩選培養(yǎng)基(Sigma)懸浮，分裝到96孔含有飼養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞板中，37°C，5 % C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5)雜交瘤細(xì)胞、陽(yáng)性孔的篩選及其克隆
細(xì)胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后，用HAT篩選培養(yǎng)基換液一次，第10天用HT培養(yǎng)基換液，等到融合細(xì)胞覆蓋孔底10-30%時(shí)，用環(huán)丙沙星偶聯(lián)卵清蛋白(CIP-OVA)作為包被抗原進(jìn)行間接ELISA方法篩選陽(yáng)性孔，共獲51多個(gè)對(duì)環(huán)丙沙星有反應(yīng)的陽(yáng)性孔，陽(yáng)性率為5 %。陽(yáng)性孔進(jìn)一步用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA鑒定篩選，選擇6個(gè)呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)的細(xì)胞孔，進(jìn)行有限稀釋法克隆3-4次，獲得IFl I株能分泌抗環(huán)丙沙星的特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株。間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA分析發(fā)現(xiàn)該單抗的半數(shù)抑制率IC50及20%的抑制率IC20分別為3. 65 ng mL'O. 51 ng mL—1。經(jīng)6個(gè)月以上體外傳代和多次凍存復(fù)蘇后，細(xì)胞株均能良好生長(zhǎng)，并穩(wěn)定分泌抗體。經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，用于腹水制備和液氮保存。6)細(xì)胞凍存
細(xì)胞凍存液所含血清的量為40%，凍存液中含8-10%的DMSO ;細(xì)胞濃度為IO7個(gè)/mL ;細(xì)胞凍存管放入凍存盒后放入-80 °C，幾天后轉(zhuǎn)入液氮中長(zhǎng)期保存；含青霉素100 U/mL，環(huán)丙沙星 100 Ii g/mL。7)細(xì)胞復(fù)蘇
從液氮罐中取出凍存管，立即放37°C水浴中速溶I min;400g離心3 min，無菌操作打開凍存管，棄上清，細(xì)胞用HT培養(yǎng)基重新懸浮，取出細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶；培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2小時(shí)后吸掉培養(yǎng)上清，加入新的培養(yǎng)基培養(yǎng)。8)單克隆抗體腹水制備及純化
取8周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射0. 3-0. 5 ml降植烷(Sigma)，7_10天后腹腔注入5-10X IO5個(gè)雜交瘤細(xì)胞，注射后7-10天可見小鼠腹部明顯膨大，采取腹水，3000-5000 rpm離心3-5 min，收集上清液，即為單克隆抗體腹水。采用辛酸-硫酸銨法進(jìn)行單克隆抗體免疫球蛋白的分離沉淀。取I倍體積腹水加2倍體積0. 06 M pH 4. 8醋酸緩沖液稀釋，加辛酸(33 ul/ml腹水),室溫下邊加邊攪拌，4°C澄清I小時(shí)，12000 rpm離心20 min,收集上清，再用50%飽和硫酸銨沉淀免疫球蛋白，4°C放置2小時(shí)，3000-5000 rpm離心10 min,收集沉淀，沉淀用少量PBS溶解,透析并更換6次透析液,離心(5000 rpm, 20 min),上清即為純化后的抗體，其濃度為4. 35 mg 111^,-70 °C冷凍保存。9)單克隆抗體的亞類鑒定和腹水效價(jià)測(cè)定
采用美國(guó)Sigma公司的羊抗鼠IgGl, IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA, IgM標(biāo)準(zhǔn)抗血清，將純化的腹水抗體作適當(dāng)稀釋后用瓊脂雙擴(kuò)散法測(cè)定，24h后觀察沉淀線，判斷單抗的抗體類型及亞類。結(jié)果為，IFl的抗體類型及亞類均為IgGl，輕鏈為kappa鏈。腹水效價(jià)測(cè)定以間接ELISA方法測(cè)定，操作如下=CIP-OVA交聯(lián)物lOPg/ml濃度用0. 05mol / L pH 9. 6碳酸鹽緩沖液包被ELISA板，每孔lOOul，37°C孵育2h，PBST洗滌3次；用2. 0%脫脂奶封閉，每孔200ul，37°C孵育0. 5h后洗滌3次；倍比稀釋的腹水作一抗，每孔lOOul，37°C孵育Ih后洗滌3次；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，每孔lOOul，37°C孵育Ih后洗滌3次，加入底物溶液，每孔lOOul，37°C孵育15min，加入50ul 2mol/l硫酸終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定0D450值。0D450值為大于陰性抗體的2. I倍時(shí)的抗體的最高稀釋倍數(shù)即為其效價(jià)。IFl單抗的ELISA效價(jià)達(dá)到10_7以上。10)單抗的特異性
采用方陣滴定方法確定間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA抗原抗體最佳工作濃度，在優(yōu)化的條件下，將環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品、雙氫環(huán)丙沙星、卡那霉素、慶大霉素、新霉素、青霉素G、磺胺嘧啶、氯霉素、蔗糖、葡萄糖做系列稀釋，分別與單抗進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并在曲線上找出抑制率50%的濃度，以及上述幾種物質(zhì)50%抑制率的濃度，然后計(jì)算出各類抗生素的交叉反應(yīng)率。交叉反應(yīng)率CR計(jì)算方法為CR% =環(huán)丙沙星IC5tl/其它抗生素IC5tlX 100。如表I所示，單抗與喹諾酮類藥物有交叉反應(yīng)，但與新霉素、慶大霉素、卡那霉素、磺胺嘧啶、青霉素G、四環(huán)素的交叉反應(yīng)率均小于0. 01%,說明單抗具有很好的特異性，而且對(duì)于喹諾酮類藥物，如恩諾沙星、氧氟沙星、達(dá)氟沙星、諾氟沙星、依諾沙星、麻保沙星、沙拉沙星、雙氟沙星等具有明顯的抑制作用，因此，所確定的單抗不單可以檢測(cè)環(huán)丙沙星，亦可檢測(cè)上述的喹諾酮類藥物。表I.單抗的特異性分析
權(quán)利要求
1.一種分泌抗喹諾酮類藥物單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，保藏號(hào)為CGMCC N O. 5608,其特征在于能分泌抗喹諾酮類藥物單克隆抗體。
2.一種如權(quán)利要求I所述的雜交瘤細(xì)胞株分泌抗喹諾酮類藥物單克隆抗體，其特征在于該單克隆抗體腹水間接ELISA效價(jià)達(dá)1(Γ7以上,抗體類型及亞類為IgGl、kappa鏈,該單克隆抗體能與喹諾酮類藥物環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、達(dá)氟沙星、諾氟沙星、依諾沙星、麻保沙星、沙拉沙星和雙氟沙星有特異性免疫反應(yīng)。
3.—種如權(quán)利要求2所述的抗喹諾酮類藥物單克隆抗體在食品中該類抗生素殘留檢測(cè)上的應(yīng)用，其特征在于以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學(xué)檢測(cè)方法及其試劑盒和試紙條。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分泌抗喹諾酮類藥物單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其單抗的應(yīng)用。用與牛血清白蛋白偶聯(lián)的環(huán)丙沙星(CIP)為抗原免疫BALB/c小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合、篩選、克隆，獲得1株能穩(wěn)定傳代并分泌抗喹諾酮類藥物單克隆抗體(MAb)的雜交瘤細(xì)胞株1F1，其保藏號(hào)為CGMCCNo.5608。1F1單克隆抗體腹水間接ELISA效價(jià)達(dá)10-7以上，抗體類型及亞類為IgG1，kappa鏈。間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA分析表明，該株單抗與環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、達(dá)氟沙星、諾氟沙星、依諾沙星、麻保沙星、沙拉沙星、雙氟沙星等喹諾酮類藥物有特異反應(yīng)。利用1F1單抗開發(fā)了檢測(cè)食品中喹諾酮類藥物殘留的ELISA方法及試劑盒和試紙條。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102618502SQ201210004198
公開日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月9日
發(fā)明者吳建祥 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)