專利名稱：用于檢測新霉素、阿米卡星和巴龍霉素的單抗和酶聯(lián)免疫方法與試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能識別新霉素、阿米卡星和巴龍霉素的單克隆抗體和一種用于檢測新霉素、阿米卡星和巴龍霉素的酶聯(lián)免疫方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
氨基糖苷類(AMGs)抗生素是由鏈霉菌或小單孢菌培養(yǎng)液中提取，或以天然品為原料半合成制取而得到的一類水溶性堿性抗生素。目前獸醫(yī)臨床常用的有鏈霉素、慶大霉素、新霉素、卡那霉素、阿米卡星等。其對多數(shù)革蘭陰性桿菌顯示強力殺菌作用，對革蘭陽性細菌也有作用，主要敏感菌為腸桿菌敏感菌株，對鏈球菌、肝炎球菌、梭狀芽孢桿菌屬、立克次氏體有效。然而由于AMGs易在腎皮質(zhì)和內(nèi)耳外淋巴液蓄積而引起耳毒性和腎毒性以及由氨基糖苷類鈍化酶產(chǎn)生的微生物耐藥株較為嚴重，因此其在動物源性食品中的檢測日益引起人們的重視。鑒于AMGs的毒副作用，各個國家對AMGs的最大殘留限量都作了嚴格規(guī)定。酶聯(lián)免疫檢測方法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)因為具有簡單、 快速、靈敏、特異等優(yōu)點而被逐漸廣泛應(yīng)用于AMGs的快速檢測領(lǐng)域。但目前的ELISA方法主要集中在單殘留檢測方面，用一種抗體同時檢測結(jié)構(gòu)不同的AMGs的ELISA方法很少。因此，建立可以檢測多種AMGs的ELISA方法對于完善該類藥物的快速檢測具有重要的意義。申請?zhí)枮?00610171540. I的發(fā)明專利公開了一種檢測新霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒，該專利將新霉素和人血清白蛋白采用碳二亞胺(EDC)法進行偶聯(lián)得到免疫原；采用兔血清白蛋白為載體，新霉素為半抗原，用羧甲基羥胺-碳二亞胺法偶聯(lián)得到新霉素包被原， 所制備的多克隆抗體和單克隆抗體同樣只能識別新霉素，而且樣品的檢測時間較長。申請?zhí)枮?00710064347的發(fā)明專利公開了一種檢測新霉素藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒及方法，該專利采用直接活化蛋白的方法偶聯(lián)新霉素和牛血清白蛋白(bovine serum albu分鐘,BSA) 獲得免疫原，同樣的方法將新霉素和甲狀腺蛋白偶聯(lián)獲得包被原，所制備的單克隆抗體同樣僅能特異性識別新霉素，而且樣品處理時間和試劑沒有進行優(yōu)化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的是提供一種能同時識別新霉素、阿米卡星和巴龍霉素的單克隆抗體。本發(fā)明的第二個目的是利用該單克隆抗體，建立一種能用于新霉素、阿米卡星和巴龍霉素檢測的酶聯(lián)免疫方法。本發(fā)明的第三個目的是提供一種用于新霉素、阿米卡星和巴龍霉素檢測的試劑盒。本發(fā)明的第四個目的是提供所述單克隆抗體在制備檢測新霉素、阿米卡星和巴龍霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明的第五個目的是提供含有所述單克隆抗體的試劑盒在動物組織新霉素、阿
3米卡星和巴龍霉素殘留檢測中的應(yīng)用。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)一種能識別新霉素、阿米卡星和巴龍霉素的單克隆抗體，它是由保藏號為CCTCC NO C201144的雜交瘤細胞EDC/5G04所分泌的。 上述雜交瘤細胞EDC/5G04，保藏在位于湖北省武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏號為CCTCC NO :C201144。所用的免疫原是由半抗原新霉素與牛血清白蛋白偶聯(lián)制備的。進一步，本發(fā)明提供了一種同時檢測新霉素、阿米卡星和巴龍霉素的酶聯(lián)免疫檢測方法，該方法包括免疫原、包被原、抗體的制備以及樣品的處理和檢測等步驟，具體如下(I)將半抗原新霉素與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)得到免疫原；(2)將半抗原新霉素與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)得到包被原；(3)利用步驟(I)的免疫原免疫小鼠，通過細胞融合與篩選得到保藏號為CCTCC NO C201144 的雜交瘤細胞 EDC/5G04 ；(4)用保藏號為CCTCC NO C201144的雜交瘤細胞EDC/5G04制備單克隆抗體；(5)用步驟⑵的包被原包被固相載體(如酶標板)；(6)將待測樣品用磷酸鹽緩沖溶液O3BS,O. 1M，pHIO 11)提取、孵育、離心和稀釋得到待測物溶液；(7)對步驟￠)的待測物溶液進行酶聯(lián)免疫檢測，其中磷酸鹽緩沖溶液(O. 1M，pHIO 11)的組分及配比為=NaCl 20. 0g, KH2PO4 O. 4g， Na2HPO4 · 12H20 13. 4g，KCl O. 5g，用少量超純水溶解，然后定容至500mL。本發(fā)明以上述單克隆抗體和包被原作為核心試劑與常規(guī)的其他試劑組合，制成了能檢測新霉素、阿米卡星和巴龍霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒，結(jié)合上述酶聯(lián)免疫方法，實現(xiàn)了對新霉素、阿米卡星和巴龍霉素的酶聯(lián)免疫檢測。本發(fā)明的主要優(yōu)點是I、本發(fā)明制備的單克隆抗體能同時新霉素、阿米卡星和巴龍霉素，而現(xiàn)有專利文獻僅能單一識別新霉素。2、本發(fā)明涉及的組織樣品處理方法簡單，無需昂貴的儀器，無需有機試劑，對操作者無健康危害，且僅需要普通離心機即可，適合在基層操作。3、與現(xiàn)有技術(shù)相比，組織樣品處理時間短，檢測時間短，檢測效率高。


圖I為本發(fā)明載體蛋白BSA的基質(zhì)輔助激光解吸法檢測的質(zhì)譜圖。圖2為本發(fā)明免疫原的基質(zhì)輔助激光解吸法檢測的質(zhì)譜圖，結(jié)合圖I用于說明半抗原新霉素與BSA的偶聯(lián)效果。圖3為本發(fā)明的單克隆抗體與新霉素(NEO)標準品的間接競爭ELISA反應(yīng)曲線，X 軸為新霉素(NEO)標準溶液濃度對數(shù)值，Y軸為新霉素標準品溶液的光密度值除以“零”孔光密度值(Β/Β0)。
具體實施例方式
下面通過實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例I免疫原和包被原的制備I. I新霉素-BSA的合成稱取新霉素10. Omg和BSA100. Omg溶解在20mL PBS液中(ρΗ7· 4)，攪拌均勻，逐滴加入溶解在ImL純水中的50. Omg EDC，在室溫下攪拌反應(yīng)8小時。最后將反應(yīng)液轉(zhuǎn)入透析袋中，在PBS(pH7. 4)液中4°C透析4天，離心后冷凍干燥。如圖1、2所示，經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸法(MALDI-T0F-MS)鑒定偶聯(lián)成功，置_20°C保存?zhèn)溆谩. 2新霉素-OVA的合成稱取新霉素20. Omg和0VA200. Omg溶解在20mL PBS液(ρΗ7· 4)，攪拌均勻，然后緩慢加入溶解在ImL純水中的80. OOmgEDC0在室溫下攪拌反應(yīng)2小時。最后將反應(yīng)液轉(zhuǎn)入透析袋中，在PBS(pH7. 4)液中4°C透析4天。離心后冷凍干燥，置_20°C保存?zhèn)溆谩嵤├?單克隆抗體的制備雜交瘤細胞的制備參照楊漢春《動物免疫學》，以實施例I制備的免疫原新霉素-BSA免疫Balb/C小鼠(購自湖北省疾病預(yù)防控制中心實驗動物中心)，免疫程序為基礎(chǔ)免疫將免疫原與等體積的弗氏完全佐劑乳化后，于小鼠背部皮下多點注射，以后每間隔2 周加強免疫一次，換用不完全佐劑乳化。最后于融合前三天(最好于免疫結(jié)束后休整I月) 腹腔注射，強化免疫，抗原量加倍，不加佐劑。融合時，取經(jīng)最后強化免疫的Balb/C鼠一只，眼眶放血處死(收集血清，即為陽性血清)，在75%酒精中浸泡5分鐘消毒。無菌取出小鼠脾臟，分離出脾細胞，與新鮮制備的 SP2/0骨髓瘤細胞(SP2/0骨髓瘤細胞來自本實驗室)按1-2 X 107個SP2/0與108個免疫脾細胞(I 10 I 15)的比例于50mL離心管，用15mLRPMI-1640基礎(chǔ)液重懸細胞，1500r/ 分鐘離心5分鐘，洗細胞I次。離心的間隙將溫浴的培養(yǎng)基，溫浴的水，溫浴的PEG等放入超凈臺。然后取出滅菌的吸水紙，將裝有骨髓瘤細胞和免疫脾細胞的離心管上清倒盡后，倒扣在吸水紙上控干水滴，輕敲管底使細胞松動。打開計時器，用ImL吸管吸取O. SmLPEG,手持裝有混合細胞的離心管，將其放置在水浴中片刻，將PEG緩慢的滴加到混合細胞上，邊加邊輕輕攪拌，I分鐘內(nèi)加完，持續(xù)攪拌30秒。用吸管取IOmL基礎(chǔ)液，沿管壁緩慢加到融合細胞上，邊加邊輕輕搖動(不能吹打)，5分鐘內(nèi)分別加lmL，2mL, 3mL, 4mL,最后補加基礎(chǔ)液到40mL，加完后，蓋上蓋子，反復(fù)顛倒幾次，使細胞混勻。SOOr/分鐘5分鐘離心，棄上清。 吸取含有飼養(yǎng)細胞的HAT培養(yǎng)基，用吸管將離心管中的融合細胞輕輕攪拌起來，液面附近逐滴滴入到含飼養(yǎng)細胞的血清瓶中，攪拌混勻，動作要輕將細胞輕輕攪拌起來，千萬不要吹打。顛倒混勻。然后將細胞接種在細胞培養(yǎng)板上，每孔兩滴，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。一次融合可接種4 6塊96孔板。根據(jù)需要也可少種，一般按SP2/0的細胞數(shù)計算，每孔接種量約含104左右個SP2/0細胞。于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合的當天計為O天，前3天盡量不要動細胞板，保持培養(yǎng)箱內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。第3天每孔補加I滴HAT完全培養(yǎng)基；第5天每孔吸出1/2培養(yǎng)上清(100 μ L)，再加入I滴HT完全培養(yǎng)基；以后每隔2天同上法吸去1/2 3/4培養(yǎng)上清，在7天后換入HT完全培養(yǎng)基。待融合細胞集落長至培養(yǎng)孔1/10 1/5，同時用建立的間接ELISA方法和間接競爭ELISA方法進行篩選。與零藥物孔相比，藥物孔OD值能被抑制的判為陽性。根據(jù)抑制率和細胞集落生長狀況，選擇2 6個強陽性的僅有1-2個單集落的細胞孔，采用有限稀釋方法進行克隆化，經(jīng)過3 4次克隆，直至克隆陽性率為100%，最終篩選出分泌抗新霉素、阿米卡星和巴龍霉素的雜交瘤細胞。經(jīng)染色體記數(shù)，該細胞株的染色體平均數(shù)為102. 8。申請人將該雜交瘤細胞命名為EDC/5G04，并于2011年6月29日送交位于湖北省武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其保藏號為CCTCC NO :C201144。腹水單抗制備與鑒定在接種前7天取Balb/c小鼠數(shù)只，每只小鼠腹腔注射 O. 5ml弗氏不完全佐劑進行預(yù)處理。用RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基懸浮由保藏號為CCTCC NO C201144的雜交瘤細胞EDC/5G04擴大培養(yǎng)的細胞，并將細胞數(shù)調(diào)至1父106個/11^，每只小鼠腹腔接種O. 5ml。待小鼠腹部明顯膨大，精神變差，瀕死不動時采集腹水。按照文獻方法 (朱立平，陳學清.免疫學常用實驗方法.北京人民軍醫(yī)出版社，2000)，純化獲得單克隆抗體。采用購自ROCKLAND公司的鼠源單抗亞型鑒定試劑盒(Mouse Mab Isotyping Test Kit)對本發(fā)明所得到的單克隆抗體進行亞型鑒定，結(jié)果為小鼠IgGl亞型。實施例3新霉素間接競爭ELISA檢測方法的建立3. I試劑的配制(本實施例使用的試劑除另注明外均采用以下方法配制)碳酸鹽緩沖液(pH9. 6):準確稱取Na2CO3 I. 59g、NaHCO3 2. 93g，少量超純水溶解， 定容至1000mL。洗滌液(pH7.4):準確稱取 NaCl 8. 00g, KH2PO4 0. 20g, Na2HPO4 · Iffi2O 2. 90g, KC10. 20g，少量超純水溶解，加入吐溫20 0. 50mL，定容至1000mL。磷酸鹽緩沖液(ρΗ7·4):準確稱取 NaCl 8. 00g, KH2PO4 0. 20g, Na2HPO4 · 12H20 2. 90g, KCl 0. 20g,少量超純水溶解，定容至IOOOmL0封閉液準確稱取卵清蛋白10. OOg,加入IOOOmL磷酸鹽緩沖液，攪拌混勻直至蛋
白完全溶解。生理鹽水準確稱取NaCl 8. 50g,少量超純水溶解，定容至1000mL?？贵w稀釋液、酶標記抗體稀釋液和底物溶液均由武漢飛遠科技有限公司提供。終止液準確量取濃硫酸IOOmL,緩慢滴加到800mL超純水中。3. 2包被原濃度和抗體工作濃度的初步確定首先是通過方陣滴定的方法初步選擇包被原和抗體工作濃度的組合。使用碳酸鹽緩沖液將包被原新霉素-OVA倍比稀釋成8、4、2、1、0· 5,0. 25,0. 125,0. 0625 μ g/mL橫向包被酶標板；EDC/5G04單克隆抗體使用磷酸鹽緩沖液倍比稀釋成I : 1000、1 2000、 I 4000、I 8000、I 16000、I 32000、I 64000、I 128000、I 256000、I 512000 縱向加入酶標板。方陣滴定結(jié)果見表I初步選擇以下包被原濃度和抗體工作濃度組合(I, I 8000)、(1，I 16000)和(2，I 32000)。表1EDC/5G04單克隆抗體方陣滴定
權(quán)利要求
1.一種能識別新霉素、阿米卡星和巴龍霉素的單克隆抗體，其特征在于，它是由保藏號為CCTCC NO C201144雜交瘤細胞EDC/5G04所分泌的。
2.權(quán)利要求I所述的雜交瘤細胞EDC/5G04，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號為 CCTCC NO C201144o
3.包含權(quán)利要求I所述的單克隆抗體的試劑盒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，該試劑盒是用于檢測新霉素、阿米卡星和巴龍霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒。
5.一種用于檢測新霉素、阿米卡星和巴龍霉素的酶聯(lián)免疫方法，包括免疫原、包被原、 抗體的制備以及樣品的處理和檢測，其步驟如下(1)將半抗原新霉素與牛血清白蛋白偶聯(lián)得到免疫原；(2)將半抗原新霉素與卵清蛋白偶聯(lián)得到包被原；(3)利用步驟(I)的免疫原免疫小鼠，通過細胞融合與篩選得到保藏號為CCTCCNO C201144的雜交瘤細胞EDC/5G04 ；(4)用保藏號為CCTCCNO C201144的雜交瘤細胞EDC/5G04制備單克隆抗體；(5)用步驟(2)的包被原包被固相載體；(6)將待測樣品用O.1M、pHIO 11的磷酸鹽緩沖溶液提取、孵育、離心和稀釋得到待測物溶液；(7)對步驟￠)的待測物溶液進行酶聯(lián)免疫檢測。
6.權(quán)利要求I所述的單克隆抗體在制備檢測新霉素、阿米卡星和巴龍霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求3或4所述的試劑盒在動物組織新霉素、阿米卡星和巴龍霉素殘留檢測中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種能識別新霉素、阿米卡星和巴龍霉素的特異性單克隆抗體和一種用于檢測新霉素、阿米卡星和巴龍霉素的酶聯(lián)免疫方法及試劑盒。本發(fā)明的單克隆抗體是由雜交瘤細胞EDC/5G04所分泌的，該雜交瘤細胞保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號為CCTCC NOC201144。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫檢測方法包括免疫原、包被原、抗體的制備以及樣品的處理和檢測等步驟。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明制備的單克隆抗體可以同時識別新霉素、阿米卡星和巴龍霉素，提高了現(xiàn)有技術(shù)的檢測效率；動物組織樣品處理方法簡單、時間短。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫方法及試劑盒還具有檢測靈敏度高、精密度好、準確性好的特點。
文檔編號G01N33/577GK102585006SQ20121004520
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月27日
發(fā)明者劉振利, 廖峰, 彭大鵬, 戴夢紅, 潘源虎, 王玉蓮, 袁宗輝, 閆彩霞, 陳冬梅, 陶燕飛, 黃玲利 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學