專利名稱：一種豬瘟病毒重組E2蛋白及其IgM抗體ELISA檢測試劑盒的制作方法
—種豬瘟病毒重組E2蛋白及其I gM抗體ELISA檢測試劑盒技術領域
本發(fā)明屬于分子生物學領域，涉及一種豬瘟病毒重組E2蛋白和豬瘟病毒IgM抗體 ELISA檢測試劑盒。
背景技術：
大腸桿菌表達系統(tǒng)是目前比較成熟的表達系統(tǒng)，具有操作簡單，安全無毒，外源蛋白表達量高等優(yōu)點，已經(jīng)成功用于多種蛋白的生產(chǎn)。E2蛋白是豬瘟病毒(CSFV)的主要囊膜蛋白，介導病毒感染入胞和保護性免疫反應，是CSFV主要的免疫保護性抗原。目前豬瘟抗體的檢測方法主要基于E2蛋白建立間接或阻斷ELISA以及間接血凝試驗，但對于該蛋白誘導IgM抗體產(chǎn)生規(guī)律和在免疫保護中作用的研究尚未有報道，本發(fā)明旨在建立檢測E2蛋白IgM抗體的ELISA方法，為臨床檢測和相關研究奠定基礎。發(fā)明內(nèi)容
技術問題本發(fā)明的目的是針對目前尚無用于CSFV IgM抗體檢測方法的現(xiàn)狀，提供一種準確可靠的CSFV IgM抗體ELISA檢測試劑盒。
本發(fā)明的另一目的是提供用于ELISA方法的重組E2蛋白的制備方法。
技術方案本發(fā)明的目的通過如下技術方案實現(xiàn)一種重組大腸桿菌表達的豬瘟病毒E2蛋白，該蛋白系將包含E2主要抗原區(qū)的基因片段克隆入原核表達載體得到重組表達載體，將該重組表達載體轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，該重組大腸桿菌BL21 (DE3)培養(yǎng)至0D600達0. 6-0. 8時加入終濃度為0. 5mM的IPTG進行誘導表達，分離菌體經(jīng)Ni親和層析柱純化獲得。
所述E2氨基酸序列為SEQ ID NO. 1，即豬瘟病毒多聚蛋白的第791-969位氨基酸殘基。
LCPFDTSPVVKGKYNTTLLNGSAFYLVCPIGWTGVIECTAVSPTTLRTEVVKTFRRDKPFPHRMDCVTT IVENEDLFYCKLGGNWTCVKGEPVVYTGGVVKQCRWCGFDFDGPDGLPHYPIGKCILANETGYRIVDSTDCNRDGVV ISTEGSHECLIGNTTVKVHASDERLGPMPCRPK其核苷酸序列為SEQ ID NO. 2。
CTGTGCCCGTTTGATACGAGTCCTGTTGTTAAGGGAAAGTACAATACGACCTTGTTGAACGGTAGTGCT TTCTATCTTGTCTGCCCAATAGGGTGGACGGGTGTCATAGAGTGCACAGCAGTGAGCCCAACAACTCTGAGGACAGA AGTGGTAAAGACCTTCAGGAGAGACAAGCCCTTTCCGCACAGAATGGATTGTGTGACCACCATAGTGGAAAATGAAG ATTTATTCTATTGTAAGTTGGGGGGCAACTGGACATGTGTGAAAGGCGAGCCAGTGGTCTACACAGGGGGGGTAGTA AAACAATGTAGATGGTGTGGCTTCGACTTCGATGGGCCTGACGGACTCCCGCATTACCCCATAGGTAAGTGCATTTT GGCAAATGAGACAGGTTACAGAATAGTAGATTCAACGGACTGTAACAGAGATGGCGTTGTAATCAGCACAGAGGGGA GTCATGAGTGCTTGATCGGTAACACGACTGTCAAGGTGCATGCATCAGATGAAAGACTGGGCCCTATGCCATGCAGACCTAA所述的原核表達載體為pET32a。
本發(fā)明所述的重組大腸桿菌表達的CSFV E2蛋白的制備方法，包括如下步驟(1)根據(jù)CSFV 基因序列設計引物 F: CCGGAATTCCGGCTGTGCCCGTTTGATACGAGTC (SEQ ID NO. 3)、R: CAAGCTTGTCTTTAGGTCTGCATGGCATAGG (SEQ ID NO. 4)，從豬瘟兔化弱毒疫苗毒中提取RNA，經(jīng)RT-PCR擴增得到編碼目的基因片段(SEQ ID NO. 2)，通過&oRI和歷/^III兩個酶切位點，把所述的基因片段克隆入原核表達載體中，然后通過酶切和測序鑒定，獲得陽性重組質粒；(2)將步驟(I)所述的經(jīng)序列測定正確的重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)，得到重組表達菌株BL21-AE2 ；(3)培養(yǎng)所述的重組表達菌株BL21-A E2，加入IPTG進行誘導表達，經(jīng)親和柱純化獲得所述的重組蛋白。
所述的重組大腸桿菌表達的豬瘟病毒E2蛋白制備的ELISA檢測試劑盒，包含所述蛋白包被的酶標板、0. 5%BSA作為最佳封閉液、陰陽性對照、酶標二抗IgM、TMB顯色液、終止液和洗滌液。其用于IgM抗體的ELISA檢測方法為，將上述重組蛋白包被酶標板，通過抗原包被濃度、血清稀釋度和作用時間、二抗?jié)舛群妥饔脮r間以及顯色時間的優(yōu)化建立ELISA 方法，檢測陰性血清確定臨界值和判定標準。
有益效果目前報道的CSFV抗體檢測方法大多數(shù)是以重組E2蛋白為基礎，但均是檢測IgG抗體， 關于IgM抗體的檢測方法還沒有報道；此外，也沒有關于豬瘟疫苗免疫和野毒感染后IgM抗體產(chǎn)生變化規(guī)律的報道。本發(fā)明構建了表達豬瘟E2蛋白的重組大腸桿菌，并將其用于建立 CSFV IgM抗體ELISA檢測方法，初步應用結果表明該重組蛋白具有良好的抗原性，所建立的ELISA試劑盒使用后特異、準確、敏感、重復性好，這將為系統(tǒng)研究豬瘟免疫后IgM抗體產(chǎn)生規(guī)律、臨床感染情況的監(jiān)測和鑒別診斷方法的建立奠定基礎。


圖I目的基因的PCR擴增。
I :PCR 產(chǎn)物；2 DNA marker DL-2000 圖2重組質粒的酶切鑒定I DNA marker DL-2000 ；2 :酶切的重組質粒圖3 SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達與純化I :純化的蛋白；2 :誘導后的上清；3 :包涵體；4 :空質粒誘導對照；M :蛋白marker 圖4重組蛋白的Western blot鑒定(左圖His單抗為一抗；右圖陽性豬血清為一抗)I :預染蛋白marker ；2 :重組蛋白；3 :空質粒對照具體實施方式
實施例I E2基因片段的PCR擴增與原核表達質粒的構建 1.1引物設計根據(jù)根據(jù)CSFV基因序列設計引物，上下游引物各引入feoRI和Z/i/^III位點，序列如下F: CCGGAATTCCGGCTGTGCCCGTTTGATACGAGT C (SEQ ID NO. 3)；R: CAAGCTTGTCTTTAGGTCTGCATGGCATAGG (SEQ ID NO. 4)以上引物由南京思普金生物科技有限公司合成。
I. 2 PCR擴增目的片段取200iil豬瘟兔化弱毒疫苗毒(購自南京天邦生物科技有限公司)，加入Iml Trizol 試劑，震蕩混勻，靜置lOmin，加入200ii I氯仿，劇烈震蕩，12000rpm 4°C離心lOmin，小心吸取上清，加入等體積異丙醇混勻，-20°C放置2h, 12000rpm 4°C離心15min,棄上清,加入 75%乙醇洗滌，干燥，加入10 ill無Rnase的雙蒸水溶解RNA。
按照反轉錄試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)操作說明用Oligo (dT) 18 進行反轉錄，具體為2 XES Reaction Mix 10 u I ；EasyScript RT/RI Enzyme Mix I u I ； Oligo (dT) 18 Iyl ;RNA 5 ill ;無 Rnase 的雙蒸水補足至 20 ill。42°C 反應 45min，85°C 加熱5min滅活反轉錄酶，以反轉錄產(chǎn)物為模板，進行PCR擴增。PCR反應體系為上游、下游引 *(10pmol/L>^liiL;dNTP s (2. 5 mmol/L)2 u L ；10 XPCR buffer 2. 5 y L ;模板 4 y L ; Taq酶(5 U / U L) 0. 5 y L ;滅菌雙蒸水補至25 UL0循環(huán)參數(shù)94 °C預變性5min ;以94 V 30 S，52 V 30 S，72 V 45 s進行35次循環(huán)；最后72 °C延伸10 min。1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，可以看到約560bp的條帶(結果見圖1)，回收PCR產(chǎn)物，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> 1.3重組質粒的構建和鑒定將回收的目的基因PCR產(chǎn)物用&0RI和III雙酶切，回收純化之后克隆入同樣酶切處理的表達載體質粒pET-32a (Novagen)中，連接反應在16°C進行，之后將連接產(chǎn)物轉化 E. coli DH5ci (購自北京全式金生物技術有限公司)感受態(tài)細胞，涂布含氨芐青霉素的LB平板，37°C培養(yǎng)。挑取平板上的菌落，在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，堿裂解法提取質粒， 經(jīng)PO^PfeoRI和歷III雙酶切鑒定(結果見圖2)，陽性質粒pET32a-e2獲得約560bp的目的條帶。陽性質粒送南京思普金生物科技有限公司進行測序。
實施例2重組表達菌株BL21- A E2的構建2.I轉化感受態(tài)大腸桿菌BL-21實施例I中經(jīng)序列測定正確的重組質粒pET32a-e2轉化大腸桿菌BL21 (DE3)(購自北京全式金生物技術有限公司)，得到重組表達菌株BL21- A E2，同時將空質粒pET-32a同法轉化感受態(tài)大腸桿菌BL-21。
2.2重組蛋白的誘導表達分別挑取重組表達菌株BL21- A E2和含空質粒的大腸桿菌BL21單菌落接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C過夜振搖培養(yǎng)。
(I)取過夜培養(yǎng)的菌液IOii L接種于3 ml含有氨芐青霉素(50iig/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C 200rpm振蕩培養(yǎng)3h左右，使OD6tltl達到0. 6 0. 8，取100 y L樣品于無菌 Eppendorf管中作為誘導前對照；(2)向上述菌液中加入終濃度為0. 5mmol/L的IPTG進行重組蛋白的誘導表達，并在加 A IPTG后4h收菌；4°C 8000 rpm離心5min收集誘導表達的細菌，PBS (pH 7. 2)重懸菌體沉淀；(3)將菌液反復凍融3次，超聲波裂解細菌，直至菌液變得清澈；(4)4°C 8000 rpm離心IOmin,將沉淀用與上清等體積的PBS重懸,上清與沉淀懸浮液各取100 u L備用。
2. 3SDS-PAGE 電泳分析上清與沉淀蛋白樣品以及空載體誘導產(chǎn)物中加入5 X蛋白樣品上樣緩沖液(250mM Tris-HCl,pH6. 8 ；10%SDS ；0. 5%溴酚藍;50%甘油；5% 2-巰基乙醇)，充分混勻后100。。煮沸 5min，上樣前瞬時離心，吸取上清進行SDS-PAGE，沉淀中可見明顯的38kD目的條帶，空載體誘導產(chǎn)物和上清中沒有(圖3)，表明目的蛋白以包涵體的形式正確表達。
實施例3 重組蛋白的大量表達，純化及抗原性鑒定 3.1重組蛋白的大量表達，純化挑取2. 2中的重組表達菌株BL21- A E2陽性菌落，接種200mlLB中，按實施例2的誘導表達條件誘導表達，離心收集菌體，按每IOOml菌液加入5ml PBS重懸菌體沉淀，超聲裂解后離心，分離上清和包涵體，包涵體用等體積Binding buffer重懸,按照GE HisTrap HP 親和純化柱說明進行目的蛋白的純化(圖3)。分光光度計測定蛋白濃度為I. 2mg/mL，分裝后-20°C保存。
3. 2重組蛋白的Western blot鑒定(1)SDS-PAGE；(2)轉印電泳結束后，取下凝膠按下列順序安裝轉印裝置(半干轉印法)即+極一海綿一NC膜一凝膠一海綿一一極，轉印條件是20V，30min ；(3)將NC膜(Pall)用含5%脫脂乳的PBST封閉液封閉過夜；(4)將His-TagMouse McAb (Abmart)和陽性豬血清(購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)用封閉液1:2000 (或1:500)稀釋后，加入到NC膜上，室溫輕搖2h ；(5)用PBST洗滌5次，5min/次；(6)加I:1000稀釋的羊抗鼠IgG-HRP或羊抗豬IgG-HRP(北京博奧森)，室溫輕搖I. 5h ；(7)用PBST洗滌5次，5min/次；(10)用DAB顯色試劑盒顯色(武漢博士德):Iml去離子水中加入A、B、C液各一滴，混勻后加到NC膜上，直至有明顯條帶出現(xiàn)。結果見圖4，重組蛋白泳道均有特異性條帶(38kD) 出現(xiàn)，空載體對照則沒有。
實施例4 ELISA試劑盒的建立與應用4. I抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的選擇按矩陣法進行，以PH 9.6的碳酸鹽緩沖液將抗原蛋白分別稀釋至終濃度為2. 0，I. 0，0.5,0. 25 u g/mL，4°C過夜包被酶標板(Nunc)。洗滌后加入用 PBST 以 1:50、1:100、1:200、 1:400、1:800、1:1600稀釋的豬瘟陽性血清和陰性血清，每個稀釋度重復一次，取其平均值， 計算各條件下P/N值，選擇陽性血清OD值接近I、P/N值最大的反應條件作為ELISA最佳反應條件。結果為抗原最佳包被濃度0. 5 u g/mL ;血清最佳稀釋度1:100 (表I)。
表I抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的選擇
權利要求
1.一種重組大腸桿菌表達的豬瘟病毒E2蛋白，該蛋白系將包含E2主要抗原區(qū)的基因片段克隆入原核表達載體pET-32a得到重組表達載體，將該重組表達載體轉化大腸桿菌 BL21 (DE3)獲得重組大腸桿菌BL21 (DE3)，將該重組大腸桿菌BL21 (DE3)培養(yǎng)至0D600達0.6-0. 8時加入終濃度為0. 5mM的IPTG進行誘導表達，分離菌體經(jīng)Ni親和層析柱純化獲得。
2.根據(jù)權利要求I所述的重組大腸桿菌表達的豬瘟病毒E2蛋白，其特征在于所述的 E2蛋白氨基酸序列為SEQ ID NO. I。
3.根據(jù)權利要求I或2所述的重組大腸桿菌表達的豬瘟病毒E2蛋白，其特征在于編碼所述E2蛋白的核苷酸序列為SEQ ID NO. 2。
4.權利要求1-3之一所述的重組大腸桿菌表達的豬瘟病毒E2蛋白的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)根據(jù)CSFV 基因序列設計引物 F: CCGGAATTCCGGCTGTGCCCGTTTGATACG AGTC、R: CAAGCTTGTCTTTAGGTCTGCATGGCATAGG,從豬瘟兔化弱毒疫苗毒中提取RNA，經(jīng)RT-PCR擴增得到編碼目的基因片段SEQ ID NO. 2，通過&0RI和歷III兩個酶切位點，把所述的基因片段克隆入原核表達載體中，然后通過酶切和測序鑒定，獲得陽性重組質粒；(2)將步驟(I)所述的經(jīng)序列測定正確的重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)，得到重組表達菌株BL21-AE2 ；(3)培養(yǎng)所述的重組表達菌株BL21-A E2，加入IPTG進行誘導表達，經(jīng)親和柱純化獲得所述的重組蛋白。
5.用權利要求1-3之一所述的重組大腸桿菌表達的豬瘟病毒E2蛋白制備的ELISA檢測試劑盒，包括所述重組蛋白包被的酶標板、質量比0. 5%BSA作為最佳封閉液、陰陽性對照、酶標二抗HRP標記兔抗豬IgM、TMB顯色液、終止液和洗滌液。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學領域，涉及一種豬瘟病毒重組E2蛋白及其IgM抗體ELISA檢測試劑盒。一種重組大腸桿菌表達的豬瘟病毒E2蛋白，該蛋白系將E2蛋白主要抗原區(qū)域克隆入原核表達載體得到重組表達載體，將該重組表達載體轉化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)重組大腸桿菌表達純化后獲得，Westernblot試驗證明該蛋白具有良好的抗原性。將該蛋白包被酶標板，通過抗原包被濃度、血清稀釋度和作用時間、二抗?jié)舛群妥饔脮r間以及顯色時間的優(yōu)化建立ELISA方法，檢測陰性血清確定臨界值和判定標準。本發(fā)明構建的重組菌株對外源蛋白表達穩(wěn)定，抗原性好；在此基礎上首次用于建立CSFVIgM抗體ELISA檢測試劑盒。
文檔編號G01N33/68GK102532281SQ20121001315
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月17日 優(yōu)先權日2012年1月17日
發(fā)明者李彬, 李文良, 毛立, 江杰元 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學院