專利名稱：一種用omc685-1細(xì)胞分離培養(yǎng)呼吸道合胞病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種呼吸道合胞病毒的分離培養(yǎng)方法，具體涉及ー種用0MC685-1細(xì)胞分離培養(yǎng)呼吸道合胞病毒的方法。
背景技術(shù)：
呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)屬于副粘病毒科肺炎病毒屬，電鏡下形態(tài)多祥，可以是纖毛狀或近似球狀。RSV對(duì)環(huán)境中各種因素的耐受カ很差，較高的溫度、低pH、有機(jī)溶劑、去污劑等都能使它很快滅活。因此臨床分離病毒時(shí)要求盡快接種到敏感細(xì)胞上。RSV能在ー些傳代細(xì)胞中生長(zhǎng)，例如HEp-2，HeLa, HFF, A549以及恒河猴腎細(xì)胞。在理想條件下，最早可在接種后兩天看到RSV特有的融合細(xì)胞，但通常需要4-5天才能看到細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。雖然病毒培養(yǎng)是從臨床標(biāo)本中檢測(cè)RSV的最好方法，但傳統(tǒng)的細(xì)胞管方法因耗時(shí)較長(zhǎng)(1 2周)。 小瓶培養(yǎng)法可接種相同量的標(biāo)本，可將分離時(shí)間從7 10天減少到1 2天，因此得到廣泛應(yīng)用。0MC685細(xì)胞系是本單位萬啟惠、李宗權(quán)、徐大剛和吳中明等建立的一株人卵巣粘液性囊腺癌細(xì)胞系，文獻(xiàn)來源《人卵巣粘液性囊腺癌細(xì)胞系的建立及生物學(xué)特性的研究》，中華婦產(chǎn)科雜志，2001年7月第36卷第7期，421-423。本發(fā)明中的0MC685-1細(xì)胞是0MC685 細(xì)胞系采用有限稀釋法克隆純化得到的。本發(fā)明采用0MC685-1細(xì)胞做呼吸道合胞病毒分離工具，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞病變效應(yīng)和間接免疫熒光法檢測(cè)病毒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題解決目前RSV病原體分離存在的靈敏度低、費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)等問題，本發(fā)明用人卵巣粘液性囊腺癌細(xì)胞(0MC685-1)作為工具，分離RSV病毒，與傳統(tǒng)的病毒分離方法相比提高了檢測(cè)的靈敏度，并縮短了培養(yǎng)時(shí)間。本發(fā)明采用的技術(shù)方案
本發(fā)明用0MC685-1細(xì)胞做呼吸道合胞病毒分離工具，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞病變效應(yīng)， 再用間接免疫熒光法確認(rèn)病毒。
本發(fā)明用0MC685-1細(xì)胞分離培養(yǎng)呼吸道合胞病毒的方法，包括以下步驟
(1)培養(yǎng)0MC685-1細(xì)胞0MC685-1細(xì)胞復(fù)蘇后接種于含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于相對(duì)濕度為95 % 98 %，37°C，5 % CO2及37°C條件下培養(yǎng)；每2 3d換液1 次，4 5d傳代1次；將生長(zhǎng)良好的細(xì)胞用0. 25 %胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，以IX IO5個(gè) /孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板，0. 1 ml/孔，置于37°C、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后感染病毒；
(2)感染0MC685-1細(xì)胞，用PBS反復(fù)沖洗96孔培養(yǎng)板三次，吸干孔內(nèi)剩余PBS液， 每孔接種40ul含呼吸道合胞病毒的標(biāo)本，對(duì)照孔接種PBS液40ul，感染1- 后用無血清 RPMI-1640培養(yǎng)液沖洗96孔培養(yǎng)板三次，吸干孔內(nèi)剩余液體，每孔加入0. Iml維持液，含1小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，每4-1 倒置顯微鏡下觀察一次是否出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)； (3)收集感染細(xì)胞做間接免疫熒光法檢測(cè)確認(rèn)病毒。本發(fā)明達(dá)到的有益效果
本課題組研究0MC685-1發(fā)現(xiàn)，對(duì)RSV敏感性較高，低滴度的RSV即引起細(xì)胞出現(xiàn) CPE，用RSV抗體檢測(cè)RSV，可在0MC685-1細(xì)胞胞漿內(nèi)發(fā)現(xiàn)明顯的綠色熒光顆粒；對(duì)感染 0MC685-1細(xì)胞或上清提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄后用RSV特異弓|物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以擴(kuò)增出單一目的條帶，由此說明0MC685細(xì)胞對(duì)RSV敏感，可以用來分離培養(yǎng)RSV。敏感細(xì)胞的使用，對(duì)RSV相關(guān)研究，是ー種重要的工具?，F(xiàn)國內(nèi)外常用的敏感細(xì)胞有HEp-2，Hela等。0MC685細(xì)胞系是本課題組萬啟惠、李宗權(quán)、徐大剛和吳中明等建立的一株人卵巣粘液性囊腺癌細(xì)胞系，對(duì)脊髓灰質(zhì)炎病毒I型、腺病毒7型及麻疹病毒敏感。為了摸索更多分離RSV工具，本發(fā)明用0MC685細(xì)胞經(jīng)有限稀釋法克隆化后得到0MC685-1，經(jīng) RSV感染并以Hela細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)對(duì)照，對(duì)其敏感性進(jìn)行判斷。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用0MC685-1細(xì)胞在感染后6-10h開始出現(xiàn)CPE，16h后各孔細(xì)胞均出現(xiàn)了明顯的CPE，24h后能明顯的觀察到融合細(xì)胞，4^1-7 后病變細(xì)胞開始脫落。而Hela在24h后才開始出現(xiàn)CPE ；0MC685-1細(xì)胞的 TCID50=IO-9.0, JEC 細(xì)胞 TCID5ci=IO-8125, Hela 細(xì)胞 TCID5(1=l(r5·5，表明 0MC685-1 細(xì)胞對(duì) RSV的敏感性大大高于Hela細(xì)胞。用新的細(xì)胞工具0MC685-1分離RSV，方法靈敏度高，能檢測(cè)低滴度的RSV，觀察便捷，提高了分離培養(yǎng)的靈敏度，更縮短了分離培養(yǎng)的時(shí)間。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明ー種用0MC685-1細(xì)胞分離培養(yǎng)呼吸道合胞病毒的方法，用0MC685-1細(xì)胞做呼吸道合胞病毒分離工具，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞病變效應(yīng)和間接免疫熒光法檢測(cè)病
本發(fā)明中的0MC685-1細(xì)胞是0MC685細(xì)胞系采用有限稀釋法克隆純化得到的，步驟如
下
將0MC685克隆化純化，對(duì)人卵巣粘液性腺癌細(xì)胞系進(jìn)行克隆化處理用有限稀釋法將 0MC685細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，用含10%小牛血清的完全培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞至4-5個(gè)/毫升，按每孔0. 1毫升細(xì)胞懸液接種于96孔板；置37°C 5%C02培養(yǎng)箱，每天觀察，在僅有1個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)孔上做標(biāo)記；待細(xì)胞長(zhǎng)滿孔底后用0. 25%的胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶傳代培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛后進(jìn)行液氮凍存，即為0MC685-1細(xì)胞。
實(shí)施例1:
本發(fā)明ー種用0MC685-1細(xì)胞分離培養(yǎng)呼吸道合胞病毒的方法，包括以下步驟 (D0MC685-1細(xì)胞培養(yǎng)
0MC685-1細(xì)胞復(fù)蘇后接種于含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于相對(duì)濕度為 95 % 98 %、5 % CO2及37°C條件下培養(yǎng)。每2 3d換液1次，4 5d傳代1次。將生長(zhǎng)良好的0MC685-1細(xì)胞用0. 25 %胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，以1 X IO5個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板，0. 1 ml/孔，置于37°C、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日待細(xì)胞貼壁鋪滿孔底； (2)感染細(xì)胞和倒置顯微鏡觀察CPE
用PBS反復(fù)沖洗96孔培養(yǎng)板三次，吸干孔內(nèi)剩余PBS液，每孔接種咽拭子液(上呼吸道感染小孩用藥前取咽拭子放入含雙抗的無菌試管內(nèi)處理ai)40ul，對(duì)照孔接種PBS液40ul， 感染1-ai后用無血清RPMI-1640培養(yǎng)液沖洗96孔培養(yǎng)板三次，吸干孔內(nèi)剩余液體，每孔加入維持液(含2、小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液)0. 1ml，每4_1池觀察一次是否出現(xiàn)CPE ；
(3)間接免疫熒光法
觀察48-7池，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，PBS反復(fù)沖洗三次，然后用冷丙酮固定10分鐘，2% Trition-IOO作用5分鐘，PBS液沖洗三次(3min/次)，每孔加入1:2 RSV抗體5ul，濕盒37°C 孵育45分鐘，PBS液沖洗三次(3min/次)，每孔加入1:30 ニ抗IOul (羊抗鼠IgG FITC)， 濕盒37°C孵育45分鐘，PBS液沖洗三次(3min/次)，倒置熒光顯微鏡觀察胞內(nèi)及包膜緑色熒光，感染組出現(xiàn)明顯熒光顆粒，表明用0MC685-1細(xì)胞分離培養(yǎng)RSV成功。
權(quán)利要求
1.ー種用0MC685-1細(xì)胞分離培養(yǎng)呼吸道合胞病毒的方法，其特征在于用0MC685-1 細(xì)胞做呼吸道合胞病毒分離工具，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞病變效應(yīng)，再用間接免疫熒光法確認(rèn)病母。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ー種用0MC685-1細(xì)胞分離培養(yǎng)呼吸道合胞病毒的方法，其特征在于包括以下步驟(1)培養(yǎng)0MC685-1細(xì)胞0MC685-1細(xì)胞復(fù)蘇后接種于含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于相對(duì)濕度為95 % 98 %，37°C，5 % CO2及37°C條件下培養(yǎng)；每2 3d換液1 次，4 5d傳代1次；將生長(zhǎng)良好的細(xì)胞用0. 25 %胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，以IX IO5個(gè) /孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板，0. 1 ml/孔，置于37°C、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后感染病毒；(2)感染0MC685-1細(xì)胞，用PBS反復(fù)沖洗96孔培養(yǎng)板三次，吸干孔內(nèi)剩余PBS液， 每孔接種40ul含呼吸道合胞病毒的標(biāo)本，對(duì)照孔接種PBS液40ul，感染1- 后用無血清 RPMI-1640培養(yǎng)液沖洗96孔培養(yǎng)板三次，吸干孔內(nèi)剩余液體，每孔加入0. Iml維持液，含21 小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，每4-1 倒置顯微鏡下觀察一次是否出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)；(3)收集感染細(xì)胞做間接免疫熒光法檢測(cè)確認(rèn)病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用OMC685-1細(xì)胞分離培養(yǎng)呼吸道合胞病毒的方法，用OMC685-1細(xì)胞做呼吸道合胞病毒分離工具，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞病變效應(yīng)和間接免疫熒光法檢測(cè)病毒，具體包括培養(yǎng)OMC685-1細(xì)胞、感染OMC685-1細(xì)胞系和倒置顯微鏡觀察CPE以及免疫熒光檢測(cè)呼吸道合胞病毒，本發(fā)明的分離培養(yǎng)方法可以直觀的判斷收集標(biāo)本是否有RSV，方法簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，靈敏度高，費(fèi)時(shí)短，成本低。
文檔編號(hào)G01N33/569GK102559608SQ201210012069
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月16日
發(fā)明者吳中明, 唐君, 彭志元, 敖弟書, 肖福峰 申請(qǐng)人:遵義醫(yī)學(xué)院