專利名稱：一種慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因nlrx1的新突變蛋白、編碼基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程及醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因的新突變蛋白、編碼基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
慢性乙型病毒性肝炎(慢性乙肝)是由乙型肝炎病毒(HBV)感染而引起的以肝臟損害為主要表現(xiàn)的傳染性疾病，是關(guān)系到我國乃至全球公共衛(wèi)生的重大疾病。宿主的遺傳背景在其易感性及免疫應(yīng)答中起重要作用。而人群對乙肝免疫力的高低存在明顯的個體差異。中國專利200810004159. 5公開了一種與肝細(xì)胞癌相關(guān)的乙型肝炎病毒基因組標(biāo)志物以及預(yù)測HBV感染個體發(fā)展成肝細(xì)胞癌(HCC)的遺傳素因的試劑盒。該試劑盒包括一種或更多種探針，當(dāng)其與HBV基因組接觸時，如果所述基因組為NLRXl基因型、且包括至少一種對應(yīng)于某段核苷酸序列上的核苷酸(170C;和/或2170G2;和/或?qū)?1(;和/或799G) 時會選擇性地與所述基因組雜交。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因的新突變蛋白。本發(fā)明的另一目的是提供上述慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因的新突變蛋白的編碼基因。本發(fā)明的又一目的是提供上述慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因NLRXl的新突變蛋白、該突變蛋白的編碼基因的應(yīng)用。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)上述目的
一種慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因的新突變蛋白，是在慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因NLRXl蛋白的氨基酸序列第707位精氨酸Arg突變?yōu)榘腚装彼酑ys，本發(fā)明中用 p. Arg707Cys 表不。上述慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因的新突變蛋白，氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。上述慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因的新突變蛋白的編碼基因。該編碼基因的核苷酸序列優(yōu)選如SEQ ID N0:2所示。慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因的新突變蛋白在制備慢性乙型病毒性肝炎的檢測試劑中的應(yīng)用。慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因的新突變蛋白的編碼基因在制備慢性乙型病毒性肝炎的檢測試劑中的應(yīng)用。一種慢性乙型病毒性肝炎檢測試劑盒，由以下成分組成核苷酸序列如SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4所示的引物，PCR反應(yīng)液，PCR產(chǎn)物純化盒和測序反應(yīng)液；
所述PCR反應(yīng)液為溶解了 Tag DNA聚合酶、dNTPs、鎂離子(如MgCl2)、PCR反應(yīng)緩沖液(如IOXTaq Buffer),以上試劑均可直接購買相應(yīng)商品，如(10mM)dNIPs購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；Tag DNA聚合酶及其配套的IOXTaq Buffer、MgCl2購自!^ermentas 公司。各試劑的用量及濃度均為本領(lǐng)域常規(guī)值，如Iu/μ L Tag DNA聚合酶lyL、2mmol/L 的 dNTP (即濃度均為 2mmol/L 的 4 種 dNTP 的混合物)3 μ L、25mmol/L MgCl2 3 μ LUOXTaq Buffer (內(nèi)含(NH4)2SO4) 3 μ L、滅菌 ddH20 17yL。所述PCR產(chǎn)物純化盒為純化PCR產(chǎn)物的溶液和DNA吸附柱Labell ；所述純化PCR 產(chǎn)物的溶液為lu/ μ L蝦堿性磷酸酶(SAP，可購于!^ermentas公司)0. 6 μ L、20u/ μ L外切酶(位ο I，可購于Fermentas公司)0. 15 μ L和滅菌ddH20 1. 25-1. 75 μ L，或按上述比例配制的其他體積的混合液。純化PCR產(chǎn)物的溶液優(yōu)選2-2. 5 μ L0所述測序反應(yīng)液為BigDye (購自ABI公司)和5Xkquence buffer (購自ABI 公司)的混合液，BigDye和5 Xkquence buffer的體積比優(yōu)選為1:2，如1 μ LBigDye與 2 μ L5 X Sequence buffer 混合。上述慢性乙型病毒性肝炎檢測試劑盒，優(yōu)選核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4所示的引物濃度分別為3. 2ymol/L。本發(fā)明的慢性乙型病毒性肝炎的相關(guān)基因及其新突變p. Arg707Cys,是通過對“相對極端性狀的”50例慢性乙肝患者及40例未注射過乙肝疫苗正常對照進(jìn)行全基因組外顯子測序，通過生物信息學(xué)分析及進(jìn)一步的數(shù)據(jù)篩選找到最有可能的候選基因；然后再對所找到的候選基因進(jìn)行大樣本量的病例-對照(其中慢性乙肝患者17 例，未注射乙肝疫苗正常對照1636例)相關(guān)關(guān)系研究；最后通過相關(guān)基因的作用機(jī)理及統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果 (.NLRXl基因新突變與慢性乙肝相關(guān)的統(tǒng)計學(xué)/^值為5. 08X10_5，優(yōu)勢比(OR)為2. 34，說明兩者有顯著相關(guān)性)最終確定了基因新突變與慢性乙型肝炎相關(guān)。本發(fā)明的人基因核苷酸全長序列(包含突變位點)通常是用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)進(jìn)行合成。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)基因的核苷酸序列，進(jìn)行引物設(shè)計，并以所檢測的患慢性乙型肝炎患者抽提的DNA作為模板，擴(kuò)增目的序列。最后通過測序反應(yīng)檢測及確定相關(guān)基因的突變。由于前期的研究已經(jīng)證明了慢性乙型肝炎與基因新突變的高度相關(guān)性，因此檢測這個基因的突變可用于鑒定慢性乙型肝炎患者的宿主遺傳背景的易感性及對免疫應(yīng)答的反應(yīng)能力，進(jìn)一步地用于之后靶向個體化治療。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
我們通過全基因組外顯子測序及大樣本量的相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)了與慢性乙型病毒性肝炎的相關(guān)基因——NLRXl及其新突變。因此，找尋及檢測慢性乙肝相關(guān)基因及其突變，不僅是了解及闡明本病的發(fā)病機(jī)理的必要途徑，同時也為建立鑒定本病的基因診斷和個體化治療提供了新的契機(jī)。在已了解與本病相關(guān)的基因及其突變之后，我們可以建立起基于 NLRXl基因及其變異的診斷技術(shù)，以期對臨床上慢性乙肝患者進(jìn)行基因水平的診斷，還可以對其臨床用藥情況予以指導(dǎo)和個體化治療。由于基因的突變是導(dǎo)致本病遺傳背景發(fā)生改變從而致使其易感性及免疫應(yīng)答發(fā)生改變的重要因素，從長遠(yuǎn)看，對本病進(jìn)行基因的突變檢測使我們有可能在今后通過糾正突變的基因療法或其它針對這一突變的生物學(xué)效應(yīng)的方法去治療本病。因此，從長遠(yuǎn)看，與本病相關(guān)的基因突變的發(fā)現(xiàn)在臨床治療方面有深遠(yuǎn)的意義和前景。


圖1 -.NLRXl基因的部分測序結(jié)果，圖中上部為野生型的測序結(jié)果，圖下部為 NLRXl p. Arg707Cys雜合性突變的測序結(jié)果(箭頭所示為突變位點)。
具體實施例方式以下實施例中如無特殊說明均為本領(lǐng)域常規(guī)試劑和試驗方法。實施例1病例收集
來自中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院傳染科的17 例慢性乙型肝炎患者和來自同一地區(qū)的1636例未注射乙肝疫苗或自報疫苗注射史不明的健康自愿者，在取得上述患者、自愿者及家屬知情同意后，取外周血于EDTA抗凝管中備用。用Qiagen公司生產(chǎn)的QIAamp DNA Blood Mini Kits (試劑盒)從抗凝外周血中提取DNA，TE溶解，_80°C保存，備用。實施例2 NLRXl基因的突變檢測
NLRXl 基因的 mRNA 序列來自 Genbank (NM_170722)。Genomic DNA 序列來自 UCSC 數(shù)據(jù)庫(http//genome, ucsc. edu/)禾口 Ensembl 數(shù)據(jù)庫(http://asia. ensembl. org/index, html)。主要步驟
1. PCR 擴(kuò)增PCR 反應(yīng)體積為 30 μ L =IOXiTaq Buffer (內(nèi)含(NH4)2S04) 3 μ L, 25mmol/ L MgCl2 3μ L,2mmol/L dNTP 混合物 3 μ L，3. 2 μ mol/L 上、下游引物各 1 μ L，lu/μ L Taq DNA聚合酶1 μ L，實施例1提取的DNA模板1 μ L，滅菌(MH2O補(bǔ)足體積至30 μ L。PCR反應(yīng)條件95°C預(yù)變性:3min ；95°C 30s，引物特異性退火溫度lmin，72°C 45s, 36個循環(huán)；最后 720C 延伸 IOmin0檢測NLRXl基因突變位點的上游引物Pl (SEQ ID NO 3)的序列為 5，- CCCCATCAGAGCTCCTTGACC-3，，下游弓丨物 P2 (SEQ ID NO 4)的序列為5，-CTCCCGGCCCCTAAACTAGACT-3，。2.測序反應(yīng)方案
(1)預(yù)反應(yīng)反應(yīng)體積共3μ L :lu/μ L蝦堿性磷酸酶(SAP) 0. 6μ L、20u/y L外切酶 (.Exo 1)0. 15 μ L (Fermentas 公司)、PCR 產(chǎn)物 0. 5_1· 0μ L、滅菌 ddH20 補(bǔ)足體積至 3 μ L。 反應(yīng)混合物在PCR儀上反應(yīng)，37°C溫浴15min，85°C 15min滅活酶。反應(yīng)完畢后反應(yīng)混合物直接作為測序反應(yīng)的模板用。(2)測序反應(yīng)用ABI公司的96孔板，在GeneAmp 9700 PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)體積共 10μ L :3μ L 的預(yù)反應(yīng)產(chǎn)物、2μ L 的 5Xkquence buffer (ABI 公司)、1 μ L 的 Big-Dye (ABI 公司)、lyL 的引物(3.2ymol/L)，3yL 的滅菌 ddH20。反應(yīng)條件98°C 2min ；96 °C 10s，50°C 5s, 60°C 4min，30 個循環(huán)；最后 4°C保存。(3)測序純化直接在96孔板上進(jìn)行。a)測序反應(yīng)完畢后，配無水乙醇6mL+3mol/L醋酸鈉(pH5. 2)240 μ L混合溶液(即無水乙醇醋酸鈉體積比=25:1)，每個樣品中加入50yL混合溶液。用錫箔紙封閉，并振蕩混勻。b)將測序產(chǎn)物放于_20°C避光靜置20min以上。
c) 20°C,3700 rpm 離心 30min。d)倒去上清液，倒扣在四層吸水紙上，360rpm離心10s。e)配75%乙醇(無水乙醇7. 5mL+ddH20 2. 5mL混合溶液的比例)，每個樣品中加入 90yL混合溶液。用錫箔紙封閉，并振蕩混勻。f)將測序產(chǎn)物放于_20°C避光靜置20min以上。g) 20°C,3700 rpm 離心 30min。h)倒去上清液，倒扣在四層吸水紙上，360rpm離心10s。i)室溫通風(fēng)處，避光晾干，30min以上。j)每個樣品中加ddH20 10 μ L，用錫箔紙封閉，振蕩后離心。k)待測樣品放于4°C避光靜置1. 5h以上，以充分溶解，上ABI3730測序儀進(jìn)行測序。3.測序結(jié)果分析用ABI序列分析軟件進(jìn)行分析
發(fā)明人對來自中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院傳染科的17 例慢性乙型肝炎患者和來自同一地區(qū)的1636例未注射乙肝疫苗或自報疫苗注射史不明的健康自愿者進(jìn)行基因的突變檢測。結(jié)果如下
突變位點為發(fā)生在基因的氨基酸序列中第707位精氨酸突變?yōu)榘腚装彼?(p.Arg707Cys)，突變后的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。其中有66例患者和30例正常對照存在雜合性突變。在17 例病例和1636例對照研究中，其風(fēng)險等位基因的個數(shù)分別是66個和30個，優(yōu)勢比值(OR值)為2. 34 A值為5.08X10—5。多基因遺傳病的研究中，通常是通過關(guān)聯(lián)分析來確定其風(fēng)險基因的，本實驗結(jié)果中，/7值有顯著差異，且OR值為2. 34， 說明該基因的突變是導(dǎo)致該病的危險因素。測序結(jié)果見圖1。
實施例WLMl基因突變檢測試劑盒的制備制備一試劑盒，具體成分見表1 表1
試劑名I具體成分
1__
上游引(SEQIDN0 :3),干粉20D,溶解后濃度:3. 2 μ mol/L,體積=IyL
物Pl__
下游引(SEQIDN0 :4),干粉20D,溶解后濃度3. 2 μ mol/L,體積1WL
物P2__
PCR 反 lu/wLTaqDNA聚合酶 IwL (購自 Fermentas 公司)、2_ol/LdNTf>3 μ L、25_ol/LMgCl23 μ L (TaqDNA 聚合酶配套試齊lj)、
應(yīng)液 IOXTat^uffer (內(nèi)含(NH4)2SO4, TaqDNA 聚合酶配套試劑)3 μ L、滅菌 ddH2017 μ L。_
PCR產(chǎn)2-2. 5μ L純化PCR產(chǎn)物的溶液(內(nèi)含Iu/μ L蝦堿性磷酸酶(SAP,購自Fermentas公司)0. 6 μ L、20u/μ L外切酶(SroI,購自物純化 Fermentas 公司)0. 15 μ L 和滅菌 ddH201. 25-1. 75 μ L), DNA 吸附柱 Labell
測序反含IwLBigDye和2μ L的5 X Sequencebuffer (均購自ABI公司)
應(yīng)液 _
上述試劑盒的使用方法抽取待檢測患者的血液2mL，使用常規(guī)方法(或特定的DNA提取試劑盒)從血液中提取DNA。將基因突變檢測試劑盒中的PCR引物稀釋至3. 2 μ mo 1/ L，以所提取的DNA為模板與所提供的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。使用檢測試劑和所提供的PCR產(chǎn)物純化盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。將純化的產(chǎn)物進(jìn)行測序反應(yīng)后直接測序。觀察測序所得到的序列是否存在錯義突變，即SEQ ID NO :1所示氨基酸序列第707位精氨酸(Arg)是否發(fā)生突變。
權(quán)利要求
1.一種慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因的新突變蛋白，其特征在于在慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因NLRXl蛋白的氨基酸序列第707位精氨酸突變?yōu)榘腚装彼帷?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因的新突變蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
3.權(quán)利要求2所述慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因的新突變蛋白的編碼基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因的新突變蛋白的編碼基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
5.權(quán)利要求1所述慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因的新突變蛋白在制備慢性乙型病毒性肝炎的檢測試劑中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求4所述慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因的新突變蛋白的編碼基因在制備慢性乙型病毒性肝炎的檢測試劑中的應(yīng)用。
7.—種慢性乙型病毒性肝炎檢測試劑盒，其特征在于由以下成分組成核苷酸序列如 SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4所示的引物，PCR反應(yīng)液，PCR產(chǎn)物純化盒和測序反應(yīng)液；所述PCR反應(yīng)液為溶解了 Tag DNA聚合酶、dNTPs、鎂離子的PCR反應(yīng)緩沖液(內(nèi)含 (NH4)2SO4)；所述PCR產(chǎn)物純化盒由純化PCR產(chǎn)物的溶液和DNA吸附柱Labell組成，所述純化PCR 產(chǎn)物的溶液為Iu/ μ L蝦堿性磷酸酶、20u/ μ L外切I和滅菌ddH20的混合液；所述測序反應(yīng)液為BigDye和5Xkquence buffer的混合液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述慢性乙型病毒性肝炎檢測試劑盒，其特征在于所述核苷酸序列如SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4所示的引物濃度分別為3. 2 μ mol/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因NLRX1的新突變蛋白、編碼基因及其應(yīng)用。本發(fā)明的慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因NLRX1的新突變蛋白是在慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因NLRX1蛋白的氨基酸序列第707位精氨酸突變?yōu)榘腚装彼?，同時得到了該突變蛋白的編碼基因，建立了基于NLRX1基因及其突變體的診斷試劑盒，該試劑盒可以對臨床上慢性乙肝患者進(jìn)行基因水平的診斷，還可以對其臨床用藥情況予以指導(dǎo)和個體化治療。從長遠(yuǎn)看，對慢性乙型病毒性肝炎進(jìn)行NLRX1基因的突變檢測使我們有可能在今后通過糾正突變的基因療法或其它針對這一突變的生物學(xué)效應(yīng)的方法去治療本病，在臨床治療方面有深遠(yuǎn)意義和應(yīng)用前景。
文檔編號G01N33/68GK102558312SQ201210031359
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月13日
發(fā)明者彭亮, 李奇斌, 王一鳴, 袁萍, 裴元元, 趙強(qiáng), 高志良, 黃瑋俊 申請人:中山大學(xué)