專利名稱：新布尼亞病毒實(shí)時(shí)熒光rt-pcr檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種在流行病學(xué)監(jiān)控中用于新布尼亞病毒感染診斷依據(jù)的新布尼亞病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
2007年，河南省信陽、南陽地區(qū)發(fā)現(xiàn)了多例不明原因發(fā)熱、嚴(yán)重消化道出血癥狀，白細(xì)胞、血小板減少，并伴出血傾向的病人。河南省疾病預(yù)防控制中心對(duì)此開展了專項(xiàng)調(diào)查，根據(jù)臨床特點(diǎn)建立疾病定義，擴(kuò)大搜索范圍，建立癥狀監(jiān)測(cè)報(bào)告系統(tǒng)，命名為發(fā)熱伴血小板減少綜合征，多種已知病原體檢測(cè)陰性，僅極少部分病例人嗜粒細(xì)胞無形體核酸、血清學(xué)檢測(cè)陽性，隨后湖北、山東、安徽、江蘇、遼寧等省也發(fā)現(xiàn)了類似病例。2010年河南省新發(fā)傳染病創(chuàng)新科研團(tuán)隊(duì)在發(fā)熱伴血小板減少綜合征病例急性期 血清標(biāo)本中分離到一種未知病原體，完成了新病毒全基因組測(cè)序，結(jié)合電子顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察、流行病學(xué)和臨床特征，確定為布尼亞病毒科白蛉病毒屬的一種新病毒，并命名為新布尼亞病毒。新布尼亞病毒屬于布尼亞病毒科白蛉病毒屬，呈球形，直徑80 100 nm,有包膜，表面有棘突，基因組含三個(gè)單股負(fù)鏈RNA片段(L、M和S)?？梢越?jīng)接觸血液、蟲媒等途徑傳播，對(duì)人體致病嚴(yán)重，潛伏期為7 9天，主要臨床表現(xiàn)為突然起病、發(fā)熱、乏力、納差、惡心、嘔吐等；部分病例有頭痛、肌肉酸痛、腹瀉等癥狀；體格檢查常有頸部及腹股溝等淺表淋巴結(jié)腫大伴壓痛、上腹部壓痛及相對(duì)緩脈；部分病例病情危重，出現(xiàn)意識(shí)障礙、皮膚瘀斑、消化道出血、肺出血等，可因休克、呼吸衰竭、彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)等多臟器功能衰竭死亡，病死率較高。該病嚴(yán)重影響了人民群眾身體健康，給民眾造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失和精神負(fù)擔(dān)。因此，針對(duì)感染新布尼亞病毒導(dǎo)致的發(fā)熱伴血小板減少綜合征病例提供一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏、特異性高的檢測(cè)試劑成為目前臨床診斷該類病人的迫切需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新布尼亞病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒，該試劑盒可以快速、簡(jiǎn)便、敏感、特異性的檢測(cè)發(fā)熱伴血小板減少綜合征病人急性期血清中新布尼亞病毒的存在，為疾病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供參考依據(jù)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術(shù)方案
本發(fā)明所述的新布尼亞病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒，包括PCR反應(yīng)酶、PCR反應(yīng)液、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品和DEPC H2O,所述PCR反應(yīng)液包括特異性引物和熒光探針，上游引物為5’ - GAARTCCTCAAGCTCAGTCAAATTG _3’，下游引物為5’ -GCAAAGGAGTGATCATGTCIGAGT _3’，熒光探針為5’ -CTGCTGCTCACCAAACTCCACIGCA -3’ ；陽性質(zhì)控品模板的核苷酸序列為TAAGACAGAGTTCACAGCAGCATGGAGGGGATCCCTGAAGGAGTTGTAAACTTCTGTCTTGCTGGCTCCGCGCATCTTCACATTGATAGTCTTGGTGAAGGCATCTTGCCATAAAGAGTAAGCCTCCATCAGGGTCTTGGTCGTGGCTTCAGATACCCCTGCAGTTGGAATCAGGGACCCGAAGGCCATGCACATCATCTCAGGGGGATAATTCTCGACCTTCAGGTTCATGACGGCTGGCCCCACAGGGAGATACTCCTTTAAGGCTGCTGCTGCAGCACATGTCCAAGTGGGGAGGCTCTGCGCTACCCTTACTGGGGTGATTGAGAGCCTGGTCTCTGCCCTCTCAACCAGCC
CATATTTCTCCTGGAGTGCCATCAACCTCTTAGACCCTGAGTTTGACATCTTCCCTGATGCCTTGACGATCTTATTG
CCTCGAGTCAGGGCAAAGACAATGATGAACTTAGTATCCTTCACCCAGTCATCTCCACCTGTCTCCTTCAGCTTCTT
GATGATCAAAGCAGGATCAAGGCCTTCATAGGCTAGCTCTCTCGCGAAATCCTCAAGCTCAGTCAAATTGAGCTGCT
GCTCACCAAACTCCACTGCAATTCTGGACCACTCTGACATGATCACTCCTTTGCGTCTTTCCTTTTTTGGGGGTTTo所述陽性質(zhì)控品模板是含有插入新布尼亞病毒特異性核酸序列的TOCM-T質(zhì)粒載體，該載體可在大腸桿菌JM109中增殖。熒光探針為寡核苷酸探針，熒光基團(tuán)連接在探針的5’末端，而淬滅基團(tuán)則在3’末端。PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’ 一 3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步，因此特異性和敏感性高，目前已廣泛應(yīng)用于乙肝病毒、人乳頭瘤病毒、結(jié)核桿菌等多種病原體的臨床診斷中。本發(fā)明就是采用Taqman探針技術(shù)，設(shè)計(jì)了檢測(cè)新布尼亞病毒核酸的試劑盒，應(yīng)用于發(fā)熱伴血小板減少綜合征病例的臨床診斷中，獲得了很好的檢測(cè)效果，能夠快速、簡(jiǎn)便、敏感、特異地檢測(cè)新布尼亞病毒的存在。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)主要體現(xiàn)在
I、敏感實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)技術(shù)是綜合了 PCR技術(shù)、熒光標(biāo)記技術(shù)、激光技術(shù)、數(shù)碼顯像技術(shù)為一體的技術(shù)，因此它的檢測(cè)靈敏度很高。2、特異使用特異性引物和探針雙重對(duì)靶分子進(jìn)行識(shí)別，特異性好、準(zhǔn)確性高、假陽性低。3、簡(jiǎn)便安全操作簡(jiǎn)單、安全、自動(dòng)化程度高、防污染。擴(kuò)增和檢測(cè)可以在同一管內(nèi)檢測(cè)，不需要開蓋，不易污染。4、快速速度快，高通量，可在2小時(shí)內(nèi)完成。


圖I是本發(fā)明所用熒光探針的工作原理，R表示報(bào)告熒光基團(tuán)，Q表示淬滅熒光基團(tuán)。圖2是實(shí)時(shí)熒光RT-PCR的特異性結(jié)果。圖3是實(shí)時(shí)熒光RT-PCR的敏感性結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所述的新布尼亞病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒，包括PCR反應(yīng)酶、PCR反應(yīng)液、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品和DEPC H2O,所述PCR反應(yīng)液包括特異性引物和TaqMan熒光探針(熒光探針的熒光基團(tuán)為FAM,如圖I所示)，上游引物為 5’ -GAARTCCTCAAGCTCAGTCAAATTG _3’，下游引物為5’ -GCAAAGGAGTGATCATGTCIGAGT -3’，熒光探針為5’ -CTGCTGCTCACCAAACTCCACIGCA -3’ ；陽性質(zhì)控品模板的核苷酸序列為TAAGACAGAGTTCACAGCAGCATGGAGGGGATCCCTGAAGGAGTTGTAAACTTCTGTCTTGCTGGCTCCGCGCATCTTCACATTGATAGTCTTGGTGAAGGCATCTTGCCATAAAGAGTAAGCCTCCATCAGGGTCTTGGTCGTGGCTTCAGATACC
權(quán)利要求
1.一種新布尼亞病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒，包括PCR反應(yīng)酶、PCR反應(yīng)液、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品和DEPC H2O,其特征在于所述PCR反應(yīng)液包括特異性引物和熒光探針，上游引物為5 ’ - GAARTCCTCAAGCTCAGTCAAATTG _3 ’，下游引物為5 ’ -GCAAAGGAGTGATCATGTCIGAGT _3’，熒光探針為5’- CTGCTGCTCACCAAACTCCACIGCA -3’ ；陽性質(zhì)控品模板的核苷酸序列為TAAGACAGAGTTCACAGCAGCATGGAGGGGATCCCTGAAGGAGTTGTAAACTTCTGTCTTGCTGGCTCCGCGCATCTTCACATTGATAGTCTTGGTGAAGGCATCTTGCCATAAAGAGTAAGCCTCCATCAGGGTCTTGGTCGTGGCTTCAGATACCCCTGCAGTTGGAATCAGGGACCCGAAGGCCATGCACATCATCTCAGGGGGATAATTCTCGACCTTCAGGTTCATGACGGCTGGCCCCACAGGGAGATACTCCTTTAAGGCTGCTGCTGCAGCACATGTCCAAGTGGGGAGGCTCTGCGCTACCCTTACTGGGGTGATTGAGAGCCTGGTCTCTGCCCTCTCAACCAGCCCATATTTCTCCTGGAGTGCCATCAACCTCTTAGACCCTGAGTTTGACATCTTCCCTGATGCCTTGACGATCTTATTGCCTCGAGTCAGGGCAAAGACAATGATGAACTTAGTATCCTTCACCCAGTCATCTCCACCTGTCTCCTTCAGCTTCTTGATGATCAAAGCAGGATCAAGGCCTTCATAGGCTAGCTCTCTCGCGAAATCCTCAAGCTCAGTCAAATTGAGCTGCTGCTCACCAAACTCCACTGCAATTCTGGACCACTCTGACATGATCACTCCTTTGCGTCTTTCCTTTTTTGGGGGTTTo
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的新布尼亞病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述陽性質(zhì)控品模板是含有插入新布尼亞病毒特異性核酸序列的PUCM-T質(zhì)粒載體，該載體可在大腸桿菌JM109中增殖。
全文摘要
本發(fā)明公開了一用于檢測(cè)新布尼亞病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑盒，該試劑盒包括PCR反應(yīng)酶、PCR反應(yīng)液、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品和DEPCH2O，PCR反應(yīng)液中包含特異性引物和Taqman熒光探針，該引物和探針是針對(duì)布尼亞病毒的基因組相對(duì)應(yīng)的S片段區(qū)域設(shè)計(jì)的，能夠快速、簡(jiǎn)便、敏感、特異地檢測(cè)新布尼亞病毒的存在。本試劑盒適用于發(fā)熱伴血小板減少綜合征病人急性期血清標(biāo)本及病原細(xì)胞分離培養(yǎng)物等標(biāo)本的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果可作為新布尼亞病毒感染的診斷依據(jù)，同時(shí)適用于流行病學(xué)監(jiān)控。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102634604SQ20121002518
公開日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2012年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月6日
發(fā)明者劉國華, 杜燕華, 許汴利, 陳豪敏, 馬宏, 黃學(xué)勇 申請(qǐng)人:河南省疾病預(yù)防控制中心