專利名稱：延胡索水溶性非生物堿類化合物的分析檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分析化學(xué)和藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體為分析檢測延胡索水溶性非生物堿類化合物的方法。
背景技術(shù)：
中藥延胡索是I!粟科紫堇屬植物延胡索(Corydalis yanhusuo W. T. Wang)的干燥塊莖，性味辛、苦、溫，歸肝、脾經(jīng)，具有活血、利氣、止痛的功效。主要用于胸脅脘腹疼痛、經(jīng)閉、痛經(jīng)、產(chǎn)后瘀阻、跌撲腫痛等。在延胡索的藥效部位篩選研究中發(fā)現(xiàn)，延胡索的80%乙醇提取物過DA201大孔樹脂柱，富集的純水洗脫部位在藥效學(xué)試驗中表現(xiàn)出好的抗心肌缺血作用(大劑量，350mg/kg)。因此，該部位具有一定的研究價值，已有相關(guān)專利授權(quán)(公開號CN 101284050A)。該 水洗脫部分的得率占80%乙醇提取物的60%左右，經(jīng)可見分光光度法測定不含生物堿。相對于研究較充分的生物堿類成分，延胡索中水溶性非生物堿類化合物研究甚少，已見報道的化合物只有香草酸、對羥基苯甲酸、延胡索酸、延胡索多糖等幾種，是否含有大極性的醇、酸、單糖和低聚糖類等化合物，以及如何進行分析檢測和定性，至今還沒有相關(guān)研究報道。天然產(chǎn)物中的大極性化合物，具有種類多，極性接近，含量少，大都含有一個或多個羥基，羧基或氨基等特點，此類化合物的研究工作量大，周期長，植物化學(xué)工作者一直沒有太好的分離純化辦法。雖然有廠家不斷推出新的液相制備色譜柱，但由于缺乏相應(yīng)的液相質(zhì)譜聯(lián)用的化合物數(shù)據(jù)庫，使分離，檢測和結(jié)構(gòu)確證不能同時很好的解決。氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC/MS)是一種高效的分析技術(shù)，該技術(shù)利用氣相色譜的分離能力讓混合物中的組分分離，并用質(zhì)譜鑒定分離出來的組分(定性分析)以及其精確的量(定量分析)，氣相和質(zhì)譜控制、數(shù)據(jù)的記錄、分析都由電腦完成。氣質(zhì)聯(lián)用具有非常高的靈敏度(10_5克)，并且可以分析的范圍非常廣泛，如藥物的分析、環(huán)境污染物的分析、食品添加劑的分析、興奮劑及毒品鑒定等。為了解決揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性差的化合物在氣相色譜中的應(yīng)用，可以采用衍生化試劑進行衍生化處理，提高化合物的揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性。常用的衍生試劑有硅烷化試劑、酰基化試劑和烷基化試劑。其中硅烷化衍生化法，特別是三甲基硅烷化在氣相色譜分析中用途最大。許多被認為是不具有揮發(fā)性的或是在200 300°C熱不穩(wěn)定的含有羥基或氨基的化合物，經(jīng)過硅烷化后成功的進行色譜分析，通過后者的分析檢測可以對目標化合物進行定性和(或)定量分析。但由于天然產(chǎn)物中大極性化合物種類多，采用常規(guī)的硅烷化衍生化法雖使衍生物揮發(fā)性增強，制備快速、簡便，衍生化反應(yīng)可在室溫下幾分鐘完成，適用于醛糖、酮糖、甙、糖醇、糖醛酸和脫氧糖等的衍生化。但其也存在巨大的缺點由于天然產(chǎn)物中組份眾多，各種大小分子化合物、單糖異構(gòu)體和不同大小環(huán)的特殊單糖的存在，造成色譜峰多于組分單糖的數(shù)目，從而導(dǎo)致混合物的定性定量分析復(fù)雜化，無法有效的完成對天然產(chǎn)物中有效成分的分析，因此目前本法未有在天然產(chǎn)物分析中實際應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種簡單、快速準確的方法，對延胡索中的水溶性非生物堿類化合物(即大極性醇，酸，單糖和低聚糖類等化合物)進行檢測分析。同時通過本發(fā)明還可對延胡索中非生物堿類化合物含量進行檢測以此監(jiān)控延胡索藥材質(zhì)量。這是因為，延胡索水溶性非生物堿類化合物中的酸和糖類物質(zhì)的含量直接影響了延胡索水溶性提取物的抗心肌缺血作用(即總黃酮的藥效作用)。在本發(fā)明研究過程中發(fā)現(xiàn)，大分子物質(zhì)將嚴重影響氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法的檢測結(jié)果，因此，在延胡索水溶性非生物堿類化合物含量檢測中必須進行前處理，將大分子物質(zhì)清除干凈，去除其對檢測結(jié)果的影響。本發(fā)明的具體步驟包括(I)取延胡索水溶性非生物堿類提取物，高速離心后過濾； (2)取(I)的上清液干燥后進行三甲基硅烷化衍生化處理；(3)將步驟(2)的衍生化產(chǎn)物用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法分析。步驟⑴具體方法為(a)延胡索粉碎后用30wt% 70被％的乙醇溶液提取2 4次，過濾，取濾液；每次乙醇溶液重量為延胡索藥材藥粉的4 8倍；優(yōu)選方案為取延胡索藥材粗粉，50wt%乙醇溶液提取三次，每次乙醇溶液的用量為延胡索藥材粗粉重量的6倍；(b)將濾液濃縮至六分之一到五分之一體積，加入無水乙醇，調(diào)節(jié)乙醇濃度80wt*% 85wt*%, 8000 12000rpm高速離心4 IOmin后過濾,取濾液；(c)將濾液過大孔樹脂柱，并用3 6倍柱體積的純水洗脫；大孔樹脂優(yōu)選DA201，收集4倍柱體積的純水洗脫獲得的部位。取(c)的水洗脫部位，干燥后進行三甲基硅烷化衍生化處理；三甲基硅烷化衍生化處理的步驟包括將延胡索水溶性非生物堿類提取物與干燥的三甲基硅烷化試劑混合，以吡啶或甲氧胺鹽酸鹽的吡啶溶液為催化劑，68 75°C下密閉反應(yīng)0. 5 I小時；所述三甲基硅烷化試劑為雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺與三甲基氯硅烷的混合物，兩者體積比優(yōu)選為99 I ；優(yōu)選方案是稱取經(jīng)氮氣吹干的樣品于衍生化瓶中，然后加入催化劑吡啶和經(jīng)氮氣吹干的硅烷化試劑(99% BSTFA+1 % TMS)，于70°C恒溫水浴中密閉反應(yīng)I小時，冷卻，得
三甲基硅烷化反應(yīng)溶液。收集所得到的衍生化產(chǎn)物，采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法分析，氣相色譜條件為采用非極性毛細管柱；進樣口溫度256 262°C ;檢測器溫度256 262°C ;程序升溫初始溫度88 92°C，保持3 5分鐘，以5. 5 7°C /min的速率升至200 202°C，保持4 6分鐘，再以每分鐘8 12 °C速率升至246 255°C，保持8 15分鐘；載氣為高純氮氣、氖氣或氦氣，載氣流速為1.7 2ml/min;分流進樣，分流比9 : I 10 : I ;進樣量2 5u I ；質(zhì)譜條件為離子源溫度218 225°C，傳輸桿溫度245 254°C，電子轟擊能量50 IOOeV ;燈絲電流35 45y A，檢測電壓2500 3000V。
步驟(3)氣相色譜條件的一個優(yōu)選實施方案是非極性毛細管柱；進樣口溫度260°C;檢測器溫度260°C;程序升溫初始溫度90°C，保持4分鐘，以每分鐘6°C升至200°C，保持5分鐘，再以每分鐘10°C升至250°C，保持10分鐘；載氣為高純氮氣，載氣流速為每分鐘I. 9ml ;分流進樣，分流比10 I ;進樣量2iil。步驟(3)質(zhì)譜條件的一個優(yōu)選實施方案是離子溫度220°C，傳輸桿溫度250°C，電子轟擊能量70eV，燈絲電流40iiA，檢測電壓2700V。步驟(3)氣相色譜條件的另一個優(yōu)選實施方案是非極性毛細管柱；進樣口溫度258 0C ;檢測器溫度258°C ;程序升溫初始溫度91°C，保持3. 5分鐘，以每分鐘6. 5°C升至202°C，保持6分鐘，再以每分鐘9°C速率升至252°C，保持12分鐘；載氣為高純氮氣，載氣流速為每分鐘2ml;分流進樣，分流比10 I;進樣量2iU。、步驟(3)質(zhì)譜條件的另一個優(yōu)選實施方案是離子源溫度222°C，傳輸桿溫度、252°C，電子轟擊能量80eV，燈絲電流40y A，檢測電壓2700V。根據(jù)本發(fā)明，可以檢測出約50多種延胡索中水溶性非生物堿類化合物。按照色譜峰面積歸一化法計算，實施例4 9中磷酸、D-吡喃葡萄糖、環(huán)己六醇、乳糖的含量如表I所
/Jn o表I實施例4 9中磷酸、D-吡喃葡萄糖、環(huán)己六醇、乳糖的含量
權(quán)利要求
1.延胡索水溶性非生物堿類化合物的分析檢測方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)取延胡索水溶性非生物堿類提取物，高速離心后過濾； (2)取(I)的上清液干燥后進行三甲基硅烷化衍生化處理； (3)將步驟(2)的衍生化產(chǎn)物用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法分析。
2.權(quán)利要求I所述延胡索水溶性非生物堿類化合物的分析檢測方法，其特征在于，所述延胡索水溶性非生物堿類提取物的制備方法為，延胡索粉碎后用30Wt% 70Wt%乙醇溶液提取，過濾，濾液濃縮至六分之一到五分之一體積，加入無水乙醇，調(diào)節(jié)乙醇濃度至80wt% SSwtl^jOOO 12000rpm高速離心4 IOmin后過濾,取濾液過大孔樹脂柱，并用純水洗脫。
3.權(quán)利要求2所述延胡索水溶性非生物堿類化合物的分析檢測方法，其特征在于，用3 6倍柱體積純水洗脫。
4.權(quán)利要求I所述延胡索水溶性非生物堿類化合物的分析檢測方法，其特征在于，步驟(2)所述三甲基硅烷化衍生化處理的步驟包括將干燥的延胡索水溶性非生物堿類提取物和干燥的三甲基硅烷化試劑混合，以吡啶或甲氧胺鹽酸鹽的吡啶溶液為催化劑，68 75°C下密閉反應(yīng)O. 5 I小時。
5.權(quán)利要求I所述延胡索水溶性非生物堿類化合物的分析檢測方法，其特征在于，所述三甲基硅烷化試劑為雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺與三甲基氯硅烷的混合物。
6.權(quán)利要求I所述延胡索水溶性非生物堿類化合物的分析檢測方法，其特征在于，步驟(3)所述氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法分析，氣相色譜條件為采用非極性毛細管柱；進樣口溫度256 262°C;檢測器溫度256 262°C;程序升溫初始溫度88 92°C，保持3 5分鐘，以5. 5 7V /min的速率升至200 202°C，保持4 6分鐘，再以每分鐘8 12°C速率升至246 255°C，保持8 15分鐘；載氣為高純氮氣、氖氣或氦氣，載氣流速為I. 7 2ml/min ;分流進樣，分流比9 : I 10 : 1;進樣量2 5“1; 質(zhì)譜條件為離子源溫度218 225°C，傳輸桿溫度245 254°C，電子轟擊能量50 IOOeV ;燈絲電流35 45 μ A，檢測電壓2500 3000V。
7.權(quán)利要求I或6所述延胡索水溶性非生物堿類化合物的分析檢測方法，其特征在于，所述的氣相色譜條件為 非極性毛細管柱；進樣口溫度260°C ;檢測器溫度260°C ;程序升溫初始溫度90°C，保持4分鐘，以每分鐘6°C升至200°C，保持5分鐘，再以每分鐘10°C速率升至250°C，保持10分鐘；載氣為高純氮氣，載氣流速為每分鐘I. 9ml ;分流進樣，分流比10 I ;進樣量2μ I。
8.權(quán)利要求I或6所述延胡索水溶性非生物堿類化合物的分析檢測方法，其特征在于，所述的質(zhì)譜條件為離子源溫度220°C，傳輸桿溫度250°C，電子轟擊能量70eV，燈絲電流40μ A，檢測電壓:2700V。
9.權(quán)利要求I或6所述延胡索水溶性非生物堿類化合物的分析檢測方法，其特征在于，所述的氣相色譜條件為 非極性毛細管柱；進樣口溫度258°C ;檢測器溫度258°C ;程序升溫初始溫度91°C，保持3. 5分鐘，以每分鐘6. 5°C升至202°C，保持6分鐘，再以每分鐘9°C速率升至252 °C，保持12分鐘；載氣為高純氮氣，載氣流速為每分鐘2ml ;分流進樣，分流比10 I ;進樣量.2 μ I。
10.權(quán)利要求I所述延胡索水溶性非生物堿類化合物的分析檢測方法，其特征在于，所述的質(zhì)譜條件為，離子源溫度222°c，傳輸桿溫度252°C，電子轟擊能量80eV，燈絲電流40 μ A，檢測電壓:2700V。
全文摘要
本發(fā)明涉及分析化學(xué)和藥物化學(xué)領(lǐng)域，公開了延胡索水溶性非生物堿類化合物的分析檢測方法，其特征在于，包括如下步驟(1)取延胡索水溶性非生物堿類提取物，高速離心后過濾；(2)取(1)的上清液干燥后經(jīng)三甲基硅烷化衍生化處理；(3)將步驟(2)的衍生化產(chǎn)物用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法分析。本發(fā)明可簡單、快速、準確地檢測延胡索中水溶性非生物堿類化合物成分及其含量，對于充分了解傳統(tǒng)良藥延胡索的化學(xué)成分和控制延胡索水溶性提取物的質(zhì)量有著重要意義，為延胡索的深入開發(fā)提供了研究資料，使研究和生產(chǎn)更加安全、有效和質(zhì)量可控的延胡索新藥成為可能。
文檔編號G01N30/88GK102706999SQ201210037779
公開日2012年10月3日 申請日期2012年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月20日
發(fā)明者劉振華, 葉劍鋒, 方玲, 王如偉, 章江生, 胡江寧 申請人:浙江康恩貝制藥股份有限公司