專利名稱：一種納米熒光微球，其制備方法及其用作免疫層析方法的標記物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種適用作免疫層析的標記物的納米熒光微球及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
在生物和醫(yī)學檢測中，經(jīng)常用到免疫分析法，它包括放射免疫分析、酶聯(lián)免疫分析及免疫層析等方法。放射免疫分析和酶聯(lián)免疫分析法需要昂貴的設(shè)備、專業(yè)的操作人員和復(fù)雜的操作步驟，難以快速得到檢測結(jié)果。免疫層析法因具有操作簡單、快速及成本底等特點，而常用于快速定性或半定量檢測。免疫層析技術(shù)是出現(xiàn)于80年代初期的一種獨特的免疫分析方式，它通常以條狀纖維層析材料為固相，通過毛細作用使樣品溶液在層析條上泳動，并同時使樣品中的待測物與層析材料上針對待測物受體(如抗體或抗原)發(fā)生高特異、高親和性的免疫反應(yīng)。免疫層析技術(shù)常見的示蹤粒子有膠體金、乳膠、膠體硒、明膠等，其中運用最成功的標記物為膠體金，例如已出現(xiàn)檢測鹽酸克倫特羅、乙肝表面抗原、黃曲霉毒素和促黃體激素等的膠體金試紙條。然而膠體金免疫層析技術(shù)檢測靈敏度較低，在實際檢測中只能對檢測物進行定性或半定量，無法準確定量。目前，已有相關(guān)專利報道了以熒光納米微粒為標記物進行免疫層析檢測，如公開號為CN1645146A的專利公開了一種用熒光稀土納米顆粒作為標記物的免疫層析方法及其檢測試紙條的制備；公開號為CN1866012A的專利公開了一種定量、快速的免疫檢測方法及其專用裝置，該方法將熒光物質(zhì)螯合物Eu3+、SrTi3+、Tb3+、Dy3+與有機高分子納米微粒結(jié)合，制備成熒光微粒，通過熒光檢測來進行定量，但是這些納米熒光微球都是在紫外光源下激發(fā)，紫外光源的設(shè)置增加了檢測儀器的成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種粒徑穩(wěn)定、光譜適用于可見發(fā)射光的納米熒光微球，采用該納米熒光微球作為標記物的免疫層析方法，簡便快速、靈敏度高且可進行定量檢測。本發(fā)明同時還要提供一種納米熒光微球的制備方法，該方法可獲得粒徑穩(wěn)定、光譜適用于可見發(fā)射光的納米熒光微球，并且該方法簡單。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的一種技術(shù)方案是
一種納米熒光微球，具有核殼結(jié)構(gòu)，該納米熒光微球的粒徑為20(T500nm，其內(nèi)核為包含有熒光分子的聚合物微球，外殼具有修飾在所述聚合物微球外表面上的一種或多種官能團，該所述官能團能夠直接與配體或生物大分子反應(yīng)形成微球表面的共價鍵連接，或在激活后與配體或者生物大分子進行共價標記；所述的聚合物微球為聚甲基丙烯酸甲酯的微球或甲基丙烯酸甲酯與其它單體共聚形成的共聚物的微球或者它們的混合物，其中甲基丙烯酸甲酯單元的重量至少占所述納米熒光微球總重量的50%，所述的熒光分子的重量占所占
3納米熒光微球總重量的0. 05% 5%。根據(jù)本發(fā)明，所述甲基丙烯酸甲酯與其它單體共聚形成的共聚物中，甲基丙烯酸甲酯與所述其它單體的結(jié)構(gòu)單元數(shù)均大于等于50。所述的其它單體為包括但不限于氟乙烯、氯乙烯、溴乙烯、乙烯碘化、苯乙烯以及丙烯酸等。根據(jù)本發(fā)明，所述的官能團可以為選自羧基，乙醇胺基，羥基，胺基，氨基，亞胺基， 環(huán)氧基，異氰酸酯基，金屬醇鹽，及聚乙二醇基中的一種，其中優(yōu)選為羧基。根據(jù)本發(fā)明，所述熒光分子指在適當?shù)募ぐl(fā)波長下可發(fā)射熒光的物質(zhì)。本發(fā)明中， 熒光分子優(yōu)選為熒光素及其衍生物、羅丹明、腎上腺素染料、氟硼瑩等。其中，更優(yōu)選采用羅丹明例如羅丹明Red-X和羅丹明6G等作為熒光分子。熒光分子的重量優(yōu)選為所述納米熒光微球總重量的0. 29^5%。優(yōu)選地，本發(fā)明的納米熒光微球的粒徑為35(T400nm，更優(yōu)選為37(T390nm。根據(jù)本發(fā)明，納米熒光微球還可進一步包含一種或者一種以上的通過所述官能團共價連接而覆蓋在所述微球表面的生物活性物種，從而成為具有生物活性的熒光微球。選擇的生物活性物種可以參與特異性識別反應(yīng)，包括特異性結(jié)合、核酸雜交和酶反應(yīng)。生物活性物種可通過一個具有明顯親水性的間隔區(qū)域來實現(xiàn)共價標記。這種間隔區(qū)域可以是諸如乙烯乙二醇低聚物的小分子間隔區(qū)域，也可以是諸如肽、蛋白質(zhì)、聚乙二醇、和多糖的大分子實體。微球表面和生物活性種的結(jié)合包括氨基鍵結(jié)合，酯鍵結(jié)合，C-C鍵結(jié)合，C-N鍵結(jié)合和包含電荷相互作用的結(jié)合。生物活性的例子包括包含在特定的識別和結(jié)合中的分子實體，諸如抗體、抗原、核酸、配體、受體、人工多肽、蛋白質(zhì)等。該生物活性物種一般都可以采用多種眾所周知的技術(shù)中的任何一種附著在在表面具有官能團的聚合物微球上。例如，可以使用竣基、氣基、醒基、硫醒基、環(huán)氧基和其它活性或者鍵和功能基、以及剩余的自由基和陽離子自由基將生物活性物種共價附著在微球上，同時也實現(xiàn)了蛋白的耦聯(lián)反應(yīng)。一個表面官能團可以作為官能共聚單體的一個組合，因為微球表面可以包含表面濃度相對較高的極性基。此外該發(fā)明制備的微球也可以直接共價鍵連接蛋白質(zhì)，而不需要進一步的修改，例如用碳化二亞胺激活微球表面的羧基，而被激活的羧基與抗體的氨基反應(yīng)形成酰胺鍵。激活和抗體耦聯(lián)可以發(fā)生在諸如磷酸(鹽)緩沖液，或者2- (N-嗎啉)乙烷磺酸的緩沖液中， 由此可以形成微球結(jié)合物。本發(fā)明采取的又一技術(shù)方案是一種上述的納米熒光微球的方法，其包括如下步驟
(I )、以所述聚合物的微粒和含有所述官能團的烯烴單體為原料，通過微乳液聚合法制備得到外表面上具有所述官能團的聚合物微球；
(2)、向步驟(I)所得外表面上具有所述官能團的聚合物微球中緩慢注入含有所述熒光分子的有機溶劑和水，聚合物微球發(fā)生溶脹，熒光分子進入聚合物微球內(nèi)，然后離心，除去上清液，清洗，加水懸浮，即得所述納米熒光微球，其中有機溶劑為丙酮或二氯甲烷。根據(jù)本發(fā)明，步驟(I)可采用常規(guī)的微乳液聚合法來實現(xiàn)，最后獲得的聚合物微球為聚合物、用于提供微球表面官能團的含有官能團的烯烴單體、表面活性劑、水以及有機溶劑的乳液，這些均為本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員所熟知。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的是表面具有羧基的納米熒光微球。在該情況下，用于提供微球表面官能團的含有官能團的烯烴單體可以為例如甲基丙烯酸。
此外，本發(fā)明還特別涉及上述的納米熒光微球用作免疫層析方法的標記物的用途。由于上述技術(shù)方案的采用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點
本發(fā)明納米熒光微球采用基于甲基丙烯酸甲酯的聚合物作為封裝基體，其使用壽命長，易于制造，制備穩(wěn)定且具有良好的單分散性，可以很容易地用各種官能團和生物物種對微球的表面進行改性，每個微球上都能夠被連接上大量的熒光分子，是非常好的熒光信號放大的載體，應(yīng)用于免疫層析檢測中，可以大大提高檢測靈敏度，且納米熒光微球非常穩(wěn)定，受外界影響小，熒光穩(wěn)定，這為通過熒光進行定量檢測提供了良好的條件，因此，本發(fā)明納米熒光微球是熒光檢測技術(shù)中高靈敏度分析檢測和定量測試中的理想標記。此外，本發(fā)明納米熒光微球可用可見光光源激發(fā)以及通過簡單的方法獲得，降低檢測分析成本。本發(fā)明的納米熒光微球的方法簡單，獲得的納米熒光微球中，熒光分子均勻地分布在聚合物微球中，微球粒徑均勻、穩(wěn)定，可用于制備精確定量免疫層析試紙條，適用于醫(yī)療診斷、生物檢測、環(huán)境檢測和食品安全監(jiān)測以及不同物種的檢測技術(shù)領(lǐng)域中。


下面結(jié)合附圖和具體的實施例對本發(fā)明做進一步詳細的說明。圖I為實施例I制備的納米熒光微球的發(fā)射和激發(fā)光譜圖2為實施例I制備的納米熒光微球的掃描電鏡圖。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例對上述方案作進一步說明，應(yīng)理解，這些實施例是用于說明本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實施例中所采用的實施條件可以根據(jù)具體廠家的條件做進一步調(diào)整，未注明的實施條件通常為常規(guī)實驗中的條件。實施例I表面官能團為羧基的納米熒光微球的制備根據(jù)本實施例，納米熒光微球的制備包括如下步驟
(I)、制備表面具有羧基的聚甲基丙烯酸甲酯微球
取Polysciences公司產(chǎn)的聚甲基丙烯酸甲酯微粒(2. 7%, 0. 324 u m) 5ml,清洗離心后在IOml超純水中懸浮超聲,加入含3mg甲基丙烯酸單體(用于在微球表面形成羧基)的Iml 水，混合兩min,加入含15mg聚乙烯醇的0. 5ml水,攪拌2min,然后加入含8mg十二燒基硫酸鈉的0. 5ml /K，混合2min,然后加入5ml乙醇,攪拌5min,得到聚甲基丙烯酸甲酯微球。(2)、制備納米熒光微球
通過注射器向步驟(I)所得聚甲基丙烯酸甲酯微球中，緩慢加入含Img羅丹明的 750 u I 二氯甲燒,加入時間可以超過5min,繼續(xù)攪拌5min。通過注射泵以0. 5ml/min速度加入水25ml，然后空氣氣流去除一些溶劑定容到30ml。對微球進行離心去除上清液，用90% 乙醇清洗三遍，清洗后的微球用30ml水懸浮，即得納米熒光微球。實施例2納米熒光微球的表征
取實施例I制備的10 u I納米熒光微球，懸浮在750 u I水中進行檢測，在610nm處收集微球的激光光譜，發(fā)射光譜在580nm處采集，譜圖參見圖I。
對微球進行掃描電鏡測試，譜圖參見圖2，微球粒徑在37(T390nm之間，粒徑均勻。
實施例3納米熒光微球適用于定量免疫層析檢測試紙條的制備可采用常規(guī)的免疫層析檢測試紙條的制備方法來制備，具體包括如下步驟
(I)、熒光微球墊的制備用將標記待測物單抗的熒光微球按照4 u L/cm的量噴涂至玻璃纖維膜(30 X0. 8 cm)上，25°C真空干燥l 2h，放于干燥環(huán)境備用。(2)、硝酸纖維素膜(NC膜)的制備用0.01 M pH 7.4 PBS (磷酸鹽緩沖液，其中包含5%蔗糖和0. 05%吐溫-20)調(diào)節(jié)待測物抗體二抗(濃度為0. 4mg/mL)，將所得溶液噴涂在NC膜上形成檢測線；用0. OlM pH 7. 2 PBS(磷酸鹽緩沖液，其中包含3%蔗糖和0. 05%吐溫-20)調(diào)節(jié)質(zhì)控抗體的濃度為0. 5mg/mL，將所溶液噴涂在NC膜上形成質(zhì)控區(qū)。質(zhì)控區(qū)距離NC膜一端2mm，37 °C烘干過夜后，于室溫干燥環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?3)、熒光微球免疫層析檢測卡的制備組裝試紙條在PVC底板上依次搭接地粘貼1)濾紙和樣本墊，樣本墊為一種經(jīng)過5%TWeen-20處理的玻璃纖維膜；2)噴涂有熒光微球標記的待測物單抗的熒光微球墊；3)噴涂有檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的硝酸纖維素膜；4)吸水紙，組裝完成后剪切成4mm的寬度，即成為免疫層析試紙條。把一張免疫層析試紙祭固定在塑料底卡上，試紙表面用面卡壓緊，面卡在對應(yīng)試紙條的樣本墊和NC膜的部位分別預(yù)留加樣孔和觀察窗。免疫層析檢測卡組裝好后裝入鋁箔袋中，加入干燥劑后封口保存，于室溫干燥環(huán)境下至少可以保存一年。實施例4樣品的定量檢測
在樣品孔內(nèi)加入檢測血清，15min后，采用激發(fā)光波長為40(T700nm范圍內(nèi)(可見光) 的免疫層析定量檢測儀器掃描待待檢區(qū)和質(zhì)控區(qū)的熒光信號強度，從而得出待測物在血清中的含量，通過本發(fā)明的熒光微球，能夠提高檢測靈敏度，例如對于心衰指標的PRO-BNP 的檢測靈敏可達到40PG/ML的水平，優(yōu)于同類產(chǎn)品(目前國內(nèi)的同類檢測基本只能夠達到 100PG/ML)。上述實施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種納米突光微球，具有核殼結(jié)構(gòu)，其特征在于所述的納米突光微球的粒徑為 20(T500nm，其內(nèi)核為包含有熒光分子的聚合物微球，外殼具有修飾在所述聚合物微球外表面上的一種或多種官能團，該所述官能團能夠直接與配體或生物大分子反應(yīng)形成微球表面的共價鍵連接，或在激活后與配體或者生物大分子進行共價標記；所述的聚合物微球為聚甲基丙烯酸甲酯的微球或甲基丙烯酸甲酯與其它單體共聚形成的共聚物的微球或者它們的混合物，其中甲基丙烯酸甲酯單元的重量至少占所述納米熒光微球總重量的50%，所述的熒光分子的重量占所占納米熒光微球總重量的0. 059^5%。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的納米熒光微球，其特征在于所述甲基丙烯酸甲酯與其它單體共聚形成的共聚物中，甲基丙烯酸甲酯與所述其它單體的結(jié)構(gòu)單元數(shù)均大于等于50。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的納米熒光微球，其特征在于所述的其它單體為選自氟乙烯、 氯乙烯、溴乙烯、乙烯碘化、苯乙烯以及丙烯酸中的一種或多種。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的納米熒光微球，其特征在于所述的官能團為選自羧基，乙醇胺基，羥基，胺基，氨基，亞胺基，環(huán)氧基，異氰酸酯基，金屬醇鹽及聚乙二醇基中的一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4中任一項權(quán)利要求所述的納米熒光微球，其特征在于所述熒光分子為羅丹明、熒光素及其衍生物、腎上腺素染料及氟硼瑩中的一種或多種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的納米熒光微球，其特征在于所述的熒光分子的重量優(yōu)選為所述納米熒光微球總重量的0. 29T5%。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的納米熒光微球，其特征在于所述納米熒光微球的粒徑為 350 400nm。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的納米熒光微球，其特征在于所述納米熒光微球還包含一種或者一種以上的通過所述官能團共價連接而覆蓋在所述微球表面的生物活性物種，該所述的生物活性物種選自抗體、抗原、核酸、配體、受體、人工多肽、蛋白質(zhì)以及多糖中的一種，所述的生物活性物種能夠參與特異性識別和結(jié)合反應(yīng)。
9.一種如權(quán)利要求I所述的納米熒光微球的方法，其特征在于包括如下步驟(I )、以所述聚合物的微粒和含有所述官能團的烯烴單體為原料，通過微乳液聚合法制備得到外表面上具有所述官能團的聚合物微球；(2)、向步驟(I)所得外表面上具有所述官能團的聚合物微球中緩慢注入含有所述熒光分子的有機溶劑和水，聚合物微球發(fā)生溶脹，熒光分子進入聚合物微球內(nèi)，然后離心，除去上清液，清洗，加水懸浮，即得所述納米熒光微球，其中所述有機溶劑為丙酮或二氯甲烷。
10.權(quán)利要求I至8中任一項權(quán)利要求所述的納米熒光微球用作免疫層析方法的標記物的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種納米熒光微球及其制備方法和用途，納米熒光微球具有核殼結(jié)構(gòu)，粒徑為200~500nm，其內(nèi)核為包含有熒光分子的聚合物微球，外殼具有修飾在所述聚合物微球外表面上的一種或多種官能團，聚合物微球為聚甲基丙烯酸甲酯的微球或甲基丙烯酸甲酯與其它單體共聚形成的共聚物的微球或者它們的混合物，其中甲基丙烯酸甲酯單元的重量至少占所述納米熒光微球總重量的50%，熒光分子的重量占所占納米熒光微球總重量的0.05%~5%。本發(fā)明納米熒光微球粒徑穩(wěn)定、光譜適用于可見發(fā)射光，采用該納米熒光微球作為標記物的免疫層析方法，簡便快速、靈敏度高且可進行定量檢測。
文檔編號G01N21/64GK102604305SQ20121003987
公開日2012年7月25日 申請日期2012年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月21日
發(fā)明者夏志道, 張鵬, 李超 申請人:蘇州納諾康生物技術(shù)有限公司