專利名稱：現(xiàn)場用高靈敏度免疫檢測方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種現(xiàn)場用高靈敏度免疫檢測方法及試齊U盒。
背景技術(shù)：
目前，可用于現(xiàn)場免疫檢測的產(chǎn)品有免疫層析檢測試紙條?，F(xiàn)行檢測抗體用的免疫層析試紙條是“單份”測定，沒有同時(shí)測定陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，而且試紙條上的質(zhì)控線 (C線)實(shí)際上僅是測定一抗的存在，至于一抗有否失活是測不出來的，因此，免疫層析檢測試紙條的質(zhì)控線(C線)不能完全用于評(píng)價(jià)試紙條質(zhì)量的好壞，免疫層析檢測試紙條的檢測結(jié)果也不能完全用于評(píng)價(jià)假陽性或假陰性；其次，免疫層析檢測試紙條的弱點(diǎn)是檢測靈敏度低。所以在免疫檢測技術(shù)中需要一種檢測靈敏、并且可對(duì)假陽性或假陰性進(jìn)行現(xiàn)場檢測的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種現(xiàn)場用高靈敏度免疫檢測方法及試劑品.ο
為實(shí)現(xiàn)以上的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案
現(xiàn)場用高靈敏度免疫檢測試劑盒，由測試條、反應(yīng)液、陽性對(duì)照液、陰性對(duì)照液、 顯色液、液滴瓶組成；其特征在于測試條放置于試劑盒內(nèi)，反應(yīng)液、陽性對(duì)照液、陰性對(duì)照液、顯色液分別裝在相應(yīng)的液滴瓶內(nèi)；其中該試劑盒還可以選擇性包含洗滌液，終止液和塑料吸管中的一種。
所述的測試條含有多個(gè)反應(yīng)槽，可用于同時(shí)測定陽性對(duì)照，陰性對(duì)照以及一個(gè)或一個(gè)以上的待測樣品，如聚苯乙烯。
所述的液滴瓶瓶口設(shè)有內(nèi)蓋和外蓋，內(nèi)蓋有通道，通道上裝有濾膜，外蓋蓋在內(nèi)蓋上，液滴瓶的口徑一致，每滴液40-60微升。
所述的濾膜孔徑為0. 1-lOOu。
所述的反應(yīng)槽是事先經(jīng)抗原(如溶于PBS緩沖液的l-20ug/ml滅活輪狀病毒) 包被后封閉液(如溶于PBS緩沖液的2% BSA)封閉過的。
所述的反應(yīng)液含有預(yù)先標(biāo)記好的標(biāo)記抗體，可特異性地識(shí)別待測抗體而不影響待測抗體與抗原結(jié)合，如溶于PBS緩沖液的BSA和抗人IgG探針-H (購于Clolumbia Bio 公司)。
所述的標(biāo)記抗體是一種能直接或間接產(chǎn)生肉眼可見顏色的酶或膠體金(如堿性磷酸酶，過氧化氫酶)；
所述的陽性對(duì)照液含特異性抗體能識(shí)別包被在反應(yīng)槽中的抗原，如溶于PBS緩沖液的BSA和抗輪狀病毒抗體。
所述的陰性對(duì)照液含有陰性血清(如溶于PBS緩沖液的1 % BSA和無免疫過和未感染過待查病毒的正常人血清)，該陰性血清不能識(shí)別包被在反應(yīng)槽中抗原。
所述的顯色液是反應(yīng)液中的抗體標(biāo)記(如過氧化氫酶)的底物(如TMB)。
所述的液滴瓶的口徑一致，每滴液40-60微升，誤差小于3微升。
現(xiàn)場用高靈敏度免疫檢測方法，包括以下步驟
1)、加樣反應(yīng)取一測試條，在每個(gè)反應(yīng)槽邊上作記號(hào)，如1，2，. . . 8 ；在各反應(yīng)槽中加入5滴反應(yīng)液，再分別在反應(yīng)槽1和反應(yīng)槽2中加入2滴陽性對(duì)照液和陰性對(duì)照液，其它反應(yīng)槽中加入2滴待測樣品，輕晃混勻后室溫下靜置10-30分鐘。
2)、洗滌倒掉反應(yīng)槽中液體并用過濾水(或自來水)沖洗反應(yīng)槽5次或以上；每次沖洗后，將反應(yīng)槽倒向摔在吸水紙(如衛(wèi)生紙)上以除去反應(yīng)槽內(nèi)水珠。
3)、顯色在每個(gè)反應(yīng)槽內(nèi)加入6滴顯色液，輕晃測試條并觀察反應(yīng)槽中顏色變化，直至陽性反應(yīng)槽內(nèi)有清晰的顏色出現(xiàn)。
4)、結(jié)果分析比較各反應(yīng)槽(陽性對(duì)照，陰性對(duì)照和各樣品)的顏色深淺程度以確定該被檢樣品是陽性還是陰性，正常情況下，陽性對(duì)照顯深藍(lán)色，陰性對(duì)照不顯色或淺藍(lán)色；如果被檢樣品的顏色明顯比陰性對(duì)照深，說明該被檢樣品為陽性；如果被檢樣品的顏色與陰性對(duì)照相同或更淺說明該被檢樣品為陰性。如果被檢樣品的顏色比陰性對(duì)照稍深說明該被檢樣品為擬似陽性。
本發(fā)明專利優(yōu)點(diǎn)是實(shí)現(xiàn)了在一次現(xiàn)場檢測實(shí)驗(yàn)中，能同時(shí)測定樣品，陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，避免了使用免疫層析試紙條時(shí)可能隱藏的假陽性和假失效的結(jié)果，從而能正確地界定檢測結(jié)果及有效性。


圖1為本發(fā)明試劑盒結(jié)構(gòu)示意圖中標(biāo)記測試條1、反應(yīng)液2、陽性對(duì)照液3、陰性對(duì)照液4、顯色液5、液滴瓶6。
具體實(shí)施例方式
為了加深對(duì)本發(fā)明的理解，本發(fā)明針對(duì)輪狀病毒感染抗體場用高靈敏度免疫檢測方法進(jìn)行速測。
1.原材料及試劑制備
稀釋液將1克BSA (牛血清蛋白，購于SIGMA公司)溶于100毫升PBS緩沖液，便制得BSA/PBS，無菌過濾后置于冰箱備用。
反應(yīng)液用上述稀釋液將過氧化氫酶-酶標(biāo)100X抗人IgG抗體探針-H，(購于 Clolumbia Bio公司)稀釋成IX，無菌過濾后裝在所述的液滴瓶里，置于冰箱備用。
測試條將輪狀病毒抗原用IOOmM Tris-HCl (pH8)緩沖液稀釋至Ι-lOug/ml)，取 100微升于8-孔槽測試條的槽中，靜置1小時(shí)或以上；洗槽后用上述稀釋液封閉1小時(shí)或以上，再洗槽后，于45度。C烘干，用鋁箔袋真空包裝，置于冰箱備用。
陽性對(duì)照兔抗輪狀病毒抗體，將該抗體用稀釋液稀釋1千倍，無菌過濾后裝在滴瓶(1毫升/瓶)里，置于冰箱備用。
陰性對(duì)照將未接種過輪狀病毒疫苗的正常人血清，將該血清用稀釋液稀釋1千倍，無菌過濾后裝在滴瓶(1毫升/瓶)里，置于冰箱備用。
待測樣品1 接種過輪狀病毒疫苗的兒童人血清；
待測樣品2 未接種過輪狀病毒疫苗的正常人血清；
顯色液TMB顯色液(購于Columbia Bio公司)，無菌過濾后裝在本發(fā)明所述的滴瓶里，置于冰箱備用。
2.檢測方法
1)、加樣取一測試條，在各反應(yīng)槽中加入5滴反應(yīng)液；自上而下，分別在反應(yīng)槽1 和2中加入2滴陽性對(duì)照液，反應(yīng)槽3和4中加入2滴陰性對(duì)照液，在反應(yīng)槽5和6中加入待測樣品1，在反應(yīng)槽7和8中和待測樣品2，輕晃混勻后室溫下靜置20分鐘。
2)、洗槽倒掉反應(yīng)槽中液體并用自來水沖洗反應(yīng)槽5次；每次沖洗后，將反應(yīng)槽倒向摔在吸水紙(衛(wèi)生紙)上以除去反應(yīng)槽內(nèi)水珠。
3)、顯色在每個(gè)反應(yīng)槽內(nèi)加入6滴顯色液，輕晃測試條并觀察反應(yīng)槽中顏色變化，直至陽性反應(yīng)槽內(nèi)有清晰的顏色出現(xiàn)，
4)、判斷結(jié)果比較各反應(yīng)槽(陽性對(duì)照，陰性對(duì)照和各樣品)的顏色深淺程度以確定該被檢樣品是陽性還是陰性。
檢測結(jié)果陽性對(duì)照顯深藍(lán)色，陰性對(duì)照不顯色；被檢樣品1的顏色明顯比陰性對(duì)照深，說明該被檢樣品為陽性；被檢樣品2的顏色與陰性對(duì)照相同說明該被檢樣品為陰性。
本發(fā)明現(xiàn)場用高靈敏度免疫檢測方法及試劑盒，具有結(jié)構(gòu)簡單，使用方便，不需要儀器就能檢測，檢測靈敏度高比原有免疫層析試紙條高出十倍以上等優(yōu)點(diǎn)。
權(quán)利要求
1.現(xiàn)場用高靈敏度免疫檢測試劑盒，由測試條、反應(yīng)液、陽性對(duì)照液、陰性對(duì)照液、顯色液、液滴瓶組成；其特征在于測試條放置于試劑盒內(nèi)，反應(yīng)液、陽性對(duì)照液、陰性對(duì)照液、 顯色液分別裝在相應(yīng)的液滴瓶內(nèi)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的現(xiàn)場用高靈敏度免疫檢測試劑盒，其特征在于所述的測試條含有多個(gè)反應(yīng)槽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的現(xiàn)場用高靈敏度免疫檢測試劑盒，其特征在于所述的液滴瓶瓶口設(shè)有內(nèi)蓋和外蓋，內(nèi)蓋有通道，通道上裝有濾膜，外蓋蓋在內(nèi)蓋上，液滴瓶的口徑一致，每滴液40-60微升。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的現(xiàn)場用高靈敏度免疫檢測試劑盒，其特征在于所述的反應(yīng)槽是事先經(jīng)抗原包被后封閉液封閉過的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的現(xiàn)場用高靈敏度免疫檢測試劑盒，其特征在于所述的反應(yīng)液含有預(yù)先標(biāo)記好的標(biāo)記抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的現(xiàn)場用高靈敏度免疫檢測試劑盒，其特征在于所述的標(biāo)記抗體是一種能直接或間接產(chǎn)生肉眼可見顏色的酶或膠體金。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的現(xiàn)場用高靈敏度免疫檢測試劑盒，其特征在于所述的陽性對(duì)照液含特異性抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的現(xiàn)場用高靈敏度免疫檢測試劑盒，其特征在于所述的陰性對(duì)照液含有陰性血清。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的現(xiàn)場用高靈敏度免疫檢測試劑盒，其特征在于所述的顯色液是反應(yīng)液中的抗體標(biāo)記的底物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的現(xiàn)場用高靈敏度免疫檢測方法，其特征在于包括以下步驟1)、加樣反應(yīng)取一測試條，在每個(gè)反應(yīng)槽邊上作記號(hào)，如1，2，...8;在各反應(yīng)槽中加入5滴反應(yīng)液，再分別在反應(yīng)槽1和反應(yīng)槽2中加入2滴陽性對(duì)照液和陰性對(duì)照液，其它反應(yīng)槽中加入2滴待測樣品，輕晃混勻后室溫下靜置10-30分鐘。2)、洗滌倒掉反應(yīng)槽中液體并用過濾水(或自來水)沖洗反應(yīng)槽5次或以上；每次沖洗后，將反應(yīng)槽倒向摔在吸水紙(如衛(wèi)生紙)上以除去反應(yīng)槽內(nèi)水珠。3)、顯色在每個(gè)反應(yīng)槽內(nèi)加入6滴顯色液，輕晃測試條并觀察反應(yīng)槽中顏色變化，直至陽性反應(yīng)槽內(nèi)有清晰的顏色出現(xiàn)。4)、結(jié)果分析比較各反應(yīng)槽(陽性對(duì)照，陰性對(duì)照和各樣品)的顏色深淺程度以確定該被檢樣品是陽性還是陰性，正常情況下，陽性對(duì)照顯深藍(lán)色，陰性對(duì)照不顯色或淺藍(lán)色； 如果被檢樣品的顏色明顯比陰性對(duì)照深，說明該被檢樣品為陽性；如果被檢樣品的顏色與陰性對(duì)照相同或更淺說明該被檢樣品為陰性。如果被檢樣品的顏色比陰性對(duì)照稍深說明該被檢樣品為擬似陽性。
全文摘要
本發(fā)明公開了現(xiàn)場用高靈敏度免疫檢測方法及試劑盒，測試條放置于試劑盒內(nèi)，反應(yīng)液、陽性對(duì)照液、陰性對(duì)照液、顯色液分別裝在相應(yīng)的液滴瓶內(nèi)，測試條含有多個(gè)反應(yīng)槽；液滴瓶瓶口設(shè)有內(nèi)蓋和外蓋，內(nèi)蓋有通道，通道上裝有濾膜，外蓋蓋在內(nèi)蓋上，液滴瓶的口徑一致，每滴液40-60微升；反應(yīng)液含有預(yù)先標(biāo)記好的標(biāo)記抗體；陽性對(duì)照液含特異性抗體；陰性對(duì)照液含有陰性血清；顯色液是反應(yīng)液中的抗體標(biāo)記的底物；本發(fā)明通過加樣反應(yīng)、洗滌、顯色、結(jié)果分析步驟，實(shí)現(xiàn)了在一次現(xiàn)場檢測實(shí)驗(yàn)中，能同時(shí)測定樣品，陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。
文檔編號(hào)G01N33/543GK102539749SQ20121003468
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月16日
發(fā)明者肖瑤, 鄒潮 申請(qǐng)人:江陰康奈爾生物科技有限公司