專利名稱：一種TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測甲病毒的非診斷性方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測甲病毒的非診斷性方法。
背景技術(shù)：
披膜病毒科甲病毒屬病毒與黃病毒科黃病毒屬病毒、呼腸孤病毒科病毒和布尼亞病毒科病毒均屬于蟲媒病毒，蟲媒病毒是指通過吸血的節(jié)肢動物叮咬敏感的脊椎動物而引起的一種人獸共患的自然疫源性疾病。人、畜一旦被攜帶病毒的節(jié)肢動物叮咬感染，就會帶來疾病和死亡，當(dāng)病毒大面積爆發(fā)時(shí)，會給爆發(fā)地經(jīng)濟(jì)帶來巨大損失，引起社會恐慌，是各國公共衛(wèi)生機(jī)構(gòu)都有可能面臨的問題。目前，甲病毒主要的鑒定手段是病毒分離，但是由于其對實(shí)驗(yàn)條件要求苛刻、操作較復(fù)雜、技術(shù)難度高并且在檢測時(shí)間長的同時(shí)伴隨著嚴(yán)重的生物安全問題，所以無法再實(shí)際檢測工作中推廣使用。近年來使用常規(guī)反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增(retro-transcript-PCR，RT-PCR)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)技術(shù)在甲病毒的檢測方面發(fā)揮了重要作用。但目前使用的RT-PCR、 實(shí)時(shí)熒光PCR大多只是針對某一種蟲媒病毒的檢測。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種快速、敏感的檢測和篩選甲病毒屬病毒的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測甲病毒的非診斷性方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一種TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測甲病毒的非診斷性方法，該非診斷性方法包括設(shè)計(jì)了一對引物和探針對待檢樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測，引物和探針序列如下
權(quán)利要求
1. 一種TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測甲病毒的非診斷性方法，其特征在于，該非診斷性方法包括設(shè)計(jì)了一對引物和探針對待檢樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測，引物和探針序列為正向引物序列Ala-F5，- GCAGGTCACWSMBAATGA -3'反向引物序列Ala-R5'- CATNGGRCARAYRCARTG -3'熒光探針序列Ala-P5'- TXR-CATGCTAATGCYAGAGCGTTTTCGCA-BHQ2-3，
2.如權(quán)利要求1所述的非診斷性方法，其特征在于，所述探針連接的熒光基團(tuán)為 TXR-BHQ2，熒光探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是TXR，3’端連接淬滅基團(tuán)。
3.如權(quán)利要求2所述的非診斷性方法，其特征在于，所述該淬滅基團(tuán)為BHQ2非熒光淬滅基團(tuán)。
4.如權(quán)利要求1所述的非診斷性方法，其特征在于，所述該非診斷性方法包括步驟1)樣本用裂解液和RNA抽提液處理，提取病毒RNA；2)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)，配制一定組分濃度的25μLPCR反應(yīng)體系，混勻后短暫離心分裝到PCR管中；3)將待測樣品加入到反應(yīng)體系中，進(jìn)行擴(kuò)增；4)收集熒光信號，檢測Ct值。
5.如權(quán)利要求4所述的非診斷性方法，其特征在于，所述實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)的體系組分及其體積如下組分體積(μ )2 xRT-PCR Buffer12.5ΙΟμΜ Ala-F0.5ΙΟμΜ Ala-R2ΙΟμΜ Ala-P0.525 xRT-PCR Enzyme Mix1模板RNA5雙蒸水3.5總體積25擴(kuò)增條件采用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增條件。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測甲病毒的非診斷性方法，該非診斷性方法包括一對引物和探針對待檢樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測，利用了PCR對DNA的高效擴(kuò)增，探針技術(shù)的高特異性和光譜技術(shù)的敏感性以及定量的特點(diǎn)，克服常規(guī)PCR檢測的不足，具有直觀、高度特異性、檢測時(shí)速度快、步驟簡單、重復(fù)性好、靈敏度高、可進(jìn)行多重定量的特點(diǎn)。在實(shí)際快速診斷中有極強(qiáng)的操作性。
文檔編號G01N21/64GK102559936SQ201210045090
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月24日
發(fā)明者劉麗娟, 姚李四, 孫肖紅, 楊宇, 燕清麗, 王旺, 郭金金 申請人:中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院