專利名稱：心血管疾病的檢測的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測在例如人或者非人類動物，特別是哺乳動物的宿主中心血管疾病(CVD)的可能性或傾向性的檢測方法，并具體涉及一種用于在該宿主出現(xiàn)明顯的 CVD癥狀發(fā)作之前，檢測CVD的可能性或傾向性的檢測方法。
背景技術(shù)：
心血管疾病是人類健康不良的一個主要來源。在1998年，全歐洲的死亡人數(shù)中大約有40 %的死于CVD (即，每2. 5例死亡中就有I例)。據(jù)估計，2002年，在美國，將有超過一百萬人遭受新發(fā)現(xiàn)的和復發(fā)的心臟冠狀動脈發(fā)作的病痛，并且在患有這些疾病的人數(shù)中將有超過40%的人會死亡。這些人中的許多都是在未經(jīng)就醫(yī)或治療的情況下突然死亡的。 許多人都將不能認識到他們易患心血管疾病。然而，早期或搶先治療，例如改變飲食、減少或停止吸煙、增加運動量、降低體重等在預防CVD或降低CVD的傾向性方面具有很高的成功率。因此，如果能夠檢測CVD或CVD 的可能性或傾向性，就能夠有效地進行治療。因此，需要一種在CVD疾病發(fā)展到超過通?？沙晒χ委?例如改變生活方式和/ 或習慣)的階段之前，用于診斷CVD，特別是診斷CVD的可能性或傾向性的方法。特別地， 需要一種在當癥狀對宿主和第三方例如內(nèi)科醫(yī)師并不明顯的早期階段，用于檢測CVD的方法，即需要用于測試“無癥狀宿主”的方法。這種方法可被用于篩選一般人群(即普查)或者易感人群，例如年齡超過40歲的男性、從事高壓力工作的工人、具有不良飲食習慣的個人、患有臨床肥胖癥的個人、吸煙者等。在診斷出具有CVD可能性或CVD傾向的病例中，可以進行預先治療和/或鼓勵病人調(diào)節(jié)生活方式和習慣。同樣地，當檢測出具有CVD可能性或CVD傾向時，可對病人進行進一步的測試，例如使用更昂貴的或更費時的技術(shù)，例如有和沒有身體活動的ECG(心電圖)、心肌灌注的放射性同位素成像、X射線(例如CT)心肌血管造影、MR心肌血管造影或灌注成像等。從而通過使用本發(fā)明的廉價、易行的檢測方法在初始篩選中(例如在“無癥狀健康”宿主的普查中)確認CVD的存在、可能性、或傾向性，在健康損害變得無法挽回之前，提高檢測或識別未被發(fā)現(xiàn)的CVD、或CVD傾向性，同時，限制使用了昂貴和耗時的不必要測試。所謂“CVD”表示任何中斷向軀體的生命維持區(qū)域例如大腦、心臟等的供氧的心臟、動脈、或靜脈的病況。CVD的實例為動脈硬化(arteriosclerosis)、急性心肌梗塞 (acute myocardial infarction)、心絞痛(angina pectoris)、缺血性心臟病(ischemic heart disease)、腦血管疾病(cerebrovascular disease)、中風(stroke)、蛛網(wǎng)膜下出血(subarachnoid haemorrhage)、大腦內(nèi)出血(intra-cerebral haemorrhage)、腦梗死(cerebral infarction)、充血性心力衰竭(congestive heart failure)、心絞痛(angina)、心力衰竭(heart attack)、心臟停搏(cardiac arrest)與心律不齊 (arrhythmia)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是基于如下令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，S卩，發(fā)現(xiàn)蛋白鈣衛(wèi)蛋白是一種在CVD癥狀發(fā)作之前(即無癥狀宿主)對于CVD可能性或CVD傾向有用的“標記子”或者“指示子”。特別地，已經(jīng)驚奇地發(fā)現(xiàn)在各種體液中異常高的鈣衛(wèi)蛋白水平，在對該宿主或第三方(例如內(nèi)科醫(yī)師)明顯CVD癥狀的發(fā)作之前，指示著CVD的易感性。因為該避免引起疑問，術(shù)語鈣衛(wèi)蛋白是“LI蛋白”、“MRP 8/14”、“囊性纖維化(關(guān)聯(lián))抗原(CFA) ”和“鈣粒蛋白”的同義表達。鈣衛(wèi)蛋白同時存在二聚或三聚形式。作為二聚物，鈣衛(wèi)蛋白包含多肽鏈S100A8與 S100A9。作為三聚物，鈣衛(wèi)蛋白是具有兩個重鏈(14kD)與一個輕鏈(8kD)的非共價連接的 36kDa雜三聚蛋白。鈣衛(wèi)蛋白是一個鈣結(jié)合性蛋白，并且在與鈣結(jié)合時，鈣衛(wèi)蛋白可以耐熱并耐蛋白水解。這使得能夠使用大量的試驗方法和條件。鈣衛(wèi)蛋白的抗原表位圖譜顯示可以制造對配合和/或單一蛋白鏈具有專一性的抗體。已經(jīng)表明在鈣衛(wèi)蛋白配合物上存在至少四個單獨免疫原位點。一些抗體識別重鏈或者輕鏈，而另一些則同時識別兩者?？稍谌梭w各部分的細胞、組織和體液中發(fā)現(xiàn)鈣衛(wèi)蛋白，并且它主要是從嗜中性粒細胞與單核細胞衍生而來的。很可能所有人體都攜帶有鈣衛(wèi)蛋白，這是因為在超過5000個個體測試中，還沒有發(fā)現(xiàn)不攜帶鈣衛(wèi)蛋白的個體。在大鼠、小鼠、兔、羊、牛與豬身上也發(fā)現(xiàn)有鈣衛(wèi)蛋白。因此，它是一種含量豐富、普遍存在的分子。在體內(nèi)，鈣衛(wèi)蛋白涉及許多生物機能，這包括胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導、嗜中性粒細胞活化、 與細胞增殖、抗菌活性以及嗜中性粒細胞防御相關(guān)的胞內(nèi)酶的抑制。鈣衛(wèi)蛋白同時還是炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)蛋白，并且，在這一過程中還可以起到刺激產(chǎn)生免疫球蛋白、趨化因子活性以及嗜中性粒細胞固定因子的作用。雖然體液很可能總是包含鈣衛(wèi)蛋白，但已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在各種體液中的鈣衛(wèi)蛋白的濃度是會發(fā)生變化的，例如，在多種疾病狀況(例如炎癥性、傳染性與惡性疾病)中其濃度會增加。因此，可以使用如下方法作為診斷這種疾病的手段，測定正遭受這種疾病的病人(即對該宿主和/或第三方明顯的癥狀發(fā)作的個體)的體液中的鈣衛(wèi)蛋白的濃度，并與健康(即非患病)宿主的體液中的鈣衛(wèi)蛋白濃度進行比較。例如，盡管細菌感染和病毒感染的癥狀非常相似，并且僅從它們的癥狀進行診斷是非常困難的，病毒感染宿主的血漿/血清中鈣衛(wèi)蛋白的濃度上升I 2倍，而細菌感染宿主則上升I 18倍。因此，對于已經(jīng)發(fā)現(xiàn)感染癥狀的宿主，可以測量其體液中的鈣衛(wèi)蛋白的濃度、診斷其感染情況，并進相應(yīng)的治療。可使用I丐衛(wèi)蛋白診斷測試的其它疾病包括風濕性疾病(rheumatic diseases) (例如風濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis)、青年類風濕性關(guān)節(jié)炎(juvenile rheumatoid arthritis)、全身性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus))、斯耶格倫氏綜合癥(Sj0grens syndrome)、眼內(nèi)炎癥(intraocular inflammatory)、囊性纖維化(cystic fibrosis)、急性與慢性肺疾病(acute and chronic lung disease)、肺癌瘤(lung carcinoma)(鱗狀細胞)、肺癌(pulmonary cancers)、結(jié)腸直腸癌(colorectal cancer)、炎癥性腸病(inflammatory bowel disease)、胃癌(gastric cancer)、結(jié)腸直腸腺瘤或癌(colorectal ademona or cancer)、克隆氏病(Chrohn ' s disease)、潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis)、胃腸粘膜炎(gastrointestinal mucosal)、尿路結(jié)石(urinary stones)、酒精性肝臟病(alcoholic liver disease)、口腔粘膜炎性疾病 (oral inflammatory mucosal disease)、CNS 炎性疾病(CNS inflammatory disease) (例如多發(fā)性硬化(multiple sclerosis)與急性腦炎(acute encephalitis))、HIV 感染(HIV infection)、HIV 感染病人的繼發(fā) CNS 感染(secondary CNS infections in HIV infected patients)、尿路感染(urinary tract infections)、膀胱炎(cystitis)、腎盂腎炎(pyelonephritis)、內(nèi)源性后葡萄膜炎(endogenous posterior uveitis)、血液疾病(haematological conditions)(例如白血病(leukaemia))、發(fā)熱性疾病(febrile conditions)(感染性的與非感染性的)、急性心肌梗塞(acute myocardial infarction) 與分離輸血(apheresis)。還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在心臟直視手術(shù)期間鈣衛(wèi)蛋白的血漿濃度增加(Semb，A. G.等，Eur. J. Cardio-thorac Surg. (1991)5:363-367, Saatvedt, K.等，Scand. J. Thor. Cardiovasc. Surg. (1996) 30 :53-60, Moen, O.等，Perfusion (1994) 9 :109-117)。更具體地說，Saatvedt 等報道了在心肺分流手術(shù)開始之后鈣衛(wèi)蛋白濃度上升，并且在術(shù)后48小時達到最高值。已經(jīng)驚訝地發(fā)現(xiàn)可以通過測定從所述宿主取得的含鈣衛(wèi)蛋白樣品中的鈣衛(wèi)蛋白的濃度來檢測宿主的CVD可能性或CVD傾向。換言之，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)測定從宿主取得的含鈣衛(wèi)蛋白樣品中的鈣衛(wèi)蛋白的濃度可被用于在對宿主和第三方(例如內(nèi)科醫(yī)師)明顯可見的癥狀發(fā)作之前，預測該宿主是否或者多大可能罹患CVD。所謂“具有可能性”或“具有傾向性”是指對當前接受測試的無癥狀宿主在將來罹患CVD疾病的可能性或幾率。這可以采用反映將來(例如在隨后的I 2年中，至少在隨后的6個月中)的CVD的相對風險的指數(shù)、比例、百分數(shù)或類似的數(shù)字的形式。因此，從一個方面來看，本發(fā)明提供了一種檢測人或非人類動物宿主患有CVD可能性或傾向性的檢測方法，所述的方法包括測定取自所述宿主的含鈣衛(wèi)蛋白樣品，例如血液、血衆(zhòng)、血清、腦脊液(cerebrospinal fluid)、口腔液(oral fluid)、尿液、排泄物、滑液或膿液(synovial or empyema fluid)中的I丐衛(wèi)蛋白的濃度。所謂“檢測”是指測定鈣衛(wèi)蛋白濃度的定量或半定量值。這個值可以是測試樣品， 例如進行處理以除去細胞或其它的非測試樣品組分、或者濃縮或稀釋該樣品或者將該樣品轉(zhuǎn)移到一個單獨的介質(zhì)例如固體基質(zhì)中之后的濃度的值?；蛘?，該檢測可以簡單地是定性的，即只表明該鈣衛(wèi)蛋白是否高于或低于一個或多個預選的閾值，例如表示通過該測試檢測不會出現(xiàn)CVD可能性或CVD傾向的值。這些鈣衛(wèi)蛋白的閾值或其它參考值的精確值取決于樣品的性質(zhì)、宿主的年齡、體重、性別和種族， 并可以以常規(guī)方式通過測量未患有CVD和處于CVD的不同發(fā)展階段的相同宿主的相關(guān)體液的鈣衛(wèi)蛋白濃度來測定該值。根據(jù)本發(fā)明的方法指示“檢測的”或測定鈣衛(wèi)蛋白濃度的值可以是鈣衛(wèi)蛋白的絕對濃度，或者可以是反映鈣衛(wèi)蛋白濃度的指數(shù)、比例、百分比或類似數(shù)字?？杀挥糜诒景l(fā)明的檢測方法的人體樣品可以是任何包含鈣衛(wèi)蛋白的樣品，例如體液或組織樣品，或者懸浮液等。優(yōu)選樣品為體液，例如尿液、腦脊液、口腔液、滑液或膿液，或者更優(yōu)選血液或者血液衍生的樣品。在這種情況下(即，使用血液和血液衍生的樣品時)， 優(yōu)選用于分析的樣品不含細胞(例如血清或血漿)?；蛘?，可以使用排泄物。在用于本發(fā)明的檢測方法之前，可以預先對該樣品進行處理。因此，可以對樣品進行處理以除去任何細胞和/或任何非測定的樣品組分。還可以對樣品進行濃縮、稀釋處理， 或者將鈣衛(wèi)蛋白轉(zhuǎn)移到一個單獨的介質(zhì)上，例如固體基質(zhì)上。例如，可以通過加入緩沖液或者其它的水溶性介質(zhì)稀釋該樣品?；蛘?，可以直接使用該樣品，例如血漿或血清。例如可以在用于本發(fā)明的檢測方法之前任選地使用鈣或者鈣類似物(例如另一個堿土金屬的離子)處理該樣品。該鈣或鈣類似物可以是提供Ca2+離子的任何形式(例如 CaCl2)。如果使用鈣，優(yōu)選將足夠的鈣或鈣類似物加入到樣品中以飽和鈣衛(wèi)蛋白的結(jié)合部位。例如，可以加入10摩爾過量、或者更優(yōu)選5摩爾過量、或特別優(yōu)選3摩爾過量的I丐源。盡管鈣衛(wèi)蛋白的檢測是已知的并且可被用于本發(fā)明的方法，此前并沒有任何暗示說鈣衛(wèi)蛋白是CVD可能性或CVD傾向的標記子或指示子。換言之，先前并沒有任何這樣的暗示無癥狀宿主的鈣衛(wèi)蛋白濃度可被用作CVD的可能性或傾向性的標記子或指示子，并且，具體地并沒有這樣的暗示鈣衛(wèi)蛋白濃度可作為健康宿主(即無癥狀宿主)普查的檢測方法中的標記子或指示子使用。在本發(fā)明的檢測方法中可以使用任何已知的檢測鈣衛(wèi)蛋白的方法。因此，例如 US-A-4833074(Fagerhol等)所公開的分離鈣衛(wèi)蛋白以及隨后產(chǎn)生單特異性抗血清的方法可被用于制造用于任何常規(guī)方法的抗鈣衛(wèi)蛋白抗體。所產(chǎn)生的抗鈣衛(wèi)蛋白抗體可被用于例如酶連接免疫試驗和放射免疫試驗。對于I丐衛(wèi)蛋白還可以使用例如Nyco Card (Axis-Shield PoC,Oslo,挪威)免疫測定格式。該檢測使用一個固相、夾心形式，其中的測試裝置包括涂布有固定的抗鈣衛(wèi)蛋白抗體的膜。因此，將樣品(任選地被稀釋的)施加到該裝置上并且當該樣品流過該膜時，可以俘獲任何存在的鈣衛(wèi)蛋白。然后使用與鈣衛(wèi)蛋白抗體復合物結(jié)合的金抗體共軛處理固定在膜上的鈣衛(wèi)蛋白，并且通過對紅光吸光率所測定的(由于金珠產(chǎn)生的)色強度與鈣衛(wèi)蛋白的量成正比。因此，可以從常規(guī)方式制訂的標準曲線計算得到鈣衛(wèi)蛋白的濃度?；蛘?，可以對例如排泄物(購自Eurospital )中的鈣衛(wèi)蛋白使用商業(yè)試驗( Calpresto )。該檢測使用針對酶連接的免疫吸收劑檢測系統(tǒng)中的鈣衛(wèi)蛋白的多克隆抗體。因此，存在于取自宿主的樣品中的鈣衛(wèi)蛋白與抗體結(jié)合，其中該抗體被吸收到塑料井的表面。然后加入酶的基質(zhì)，并且所產(chǎn)生的著色產(chǎn)品的強度與酶的量成正比，并因此與鈣衛(wèi)蛋白的量成正比。因此，可以從常規(guī)方式制訂的標準曲線計算得到鈣衛(wèi)蛋白的濃度。實際上，單克隆和多克隆抗鈣衛(wèi)蛋白抗體都可從商業(yè)途徑獲得。雞蛋和兔子多克隆是分別從例如 Norwegian Antibodies AS 和 Axis-Shield Diagnostics 得到的，而老鼠單克隆抗體可從丹麥的Dako A/S獲得。任何可以通過例如任何用于制造抗體的常規(guī)方法得到的抗鈣衛(wèi)蛋白抗體都可被用于本發(fā)明的方法。例如，可根據(jù)Harlow and Lane (1988), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, NY 所述的規(guī)程制造兔子抗鈣衛(wèi)蛋白以及單克隆抗體。
或者，可以將含鈣衛(wèi)蛋白溶液定期注射到小雞上，并然后收集雞蛋的蛋黃來制備抗鈣衛(wèi)蛋白抗體。然后可以按照常規(guī)方法分離雞蛋多克隆抗體并通過親和色譜法純化。優(yōu)選將本發(fā)明的方法用于健康(例如無CVD癥狀)宿主的普查。當檢測出患CVD 可能性或患CVD傾向性時，可對該宿主進行進一步的測試(例如使用專門針對CVD的更昂貴的技術(shù))以證實CVD的存在與否。通常，除了測樣品之外，在實施該檢測方法時，還將檢測含有已知鈣衛(wèi)蛋白含量的校準樣品。這種測試可被用于繪制標準曲線，而根據(jù)該曲線可以測定所研究的樣品的鈣衛(wèi)蛋白的含量。校準樣品的性質(zhì)以及對于在鈣衛(wèi)蛋白的檢測中所使用的轉(zhuǎn)化和修正因子的選擇可以變化，并取決于例如所實際使用的檢測技術(shù)中鈣衛(wèi)蛋白的檢測方式，并取決于該方法中影響檢測結(jié)果的其它方面，例如緩沖液組合物、檢測條件等。通常，使用鈣衛(wèi)蛋白含量為O 5000mg/L的校準樣品。鈣衛(wèi)蛋白濃度的值通常出現(xiàn)的參考范圍為O. I 10mg/L。通常，沒有或具有很低患CVD可能性或患CVD傾向性的人的血漿或血清中的鈣衛(wèi)蛋白濃度將為O. 01 O. 75mg/L。更具體地說，沒有或具有很低患CVD可能性或患CVD 傾向性的人的血漿或血清中的鈣衛(wèi)蛋白濃度將為O. 05 O. 70mg/L，更具體地為O. 10 O. 66mg/L，例如為O. 15 O. 45mg/L。例如，沒有或具有很低患CVD可能性或患CVD傾向性的女性血清或血漿中的鈣衛(wèi)蛋白濃度為O. 09 O. 53mg/L，例如約O. 31mg/L或O. 30mg/ L0沒有或具有很低患CVD可能性或患CVD傾向性的男性血清或血漿中的鈣衛(wèi)蛋白濃度為 O. 12 O. 66mg/L，例如 O. 30 O. 39mg/L，特別是 O. 31mg/L。血清或血漿中鈣衛(wèi)蛋白濃度大于O. 75mg/L的將通常是患CVD可能性或患CVD傾向性非常強烈的表現(xiàn)。因此，可用于預測患CVD可能性或患CVD傾向性的檢測的閾值為
O.32 O. 77mg/L,例如約O. 67mg/L,優(yōu)選約O. 70mg/L,特別是約O. 76mg/L。更優(yōu)選可用于預測患CVD可能性或患CVD傾向性的檢測的閾值為O. 30 O. 50mg/L，更優(yōu)選O. 32 O. 47mg/ L，例如約 O. 45mg/L。通常，沒有或具有很低患CVD可能性或患CVD傾向性的人的排泄物中的鈣衛(wèi)蛋白濃度將為O. 01 10mg/L。更具體地說，這種人的排泄物中的鈣衛(wèi)蛋白濃度將為O. 05 9. Omg/L,更具體地為 O. 50 8. Omg/L。排泄物中鈣衛(wèi)蛋白濃度大于10mg/L的將通常是患CVD可能性或患CVD傾向性非常強烈的表現(xiàn)。因此，可被用于預測患CVD可能性或患CVD傾向性的閾值通常為大約9mg/ L,優(yōu)選大約10. 5mg/L,特別是大約llmg/L。然而，優(yōu)選使用對于從相似類型(年齡、性別、體重、種族等)病人得到的相同體液樣品類型進行相同檢測技術(shù)所測定的鈣衛(wèi)蛋白來計算該閾值，其中所述相似類型病人為從健康階段到CVD早期階段到CVD嚴重階段。更優(yōu)選該閾值為在早期、健康階段對相同病人的測定值。因此，特別是在有風險的情況下，可以基于常規(guī)情況(例如每6個月或I年) 按照普查程序檢測其鈣衛(wèi)蛋白水平。在本發(fā)明優(yōu)選的檢測方法中，所述的方法還包括另外檢測從宿主取得的樣品中其它CVD的可能性標記子的濃度。適宜的標記子的實例可以是高半胱氨酸、活化接觸因子XII、膽固醇、膽固醇HDL比、纖維蛋白原、組織型纖維蛋白溶酶原活化因子、第V、VII和 VIII因子、脂蛋白(a)、馮維勒布蘭德氏因子(von Willebrand factor)抗原、纖溶酶_α 2抗血纖維蛋白酶復合物、凝血酶原片段1+2、凝血酶-抗凝血酶III復合物、纖維蛋白肽A、 纖維蛋白降解產(chǎn)物、D-二聚物、活化蛋白C-抵抗劑、第VIIc和VIIa因子、凝血酶、血清淀粉狀蛋白A、脈管粘著分子和冠狀動脈鈣。第二標記子優(yōu)選選自高半胱氨酸或C反應(yīng)蛋白。本發(fā)明的檢測方法更優(yōu)選進一步包含另外檢測取自該宿主的樣品中的C-反應(yīng)蛋白(CRP)的濃度。優(yōu)選在檢測所述鈣衛(wèi)蛋白的同時或隨后檢測CRP的濃度?？梢允褂萌魏螛藴实拿庖呒夹g(shù)(例如ELISA、RIA等)進行CRP的測量?；蛘呖梢酝ㄟ^ Nyco Card (購自 Axis-Shield PoC, Oslo,挪威)測定。除了 CRP濃度大于I. 75mg/L之外，血清或血漿中鈣衛(wèi)蛋白濃度大于O. 75mg/L通常將是患CVD可能性或患CVD傾向性的一個非常強的表現(xiàn)。優(yōu)選，上述濃度的出現(xiàn)與鈣衛(wèi)蛋白或CRP濃度單獨出現(xiàn)比較而言是更強的患CVD可能性或患CVD傾向性的表現(xiàn)。因此，鈣衛(wèi)蛋白和CRP的閾值通常分別為O. 32 O. 77mg/L和L 70mg/L，更優(yōu)選分別為大約O. 67mg/L和I. 75mg/L,更優(yōu)選分別為O. 70mg/L和2. 00mg/L,特別優(yōu)選分別為大約O. 76mg/L和2. 25mg/L，其中超過所述閾值時將進行檢測以高度預測患CVD可能性或患 CVD傾向性。更優(yōu)選的閾值分別為O. 30 O. 50mg/L和O. 75mg/L,更優(yōu)選O. 32 O. 47mg/ L和O. 75mg/L，例如分別為大約O. 45mg/L和O. 75mg/L，其中超過所述閾值時將進行檢測以預測患CVD可能性或患CVD傾向性。從另一個方面來看，本發(fā)明提供了一種用于本發(fā)明方法的檢測試劑盒，所述試劑盒包括試劑以及用于實施所述檢測法和用于解釋檢測結(jié)果的說明，并任選地，含鈣衛(wèi)蛋白參比樣品，以及任選地含檢測器。優(yōu)選所述的試劑盒進一步包含用于測定CRP濃度的試劑和說明。試劑盒中的說明可以是例如標簽、手冊或者指導傳單的形式，但是，它們也可以采用計算機程序或數(shù)據(jù)載體，例如電腦磁盤的形式。存在檢測器時，該檢測器通常是能夠檢測一個報告種類，如分光計、核輻射探測器、散射光檢測器等的檢測器。該試劑將是適合用于鈣衛(wèi)蛋白測定的試劑，例如在所引用的與由Eurospital 和 NycoCard(購自Axis Shield ASA, Oslo,挪威)得到的I丐衛(wèi)蛋白現(xiàn)有測試相關(guān)的文獻中所描述的適宜的試劑，。US-A-4833074中所述的試劑也是合適的。在本發(fā)明中用于檢測鈣衛(wèi)蛋白濃度的特別優(yōu)選的方法為基于顆粒的免疫測定。這是一項基于鈣衛(wèi)蛋白濃度的濁度法測定的靈敏技術(shù)。該檢測方法所具有的靈敏度能夠有利地使得在體液(例如血漿或血清)樣品中相對低的鈣衛(wèi)蛋白濃度進行高精度地測定。同時， 也可以準確地測定較高的鈣衛(wèi)蛋白濃度。濁度法測定還具有如下優(yōu)點，在檢測中的物理分離不需要固體表面，并且也不需要多個洗滌和/或分離步驟。因此，與現(xiàn)有技術(shù)(例如ELISA)相比，鈣衛(wèi)蛋白的均相濁度法測定可以快速、方便地進行，并且可以例如實現(xiàn)自動化。和涉及例如固體表面的非均相技術(shù)的自動化相比，基于濁度檢測法的自動化是相對容易的。并且，得到的自動化的均相處理通常更可靠，例如更不易中止。自動化的濁度檢測法還是快速的，允許樣品高的流通量，并且運行起來相對便宜。 通常可以使用商業(yè)可得機器人例如從Roche Diagnostics購得的Cobas Mira或Hitachi 711來進行該檢測方法。當對具有CVD可能性或傾向性的個體進行例行測試時，這種自動化的檢測是特別有吸引力的。對于鈣衛(wèi)蛋白濃度的濁度法測定，包含鈣衛(wèi)蛋白的樣品通常為體液，例如尿液、腦脊液、口腔液、滑液或膿液，或更優(yōu)選血液或血液衍生的樣品。在這時，用于分析的樣品通常將優(yōu)選為無細胞的(例如血清或血漿)。因此，可以對樣品進行處理以除去任何細胞和/或任何非檢測的樣品組分?？梢詫悠愤M行濃縮或稀釋處理，或者將鈣衛(wèi)蛋白轉(zhuǎn)移到單獨的介質(zhì)，例如固體基質(zhì)中。例如， 可以通過加入水、緩沖液或其它的水溶性介質(zhì)來稀釋樣品?；蛘?，可以直接使用樣品，具體是血清或血漿樣品。任選地，可以在用于該檢測方法之前使用鈣或鈣類似物處理樣品。鈣或鈣類似物可以是能夠提供Ca2+離子的任何形式(例如CaCl2)。如果使用鈣，優(yōu)選將足夠量的鈣或鈣類似物加入到樣品中以飽和鈣衛(wèi)蛋白的鈣結(jié)合部位。例如，可以加入10摩爾過量、更優(yōu)選 5摩爾過量、或特別優(yōu)選3摩爾過量的I丐源。鈣衛(wèi)蛋白濃度的濁度法測定的不透明度通常是，通過將含鈣衛(wèi)蛋白樣品或其等分部分與抗鈣衛(wèi)蛋白抗體、抗體片段或抗鈣衛(wèi)蛋白抗體的混合物(例如單克隆抗體的混合物)接觸而產(chǎn)生?？梢允褂觅徸訬orwegian Antibodies AS的卵多克隆抗人I丐衛(wèi)蛋白抗體產(chǎn)生不透明度。任何可以通過例如任何用于制造抗體的常規(guī)方法得到的抗鈣衛(wèi)蛋白抗體都可被用于本發(fā)明的方法。用于鈣衛(wèi)蛋白濃度的濁度法測定的抗體或抗體片段優(yōu)選與其它的可能存在于洗脫物中的血蛋白不發(fā)生或幾乎不發(fā)生交叉反應(yīng)。因為乳濁是由于多重鈣衛(wèi)蛋白結(jié)合產(chǎn)生乳池中心的鉤形效應(yīng)(hook effect)產(chǎn)生的,所使用的抗體或抗體片段的數(shù)量當然應(yīng)相對于含鈣衛(wèi)蛋白標準樣品進行優(yōu)化的。如上所述，鈣衛(wèi)蛋白具有多個抗體結(jié)合部位，并且特別適合用于在這種檢測中進行檢測。在一個優(yōu)選的實施方案中，可以通過直接或間接地結(jié)合或偶合到任何已知的通常用于固定的固體載體或基質(zhì)上來固定抗鈣衛(wèi)蛋白抗體、抗體片段。優(yōu)選該固體載體或基質(zhì)采用顆粒，優(yōu)選納米顆粒的形式。方便地，該固體載體可以是由玻璃、二氧化硅、膠乳、金屬 (如金)或聚合材料(例如聚乙烯)制成。優(yōu)選載體是由聚合材料例如聚乙烯制成?？梢酝ㄟ^任何常規(guī)方法來實現(xiàn)抗鈣衛(wèi)蛋白抗體或抗體片段的固定和結(jié)合。例如， 可以通過在緩沖液中攪拌(例如在室溫下攪拌24小時)并然后結(jié)合使用生物素標記的抗鈣衛(wèi)蛋白抗體(按照現(xiàn)有技術(shù)的常規(guī)方法制備的)，將抗生物素蛋白固定到氯甲基活化的聚苯乙烯納米顆粒(購自美國Interfacial Dynamic公司)上。因此,例如,將用于測試 CVD可能性或傾向性的取自該宿主的血漿加入到分光光度計石英池中的涂布有抗生物素蛋白的納米顆粒的溶液中，隨后加入生物素標記的抗鈣衛(wèi)蛋白抗體。然后采用濁度計讀數(shù)?；蛘?，可以在加入血漿或血清之前加入生物素標記抗體。換句話說，盡管無論使用何種用于濁度檢測的儀器通常都是使用相同的試劑，但是不同試劑的精確的加入順序是可以改變的。通常，所使用的順序應(yīng)當與所使用的分光光度計(例如島津UV-160分光光度計)所附的說明一致。得到濁度計讀數(shù)(即，定期測量適宜的波長下的吸光率)并測定相對于參比樣品的吸光率。任選地，可以使用多波長儀器以得到濁度計讀數(shù)并可以提供更精確的結(jié)果。用于獲取池度計讀數(shù)的適宜的儀器包括Cobas Mira、Roche Integra和Merck’s Turbiquant0
在另一種可供選擇的試驗裝置中，可以將抗鈣衛(wèi)蛋白抗體或抗體片段直接固定在氯甲基活化的納米顆粒(購自美國Interfacial Dynamic公司)上。例如,可以將抗I丐衛(wèi)蛋白抗體(例如購自Norwegian Antibodies AS的卵多克隆抗體)在緩沖液(IOmM硼酸鹽, 15mM氯化鈉、pH值9. O)中與上述活化顆?；旌喜嚢?例如在室溫下攪拌24小時)，以得到涂布有抗鈣衛(wèi)蛋白抗體的納米顆粒。這種納米顆?？梢酝ㄟ^將其加入到取自測試CVD 可能性或傾向性的宿主的溶于緩沖液的血清或血漿樣品中，并以運動模式獲取濁度計讀數(shù)用于鈣衛(wèi)蛋白濃度的濁度測試。或者，可以將血漿或血清加到抗鈣衛(wèi)蛋白抗體涂布的納米顆粒上。換句話說，盡管無論使用何種用于濁度檢測的儀器通常都是使用相同的試劑，但是不同試劑的精確的加入順序是可以改變的。通常，所使用的順序應(yīng)當與所使用的分光光度計(例如島津UV-160分光光度計)所附的說明一致。適合按照本發(fā)明的檢測方法獲得濁度計讀數(shù)的自動化機器人的實例包括Roche Diagnostics 制造的 Cobas Mira 和和 Hitachi 711。抗體或抗體片段可以結(jié)合的顆粒通常為球狀。檢測中所使用的顆粒的大小可以影響鈣衛(wèi)蛋白濃度測量的精度。盡管更大的顆粒允許檢測更低的鈣衛(wèi)蛋白濃度，但是它們降低了的表面積意味著它們的結(jié)合量也較低。例如，直徑擴大一倍，單位質(zhì)量的顆粒的結(jié)合量減半。此外，粒徑的增加將導致在這種檢測所通常使用的波長下(例如330 600nm)的背景光吸光率以及光懸浮(light suspension)的增加。因此，盡管更大的顆粒提高了檢測的靈敏度，但這也可能伴隨一些精確度的損失，并且具體是增加了得到的假陰性結(jié)果的數(shù)目。這是在含有較高鈣衛(wèi)蛋白濃度的樣品(即，取自那些具有較高CVD可能性或傾向性的個體的樣品)中特別容易發(fā)生的情形，其中該納米顆粒結(jié)合的結(jié)合部位可以在并非所有的鈣衛(wèi)蛋白被結(jié)合的條件下變得飽和。這些與改變粒徑相關(guān)的相反作用(例如增加粒徑提高了靈敏度但是降低了精確度)代表了在發(fā)展用于檢測存在于體液中鈣衛(wèi)蛋白的含量范圍的靈敏檢測法過程中需要克服的重要問題。在本發(fā)明的檢測方法中還優(yōu)選所使用的顆粒能夠精確測定各種范圍內(nèi)的濃度。這可能表示對否定的結(jié)果(即，低于閾值的濃度)以及肯定的結(jié)果都具有很高的置信度。特別優(yōu)選在本發(fā)明的檢測方法中可以測量鈣衛(wèi)蛋白濃度為O. 5 50mg/L(例如I 40mg/L) 的樣品?？贵w或抗體片段可以結(jié)合的顆粒通常為粒徑為I 150nm，例如10 90nm或15 60nm，例如44nm的球狀顆粒。在特別優(yōu)選的本發(fā)明的檢測方法中，抗體或抗體片段所結(jié)合的顆粒的粒徑為55 104nm,更優(yōu)選65 IlOnm,例如70 90nm。或者，可以一旦抗體或抗體片段結(jié)合到其表面就測定顆粒的直徑。在這種情況下， 涂布有抗體或抗體片段的顆粒的直徑優(yōu)選為65 140nm，更優(yōu)選為75 120nm，并更優(yōu)選為80 lOOnm。當所測試的樣品為血漿時，特別優(yōu)選這些大小的涂布顆粒。顆粒無論是“裸露的”還是“涂布的”狀態(tài)，都優(yōu)選具有的直徑不會導致顆粒本身吸收用于分光光度進行測定的光的波長。因此，涂布納米顆粒的懸浮液大致(例如基本上) 為透明的，直至由鈣衛(wèi)蛋白誘導的聚集體形成出現(xiàn)以導致形成的聚集體具有更大直徑。這種聚集體能夠吸收分光光度計所使用的光的波長。此外，優(yōu)選顆?；旧洗笮∠嗤?，并且，更具體地說全部具有相同直徑。優(yōu)選使用單分散金屬(例如金)或聚合物顆粒。單分散聚合物顆粒購自Dynal Biotech AS, Oslo, 挪威。雖然不限于任何理論，但可能是應(yīng)用固定的抗體或抗體片段通過增加任何由鈣衛(wèi)蛋白衍生得到的不透明位點的大小而增加了檢測的靈敏度，并因此增加了從中散射的量。 通過使用基本上具有相同大小的固體載體或基質(zhì)(例如納米顆粒)，可以進一步提高濁度檢測法檢測的靈敏度。在常規(guī)的濁度檢測法中，通常優(yōu)選向洗脫物中加入聚合乳濁化增強劑，例如聚乙二醇。在進行濁度測定之前，可以將流分、抗體或抗體片段，優(yōu)選與納米顆粒結(jié)合，以及任選地增強劑在室溫下孵化較短的時間，例如5分鐘 I小時，優(yōu)選大約10分鐘。任選地， 在使用濁度法技術(shù)測定鈣衛(wèi)蛋白的濃度的過程中，可以使用運動讀數(shù)模式。在乳濁測定中所使用的光應(yīng)當具有合適的波長，例如300 600nm。在這一點上， 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用300 450nm的過濾器,優(yōu)選340nm或405nm的過濾具有特別好的效果。使用560nm過濾器也可以具有特別好的結(jié)果。通常，除了測樣品之外，在實施檢測方法時，還將檢測含有已知鈣衛(wèi)蛋白含量的校準樣品。這種測試可被用于繪制標準曲線，而根據(jù)該曲線可以測定所測試的樣品的鈣衛(wèi)蛋白的含量。優(yōu)選使用鈣衛(wèi)蛋白的含量至多為5000mg/L(例如1500、1000、750、250、100)或者至多為100mg/L(例如75、50、25、5、l.(^P0.5mg/L)的鈣衛(wèi)蛋白樣品。更優(yōu)選鈣衛(wèi)蛋白樣品的鈣衛(wèi)蛋白含量至多為I Omg/L (例如10、8、6、4、2mg/L)，更優(yōu)選至多5mg/L (5、4. 5、4、
3.5、3、2· 5、2、1· 5、1、0· 5mg/L)。上述用于檢測鈣衛(wèi)蛋白的濁度檢測法令人吃驚地可靠、快捷、廉價、易行和易于自動化。這與當前可用的相對復雜、且不能直接被診斷實驗室所通常使用的自動化多任務(wù)診斷機器進行應(yīng)用的檢測方法相比形成了鮮明的對照。當涉及許多混合、添加和/或稀釋步驟時，自動化是特別需要的，因為這可以實現(xiàn)更高程度的精確度。也可以使用機器人以得到更高水平的可靠性和/或重現(xiàn)性。自動化還提聞了處理量。然而現(xiàn)有的可以提供合理的精確度的檢測方法(例如ELISA)難以自動化。這至少是部分因為它們通常涉及多個洗滌和分離步驟(例如附著到固體表面)，并且非均相過程的自動化通常是困難的。此外，這些方法通常涉及相對大量的步驟，這又增加了任何自動化過程的復雜性。其它的測定鈣衛(wèi)蛋白的常規(guī)方法(例如濁度法)提供了較高的精確度但是需要專門的設(shè)備實施測量。而專門的設(shè)備通常不易被結(jié)合到自動化過程中。實際上，一直需要一種用于診斷技術(shù)的廉價、可靠、快捷和易行的鈣衛(wèi)蛋白檢測方法。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了一種用于測定含鈣衛(wèi)蛋白體液中的鈣衛(wèi)蛋白的檢測方法，所述的方法包括(a)獲得所述體液的、或者來自所述體液的含鈣衛(wèi)蛋白的液體樣品；(b)將所述體液的所述樣品與任選地與納米顆粒結(jié)合的、抗鈣衛(wèi)蛋白抗體或抗體片段接觸，以結(jié)合所述的鈣衛(wèi)蛋白；(C)任選地，加入一個不透明度增強劑；和(d)通過濁度測定法測定鈣衛(wèi)蛋白含量。這種檢測可被用于各種疾病狀況的診斷，所述疾病狀況的特征在于不正常水平 (例如高水平)的鈣衛(wèi)蛋白。這類疾病狀況包括風濕性疾病(例如風濕性關(guān)節(jié)炎、青年類風濕性關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡)、斯耶格倫氏綜合癥、眼內(nèi)炎癥、囊性纖維化、急性與慢性肺疾病、肺癌瘤(鱗狀細胞)、肺癌、結(jié)腸直腸癌、炎癥性腸病、胃癌、結(jié)腸直腸腺瘤或癌、克隆氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、胃腸粘膜炎、尿路結(jié)石、酒精性肝臟病、口腔粘膜炎性疾病、CNS炎性疾病(例如多發(fā)性硬化與急性腦炎)、HIV感染、HIV感染病人的繼發(fā)CNS感染、尿路感染、 膀胱炎、腎盂腎炎、內(nèi)源性后葡萄膜炎、血液疾病(例如白血病)、發(fā)熱性疾病(感染性的與非感染性的)、急性心肌梗塞與分離輸血。因此，從另一個方面來看，本發(fā)明提供了一種診斷上述任何疾病的方法，其包括前文所述的方法，并隨后將所述的鈣衛(wèi)蛋白含量與預定的閾值比較。表示任何特定疾病狀態(tài)的閾值可通過任何本領(lǐng)域已知的方法加以測定。優(yōu)選該方法用于CVD的診斷。用于濁度檢測法中人體樣品可以是任何含鈣衛(wèi)蛋白的樣品，例如體液或者組織樣品，或者懸浮液等。優(yōu)選該樣品為體液，例如尿液、腦脊液、口腔液、滑液或膿液，或更優(yōu)選血液或血液衍生的樣品。在這種情況下(即，使用血液或者血液衍生的樣品)，用于分析的樣品優(yōu)選為無細胞的(例如血清或血漿)?；蛘呖梢允桥判刮?。人體樣品優(yōu)選選自對所診斷的疾病提供最大靈敏度指示的。因此，血液、血漿或血清可被同時用于診斷感染(例如HIV、細菌感染)、風濕性疾病、白血病等，在診斷與胃腸道相關(guān)的疾病(例如克隆氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)腸直腸癌)的過程中可以測試排泄物。從另一個方面看，本發(fā)明提供一種用于本發(fā)明的診斷性濁度檢測法的試劑盒，所述試劑盒包含優(yōu)選一種已知濃度的鈣衛(wèi)蛋白溶液，并更優(yōu)選具有鈣衛(wèi)蛋白濃度范圍的一組這類溶液；一個或多個抗鈣衛(wèi)蛋白抗體或抗體片段，任選地固定在固體載體(例如納米顆粒)上；優(yōu)選透光容器；優(yōu)選乳濁化增強劑；和優(yōu)選檢測器。如果需要，可以安裝一個自動化裝置以接收含鈣衛(wèi)蛋白體液樣品；以將該抗鈣衛(wèi)蛋白抗體或抗體片段施加到，任選地固定到載體(例如納米顆粒)上；以任選地施加乳濁化增強劑；并以估計鈣衛(wèi)蛋白含量。相信這樣的裝置也落入了本發(fā)明的范圍內(nèi)。現(xiàn)在，參照下面非限制性的實施例和附圖對本發(fā)明進行說明，其中


圖I為在200個受試宿主中的鈣衛(wèi)蛋白的分布曲線。圖I的概括統(tǒng)計如下Anderson-Darling 正態(tài)檢驗

A2:8.160P-值0.000平均值0.403標準偏差0.238方差0.057偏度1.679峰度3.302N199最小值0.070第一四分值0.240中值0.340第三四分值0.500最大值1.370Mu的95 %置信區(qū)間0.3700.436Sigma的95 %置信區(qū)間0.2170.264中值的95%置信區(qū)間0.3100.370
圖2為200個測試宿主中的鈣分數(shù)的分布曲線。表2的概括統(tǒng)計如下 Anderson-Darling 正態(tài)檢驗A2:25.037
P-值0.000
平均值217.060
標準偏差399.000
方差159201
偏度3.462
峰度15.341
N200
最小值0.00
第一四分值0.00
中值78.00
第三四分值259.25
最大值2794.00
Mu的95 %置信區(qū)間161.42
272.70
Sigma的95 %置信區(qū)間363.35
442.46
中值的95%置信區(qū)間0.00
117.33圖3為200個測試宿主中的hsCRP的分布曲線。表3的概括統(tǒng)計如下Anderson-Darling 正態(tài)檢驗
A2:21.221
P-值0.000
平均值2.331
標準偏差2.970
方差8.819
偏度2.243
峰度5.103
N197
最小值0.150
第一四分值0.540
中值1.150
第三四分值2.580
最大值16.30
Mu的95%置信區(qū)間1.913
2.748
Sigma的95 %置信區(qū)間2.703
3.296
中值的95%置信區(qū)間0.933
1.375圖4為200個測試宿主中的高半胱氨酸的分布曲線。表4的概括統(tǒng)計如下Anderson-Darling 正態(tài)檢驗
A2:2.535
P-值0.000
平均值8.391
標準偏差1.966
偏差3.867
偏度0.875
峰度0.730
N199
最小值5.100
第一四分值7.100
中值8.100
第三四分值9.600最大值
Mu的95 %置信區(qū)間
8.117
15.300
8.666
Sigma的95 %置信區(qū)間
1.790
2.181
中值的95%置信區(qū)間
7.620
8.400圖5為鈣陽性結(jié)果和鈣陰性結(jié)果之間的鈣衛(wèi)蛋白的分布的點圖；和圖6和7分別為全部200個測試宿主和男性測試宿主的鈣衛(wèi)蛋白和hsCRP的ROC 曲線。
具體實施例方式實施例I :抗鈣衛(wèi)蛋白抗體(a)鈣衛(wèi)蛋白的分離可以按照如US-A-4，833，074 (Fagerhol)的實施例I和2所述的方法分離鈣衛(wèi)蛋白?；蛘呖梢詮娜祟愌磷攸S層純化鈣衛(wèi)蛋白。將EDTA(50mM，pH 7)加入的細胞中制得2. 5mM EDTA的細胞懸浮液。然后將細胞在160mM氯化銨/IOmM碳酸氫鈉中洗3分鐘并在4°C溫度下離心(160xg)10分鐘。在EDTA(2.5mM)/NaCl(150mM)中洗所得的片狀沉淀物 (pellet)，并在4°C溫度下再離心分離(55xg)10分鐘。然后將該片狀沉淀物懸浮于pH 7.4 的O. 625mM EDTA/18. 75mM巴比妥中，并在_70°C溫度下冷凍至少24小時。隨后解凍，將所得的材料離心分離(在3700xg)30分鐘，然后除去上清液并過濾(使用Millipore制造的O. 45 μ m過濾器)，然后將其裝填在DEAE ( 二乙氨基乙基) 瓊脂糖凝膠離子交換柱(Pharmacia制造)上，所述柱為由結(jié)合緩沖液(例如O. 63mM EDTA/18. 75mM巴比妥，pH 7.4)預先準備的。任何非結(jié)合性材料流過柱子并被洗脫出來。 一旦全部的非結(jié)合性材料從柱中洗脫出來，就使用含鈣洗脫緩沖液(例如75mM巴比妥緩沖液/IOmM CaCl2)洗脫純鈣衛(wèi)蛋白。每個血沉棕黃層中得到大約25mg鈣衛(wèi)蛋白。(b)抗鈣衛(wèi)蛋白抗體的制備可以按照如US-A-4, 833，074(Fagerhol)實施例3所述的方法制備抗I丐衛(wèi)蛋白抗體。作為選擇可以制備雞蛋多克隆。每14天4次(或者2個月)，然后每月I次向小雞注射包含鈣衛(wèi)蛋白(O. 5mg/ml)和弗氏佐劑的溶液。12星期之后，可以收集該鈣衛(wèi)蛋白注入的小雞的雞蛋，并除去它們的蛋黃(不含膜)。在HCl (5mM)中稀釋后，離心分離蛋黃并收集上清液。然后過濾上清液并使用飽和硫酸銨處理使得最終的濃度達到3. SM。離心分離該混合物并收集所得到的沉淀，并將其溶于緩沖液中(O. IlM乙酸鈉、O. 15M NaCUpH 7.4)。 最后使用孔徑為10，OOOkD的薄膜透析所得到的溶液并然后使用親和色譜法精制。通常用作親和色譜的柱子包括琥珀酰亞胺活化瓊脂糖凝膠的活化基質(zhì)(Amersham-Pharmacia制造的HiTrap NHS activated),該基質(zhì)適合用于I丐衛(wèi)蛋白的固定。 更具體地說，該活化的樹脂在PH為7 8的條件下與鈣衛(wèi)蛋白中的游離胺自發(fā)地反應(yīng)。對于色譜分離，在施加到色譜柱中之前，通常將透析溶液在PBS中稀釋至大約3mg/ml的濃度。 隨后使用溶于冰凍PBS的6M脲或O. IM的檸檬酸鈉溶液pH 3. O洗脫該抗鈣衛(wèi)蛋白抗體。優(yōu)選使用O. IM的檸檬酸鈉溶液。洗脫后，立即稀釋該含抗鈣衛(wèi)蛋白抗體的餾分并在PBS中透析。實施例2 丐衛(wèi)蛋白的濁度檢測(a)抗生物素蛋白涂布的納米顆粒的制備使用孔徑為10，OOOkD的薄膜對購自美國Interfacial Dynamic公司的600 μ m的
4.2% w/v氯甲基活化的納米顆粒(直徑44nm)相對于水進行透析。然后加入pH 9. O的 O. 5ml的硼酸鹽(IOmM)和氯化鈉(15mM)溶液并混合。然后加入IOmg抗生物素蛋白(購自 Pierce Chemical Company)并在室溫下攪拌24小時,所述抗生物素蛋白溶于pH 9的0.5ml 的IOmM硼酸鹽和15mMNaCl溶液。然后加入40 μ I的甘氨酸溶液(2Μ，ρΗ 9. O)并在室溫下進一步攪拌該混合物4小時。然后將該顆粒稀釋到IOOOml的體積，并首先在500ml的pH 9. O的IOmM的硼酸鹽和15mM氯化鈉溶液中，然后在pH 7. 4的25mM的Tris、150mM氯化鈉和O. 01% Tween 20 溶液(購自美國Sigma公司)中，使用Pellicon XL過濾器(截斷(cut off) 300, 000)和 labscale TTF系統(tǒng)(Millipore制造)按照儀器供應(yīng)商的說明進行透析過濾。最后通過離心分離和在25mM TRIS、150mM氯化鈉和O. 01% Tween 20溶液中再懸浮該顆粒得到所需要的濃度的抗生物素蛋白涂布的納米顆粒?？梢酝ㄟ^緩慢離心將在此制備過程中所形成的任何聚集體除去。(b)使用抗生物素蛋白涂布的納米顆粒的鈣衛(wèi)蛋白的檢測具有濃度為每毫升大約O. 30mg上述抗生物素蛋白涂層納米顆粒的懸浮液是通過上述制劑在 pH 7.4的25禮 TRIS、150mM NaCl.O. 1% Tween 20 和 2% PEG 6000 溶液 (購自Sigma公司)中的離心分離和再懸浮來制備的。在記錄式分光光度計(例如島津 UV-160)的記錄石英透明容器中，將500 μ I的該顆粒懸浮液與取自測試CVD傾向性的宿主的血漿樣品(大約20 μ I)混合。記錄340nm的單色光的吸收，并且在60秒之后，將75 μ g 經(jīng)O. 15nmol生物素(例如購自挪威Norwegian Antibodies AS的生物素標記親和精制卵多克隆)標記的、且在 50 μ I 的 pH 7. 4 的 25mM TRIS、150mM NaCl 和 O. 1% Tween 20 溶液中稀釋的抗鈣衛(wèi)蛋白抗體加入到石英容器中并混合。然后使用包含PH7. 4的25mM TRIS、 150mM NaCl和O. 1% Tween 20參比池立即記錄340nm單色光的吸收，并每隔一定間隔 (例如每2分鐘)再次測定，直至經(jīng)過大約15分鐘。按照運動模式的標準濁度計讀數(shù)或“終點”讀數(shù)計算在每個時間點上的吸收的增加。也就是說，在每個時間點上的吸光率的增加是相對于在加入抗體涂布的納米顆粒之前和/或在記錄的末尾的讀數(shù)來計算的。鈣衛(wèi)蛋白曲線是通過使用具有已知鈣衛(wèi)蛋白濃度的標準品進行相同的步驟得到的。然后可以從鈣衛(wèi)蛋白曲線計算樣品中的鈣衛(wèi)蛋白濃度。實施例3 :作為選擇的鈣衛(wèi)蛋白的濁度檢測(a)抗鈣衛(wèi)蛋白抗體涂層納米顆粒的制備使用孔徑為10, OOOkD的薄膜對購自美國Interfacial Dynamic公司的Iml的4.2% w/v氯甲基活化的納米顆粒(直徑44nm)相對于水進行透析。然后加入O. 5ml的 pH 9. O的IOmM硼酸鹽和15mM氯化鈉溶液。將27mg精制的抗鈣衛(wèi)蛋白抗體(例如購自 Norwegian Antibodies AS的親和精制卵多克隆抗體)相對于pH 9.0的IOmM硼酸鹽和 15mM氯化鈉溶液進行透析。接著將納米顆粒加入到該精制的抗鈣衛(wèi)蛋白抗體中，并在室溫下攪拌該混合物24 小時。然后加入40 μ I的甘氨酸溶液(在pH 9. O下為2M)并在室溫下進一步攪拌該混合物4小時。然后將該顆粒稀釋到IOOOml的總體積，并在IOOOml加入了 O. 01 % Tween 20 和3mg/ml卵白蛋白的pH 9. O的IOmM硼酸鹽和15mM氯化鈉溶液中，使用Pellicon XL過濾器(截止300，000)和labscale TTF系統(tǒng)(Millipore制造)按照儀器供應(yīng)商的說明進行透析過濾。最后通過溶液中顆粒的離心分離和再懸浮得到所需要濃度的抗鈣衛(wèi)蛋白抗體涂布的納米顆粒?？梢酝ㄟ^緩慢離心將在此制備過程中所形成的任何聚集體除去。(b)使用抗鈣衛(wèi)蛋白抗體涂布的納米顆粒的鈣衛(wèi)蛋白的檢測制備懸浮液，其包含溶于50μ I的pH 9. O的IOmM硼酸鹽、15mM NaCUO. I % Tween 20、3g/l卵白蛋白溶液中400 μ g上述抗體涂布的納米顆粒。同時，將溶于500μ I檢驗緩沖液(從Sigma公司購得的pH 7. 4的25mMTRIS、150mM NaCl,O. 1% Tween 20和2% PEG 6000)的20 μ I取自接受CVD可能性測試的宿主的血漿放入記錄式分光光度計(例如島津UV-160)的記錄石英池中，并測量對340nm單色光的吸光率。60秒之后，加入包含400 μ g抗體涂布的納米顆粒的上述懸浮液，并在池中混合。 在加入抗體涂布的納米顆粒之后立即記錄吸光率，并每隔一定間隔(例如每2分鐘)再次記錄直至經(jīng)過大約15分鐘。在每個時間點上的吸光率的增加是相對于在加入抗體涂布的納米顆粒之前和/或在記錄的末尾的讀數(shù)來計算的。換句話說，得到在運動模式中的濁度計讀數(shù)和“終點”讀數(shù)。鈣衛(wèi)蛋白曲線也是通過使用具有已知鈣衛(wèi)蛋白濃度的標準品進行相同的步驟得到的。然后可以從該曲線計算樣品中的鈣衛(wèi)蛋白濃度。實施例4 :作為選擇的鈣衛(wèi)蛋白的濁度檢測法(a)抗生蛋白鏈菌素涂布的納米顆粒的制備使用孔徑為10，OOOkD的薄膜對購自美國Interfacial Dynamic公司的600 μ m的
4.2% w/v氯甲基活化的納米顆粒(直徑67nm)相對于水進行透析。將O. 5ml的pH 7. 4的磷酸鹽(IOmM)和氯化鈉(150mM)緩沖溶液，與溶于O. 5ml的pH 7. 4的IOmM磷酸和150mM NaCl緩沖溶液(購自Pierce Chemical Company)的IOmg抗生蛋白鏈菌素一起加入,并在室溫下攪拌該混合物24小時。然后加入40 μ I的甘氨酸溶液(2Μ，ρΗ 9. O)，并在室溫下進一步攪拌該混合物4小時。然后將該顆粒稀釋到IOOml的體積，并首先在500ml的pH 9. O的IOmM硼酸鹽和 15mM氯化鈉溶液中，然后在pH 7. 4的25mM的Tris、150mM氯化鈉和O. 01% Tween 20 溶液(購自美國Sigma公司)中，使用Pellicon XL過濾器(截止300，000)和labscale labscale TTF系統(tǒng)(Millipore制造)按照儀器供應(yīng)商的說明進行透析過濾。最后通過離心分離和在25mM TRIS、150mM氯化鈉和O. 01% Tween 20溶液中再懸浮該顆粒得到所需要的濃度的抗生物素蛋白涂布的納米顆粒?？梢酝ㄟ^緩慢離心將在此制備過程中所形成的任何聚集體除去。通過挪威Sinteff AS測得抗生蛋白鏈菌素涂布的納米顆粒的的平均粒徑為 82nm。(b)使用抗生蛋白鏈菌素涂布的納米顆粒的鈣衛(wèi)蛋白的檢測濃度為每毫升約O. 60mg上述抗生物素蛋白涂層納米顆粒的懸浮液是通過上述制劑在 pH 7.4 的 25mM TRIS、150mM NaCl.O. 1% Tween 20 和 I % PEG 6000 溶液(購自 Sigma公司)中的離心分離和再懸浮來制備的。將500 μ I該顆粒懸浮液與取自CVD傾向性的宿主的血漿樣品(大約5 μ I)在一個記錄式分光光度計(例如島津UV-160)的記錄石英池中混合。記錄560nm的單色光的吸收,并且在60秒之后,將75 μ g經(jīng)O. 15nmol生物素 (例如購自挪威Norwegian Antibodies AS的生物素標記親和精制卵多克隆)標記的,且在 50 μ I的pH 7. 4的25mM TRIS、150mM NaCl和O. 1% Tween 20溶液中稀釋的抗鈣衛(wèi)蛋白抗體加入到石英容器中并混合。然后使用包含PH 7.4的25mMTRIS、150mM NaCl和O. 1% Tween 20參比池立即記錄340nm單色光的吸收，并每隔一定間隔(例如每2分鐘)再次測定，直至經(jīng)過大約15分鐘。按照運動模式的標準濁度計讀數(shù)或“終點”讀數(shù)計算在每個時間點上的吸收的增加。也就是說，在每個時間點上的吸光率的增加是相對于在加入抗體涂布的納米顆粒之前和/或在記錄的末尾的讀數(shù)來計算的。鈣衛(wèi)蛋白曲線是通過使用具有已知鈣衛(wèi)蛋白濃度的標準品進行相同的步驟得到的。然后可以從該鈣衛(wèi)蛋白曲線計算樣品中的鈣衛(wèi)蛋白濃度。實施例5:(a)抗鈣衛(wèi)蛋白抗體涂布的納米顆粒的制備使用孔徑為10. OOOkD的薄膜對購自美國Interfacial Dynamic公司的Iml的
4.2% w/v氯甲基活化的納米顆粒(平均直徑67nm)相對于水進行透析，然后使用水稀釋至 10ml。將27mg精制的卵多克隆抗體抗體(例購自Norwegian Antibodies AS的親和精制的卵多克隆抗體)相對于IOmM硼酸鹽和15mM氯化鈉緩沖溶液進行透析，并最后在相同的 pH 9. O的IOmM硼酸鹽和15mM氯化鈉溶液中稀釋至6ml。在攪拌條件下，將該顆粒與抗體混合，并在室溫下持續(xù)攪拌24小時。然后加入 40 μ I的甘氨酸溶液(2Μ，pH 9. 0)，并在室溫下進一步攪拌該混合物4小時。然后將該顆粒在加入了 0. 01% Tween 20和3mg/ml卵白蛋白的IOmM硼酸鹽、 15mM氯化鈉緩沖液中稀釋到的IOOml的總體積，并相對于1000ml所述的加入了 0.01% Tween 20和3mg/ml卵白蛋白的硼酸鹽/氯化鈉緩沖液，使用Pellicon XL過濾器(截止300，000)和labscale TTF系統(tǒng)(Millipore制造)按照儀器供應(yīng)商的說明進行透析過濾，最后將顆粒濃縮至40 IOOml的體積。通過挪威Sinteff AS測得所得到的顆粒的平均直徑為81nm。(b)使用抗鈣衛(wèi)蛋白抗體涂布的納米顆粒的鈣衛(wèi)蛋白的檢測在pH 8.0的0.25禮 TRIS、0. 15M NaCl 和 0. 1% Tween 中，制備 0. 7mg/ml 的上述抗鈣衛(wèi)蛋白抗體涂布顆粒的懸浮液。在記錄式分光光度計(例如島津UV-160)的記錄石英池中將5 μ I的取自CVD宿主的血漿樣品溶于檢驗緩沖液(460 μ I的25mM TRIS、150mM NaCl、0. 1% Tween、I. 0%聚乙二醇6000、pH= 7· 4)，并測量560nm單色光的吸光率。60秒后，加入100 μ I包含0. 7mg/ml的抗體涂布的納米顆粒的懸浮液，并在池中混合。在加入抗體涂布的納米顆粒之前或加入之后立即記錄吸光率，并每隔一定間隔(例如每20秒)再次記錄，直至經(jīng)過大約15分鐘。 也就是說，在每個時間點上的吸光率的增加是相對于在加入抗體涂布的納米顆粒之前和/ 或在記錄的末尾的讀數(shù)來計算的。換句話說，得到在運動模式中的濁度計讀數(shù)和/或“終點”讀數(shù)。鈣衛(wèi)蛋白曲線液是通過使用具有已知鈣衛(wèi)蛋白濃度的標準品進行相同的步驟得到的。然后可從該曲線計算樣品中的鈣衛(wèi)蛋白濃度。實施例6:統(tǒng)計分析鈣衛(wèi)蛋白及其它用于檢測患CVD可能性或患CVD傾向性的標記子的比較已經(jīng)表明冠狀動脈鈣化與CVD的出現(xiàn)具有強烈的關(guān)聯(lián)，并且還已經(jīng)公開了用于預測CVD可能性(例如心肌梗塞或中風)有用的方法。冠狀動脈鈣化的程度是使用電子束計算機斷層分析(EBCT)定量測定的并且是通過鈣分數(shù)(CS)來表示的。一個高的鈣分數(shù)表示高水平的鈣化并且表示導致心血管疾病 (CVD)的高風險。在下面的研究中，對200個年齡在45歲或以上的宿主的CS (100個CS < 100的對照組和100個CS > 100的病例)進行了測試，同時還測試了他們的鈣衛(wèi)蛋白、CRP和高半胱氨酸血漿或血清水平。宿主為經(jīng)本人或醫(yī)師判斷為無癥狀的個體并且在此前2年內(nèi)(通常為6個月之內(nèi))進行過EBCT掃描以測量他們的血漿或者血清中的鈣衛(wèi)蛋白、CRP和高半胱氨酸濃度。方法鈣衛(wèi)蛋白通過Calpreste 測試(意大利Eurospital 發(fā)布)測定鈣衛(wèi)蛋白，并且使用標
準偏差、中值、最小值和最大值總結(jié)病人和對照組的數(shù)據(jù)。計算中值的95%置信區(qū)間。使用 Anderson-Darling計算進行正態(tài)測試。還通過使用相同的概括統(tǒng)計來通過性別概括鈣衛(wèi)蛋白。鈣分數(shù)(CS)鈣分數(shù)是通過電子束計算斷層分析(EBCT)掃描來測定的?？偨Y(jié)了病例和對照組的數(shù)據(jù)。高靈敏度的C-反應(yīng)蛋白(hsCRP)通過Dade Behring 的 “N 高靈敏度 CRP” 檢測法(Roberts 等，Clinical Chemistry, 2000,46 :4，第461-468頁)測定hsCRP。使用平均、標準偏差、中值、最小值和最大值總結(jié)病人和對照組的數(shù)據(jù)。高半胱氨酸(Hyc)通過AbbottIMx方法(Shipchandler,Μ· Τ·和Moore E. G. ,Clinical Chemistry, 1995,41 :7，第991-994頁)測量血漿高半胱氨酸(Hcy) 0使用平均、標準偏差、中值、最小值和最大值總結(jié)病人和對照組的數(shù)據(jù)。CS和鈣衛(wèi)蛋白、hsCRP、Hcy的比較⑴卡方值使用卡方值測試測量一對標記子之間的協(xié)方差。
(ii)優(yōu)勢率使用2X2縱橫列表(即卡方值桌子)的優(yōu)勢率為兩個共變測試的機率對兩個不一致測試的機率的比例。因此，優(yōu)勢率可被解釋為兩個測試之間的相關(guān)幅度的測量。分別計算CS對鈣衛(wèi)蛋白、hsCRP和Hcy的優(yōu)勢率。標記子的中值的比較(i) Mann-Whitney 測試這是用于測試如果兩個標記子的值顯著不同的無參數(shù)(數(shù)據(jù)不需要為正態(tài)分布) 測試。微型表將兩組數(shù)據(jù)中的數(shù)據(jù)整齊排列，并制訂I為最低、200為最高。然后軟件將兩組等級分相加比較，并報告“P”值，其中“P”值表示隨機抽樣將導致中值遠離試驗觀測值的幾率。鈣衛(wèi)蛋白、hsCRP和Hcy中值與被分成病例和對照組的CS進行比較，并且使用 Mann-Whitney測試法來測量顯著性。(ii)鈣衛(wèi)蛋白和鈣分數(shù)的ROC曲線可以使用宿主操作特性(ROC)曲線分析來衡量該測試區(qū)分患病病例與正常病例的能力。ROC曲線分析被用于鈣衛(wèi)蛋白hsCRP，并作為這兩個標記子的比較。使用11截止極限制得ROC曲線以計算靈敏度(Y軸)和I-特異性(X軸)。將對照組和病例組的數(shù)據(jù)混合在一起并從高到低進行排序。在總?cè)后w和在男性群體上進行分析。使用梯形規(guī)則計算ROC曲線下的面積。結(jié)果鈣衛(wèi)蛋白的概括統(tǒng)計圖I顯示了所測試的全部200個宿主的分布曲線下表I給出了對照組與病例組中的鈣衛(wèi)蛋白的概括統(tǒng)計。對照組中的中值鈣衛(wèi)蛋白濃度為O. 31mg/L，而在病例組中則為O. 38mg/L。在對照組中，男性的中值鈣衛(wèi)蛋白濃度為O. 31mg/L，而女性的則為O. 30mg/L。在病例組中男性的中值鈣衛(wèi)蛋白濃度為O. 39mg/L，而女性的則為O. 31mg/L。表I :鈣衛(wèi)蛋白的概括統(tǒng)計
權(quán)利要求
1.一種用于測定含鈣衛(wèi)蛋白體液中的鈣衛(wèi)蛋白的檢測方法，所述的方法包括如下步驟(a)獲得所述體液的、或者來自所述體液的含鈣衛(wèi)蛋白的液體樣品；(b)將所述體液的所述樣品與納米顆粒結(jié)合的抗鈣衛(wèi)蛋白抗體或抗體片段接觸，以便結(jié)合所述的鈣衛(wèi)蛋白；和(C)通過濁度測定法測定鈣衛(wèi)蛋白含量，其中，抗體或抗體片段涂布的納米顆粒的直徑為65 140nm。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述抗體或抗體片段涂布的納米顆粒的直徑為75 120nmo
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其中所述納米顆粒是單分散性的。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其中在步驟(b)和(c)中間加入不透明度的增強劑。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述的體液選自血液、血清、血漿、尿液、 腦脊液、口腔液、滑液或膿液。
6.如權(quán)利要求1-5任一項所述的方法，其以自動化檢測的形式進行實施。
7.納米顆粒結(jié)合的抗鈣衛(wèi)蛋白抗體或抗體片段在制備用于檢測方法的含鈣衛(wèi)蛋白組合物中的用途，所述檢測方法用于診斷選自下述的疾病風濕性疾病、斯耶格倫氏綜合癥、 眼內(nèi)炎癥、囊性纖維化、急性與慢性肺疾病、肺癌瘤、肺癌、結(jié)腸直腸癌、炎性腸病、胃癌、結(jié)腸直腸腺瘤或癌、克隆氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、胃腸粘膜炎、尿路結(jié)石、酒精性肝臟病、口腔粘膜炎性疾病、CNS炎性疾病、HIV感染、HIV感染病人的繼發(fā)CNS感染、尿路感染、膀胱炎、腎盂腎炎、內(nèi)源性后葡萄膜炎、血液疾病、感染性的發(fā)熱性疾病或非感染性的發(fā)熱性疾病、CVD、 急性心肌梗塞與分離輸血，其中，所述的鈣衛(wèi)蛋白在取自宿主的樣品中，并且所述方法包括用權(quán)利要求I的方法檢測鈣衛(wèi)蛋白在所述樣品中的濃度。
8.如權(quán)利要求7的用途，其中所述的疾病為CVD。
9.鈣衛(wèi)蛋白在制備用于檢測方法的含鈣衛(wèi)蛋白組合物中的用途，所述檢測方法用于診斷選自下述的疾病風濕性疾病、斯耶格倫氏綜合癥、眼內(nèi)炎癥、囊性纖維化、急性與慢性肺疾病、肺癌瘤、肺癌、結(jié)腸直腸癌、炎性腸病、胃癌、結(jié)腸直腸腺瘤或癌、克隆氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、胃腸粘膜炎、尿路結(jié)石、酒精性肝臟病、口腔粘膜炎性疾病、CNS炎性疾病、HIV感染、 HIV感染病人的繼發(fā)CNS感染、尿路感染、膀胱炎、腎盂腎炎、內(nèi)源性后葡萄膜炎、血液疾病、 感染性的發(fā)熱性疾病或非感染性的發(fā)熱性疾病、CVD、急性心肌梗塞與分離輸血，其中，所述的鈣衛(wèi)蛋白在取自宿主的樣品中，并且所述方法包括用權(quán)利要求I的方法檢測鈣衛(wèi)蛋白在所述樣品中的濃度。
10.如權(quán)利要求9的用途，其中所述的疾病為CVD。
11.納米顆粒結(jié)合的抗鈣衛(wèi)蛋白抗體或抗體片段在制備用于檢測方法的含鈣衛(wèi)蛋白組合物中的用途，所述檢測方法用于檢測患CVD可能性或患CVD傾向性，其中所述鈣衛(wèi)蛋白在取自宿主的樣品中，所述方法包括測定在所述樣品中的鈣衛(wèi)蛋白濃度。
12.鈣衛(wèi)蛋白在制備用于檢測方法的含鈣衛(wèi)蛋白組合物中的用途，所述檢測方法用于檢測患CVD可能性或患CVD傾向性，其中所述鈣衛(wèi)蛋白在取自宿主的樣品中，所述方法包括測定在所述樣品中的鈣衛(wèi)蛋白濃度。
13.如權(quán)利要求7-12中任一項所述的用途，其中所述的樣品為體液，該體液選自血液、 血清、血漿、尿液、腦脊液、口腔液、滑液或膿液。
14.如權(quán)利要求13所述的用途，其中所述的樣品為血液。
15.如權(quán)利要求13所述的用途，其中所述的樣品為血清或血漿。
16.如權(quán)利要求14或15所述的方法，其中鈣衛(wèi)蛋白濃度閾值為O.45mg/L，在該閾值之上則表示有患CVD可能性或患CVD傾向性。
17.如權(quán)利要求6-16中任一項所述的用途，其還包括測定所述樣品中CVD第二標記子的濃度。
18.如權(quán)利要求6-17中任一項所述的用途，其中所述CVD為急性心肌梗塞。
19.如權(quán)利要求17所述的用途，其中所述第二標記子為C-反應(yīng)蛋白。
20.如權(quán)利要求11-19中任一項所述的用途，其中所述的鈣衛(wèi)蛋白濃度是通過濁度檢測法來測定的。
全文摘要
本發(fā)明涉及心血管疾病的檢測。一種在人或者非人類動物宿主中檢測CVD可能性和CVD傾向性的檢測方法，所述的方法包括檢測取自所述宿主含鈣衛(wèi)蛋白樣品中的鈣衛(wèi)蛋白的濃度。
文檔編號G01N33/543GK102608326SQ20121002071
公開日2012年7月25日 申請日期2003年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月20日
發(fā)明者厄林.森德雷黑根 申請人:阿克西斯-希爾德公司