專利名稱：適于轉化細胞的載體、重組細胞及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，具體地，涉及適于轉化細胞的載體、重組細胞及其用途。更具體地，本發(fā)明提供了一組適于轉化細胞的載體、兩種適于轉化細胞的載體、一種重組細胞及其制備方法、一種檢測樣本中二惡英的方法、一種用于檢測樣本中二惡英化合物的試劑盒、一種用于檢測樣本中二惡英化合物的系統(tǒng)以及一種篩選具有降解二惡英化合物活性的制劑的方法。
背景技術：
二惡英類物質，是包括多氯代二苯并二惡英(polychlorinateddibenzo-dioxins, PCDDs)、多氯代二苯并呋喃(polychlorinated dibenzo-furans, PCDFs)和共平面多氯聯(lián)苯(co-planar polychlorinated biphenyls, Co-PCBs)等一大類化合物的總稱(Larsen et al，2000)，且這三類化合物分別有75種、135種、209種異構體。二惡英類 污染物主要來源于有機物焚燒過程和農藥、化工生產過程的副產物。因其毒性極強，自然條件下極難降解，生物蓄積性高，并對人體內分泌、生殖和發(fā)育、神經(jīng)和免疫系統(tǒng)等都有重要影響，因此1997年被世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構認定為人類一級致癌物。二惡英類物質是一類全球性持久性有機污染物，普遍存在于大氣、水體、沉積物和土壤等環(huán)境介質中。環(huán)境介質中二惡英類物質的含量極低，其分析屬于超痕量、多組分分析，一直被視為現(xiàn)代有機分析的難點。目前，對二惡英化合物進行檢測的方法主要有化學檢測方法和生物檢測法。其中化學檢測法HRGC/HRMS，雖然能夠精確地將二惡英的所有成分濃度分析出來，但是整個分析測試過程費用高耗時長(檢測周期>7天/樣，檢測成本/I. 5萬元)，不利于日常檢測和毒性急性的快速篩查。生物檢測法，包括酶聯(lián)免疫法((enzyme immunoassay, EIA)、突光免疫分析法(dissociation-enhancement lanthanide fluoro immunoassay, DELFIA)、酶活力誘導法(EROD)和突光素酶報告基因法(chemical-activated luciferase geneexpression, CALUX)等。前三者由于實驗操作復雜、技術成熟度不高而難以推廣應用。而CALUX法由于其準確度好、精密度高、操作簡便易行而被用于歐盟、美國和日本等29個國家的水環(huán)境、土壤、食品、飼料中二惡英的檢測分析和篩查。但是該法仍然有較高的假陽性，且對低濃度二惡英物質感應不靈敏，檢測成本高，耗時長。因此，目前對二惡英類化合物進行檢測的方法仍有待改進。
發(fā)明內容
本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術中存在的技術問題之一。為此，基于二惡英類化合物的毒性機制，本發(fā)明提供了適于轉化細胞的載體、重組細胞及其用途，以便改進現(xiàn)有的CALUX 法。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一組適于轉化細胞的載體。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該組載體包括第一載體和第二載體。其中，第一載體包含第一核酸序列，該第一核酸序列包括編碼報告蛋白的序列，該報告蛋白具有可檢測的活性；以及二惡英響應區(qū)域，該二惡英響應區(qū)域包含二惡英應答元件，并且二惡英響應區(qū)域與第一核酸序列可操作地連接。第二載體包含第二核酸序列，該第二核酸序列包含編碼芳香烴受體的序列。利用本發(fā)明的一組適于轉化細胞的載體，能夠有效地將編碼報告蛋白的序列、二惡英應答元件以及編碼芳香烴受體的序列引入宿主細胞中，從而能夠有效地構建重組細胞，進而，在二惡英的誘導下，重組細胞能夠啟動報告基因的轉錄和表達，由此，利用該重組細胞能夠通過所表達報告蛋白的活性的檢測，有效地實現(xiàn)對二惡英類化合物的檢測。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種適于轉化細胞的載體。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該載體包括第一核酸序列，該第一核酸序列包括編碼報告蛋白的序列，該報告蛋白具有可檢測的活性；以及二惡英響應區(qū)域，該二惡英響應區(qū)域包含二惡英應答元件，并且二惡英響應區(qū)域與第一核酸序列可操作地連接。利用該載體，能夠有效地將編碼報告蛋白的序列和二惡英應答元件引入宿主細胞中，其中報告基因的轉錄和表達以及表達量是檢測 二惡英類化合物的指示，而二惡英應答元件是誘導報告基因表達的必要條件，因此，該載體適于轉化細胞，能夠用于構建檢測二惡英類化合物的重組細胞。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了另一種適于轉化細胞的載體。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該載體包含第二核酸序列，該第二核酸序列包含編碼芳香烴受體的序列。利用該載體，能夠有效地將編碼芳香烴受體的序列引入宿主細胞中，其中編碼芳香烴受體的序列所表達的芳香烴受體能夠有效地結合二惡英類化合物，并能夠誘導其下游基因的轉錄和表達，因此，該載體適于轉化細胞，能夠用于構建檢測二惡英類化合物的重組細胞。根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提供了一種重組細胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該重組細胞的基因組中包含第一核酸序列，該第一核酸序列包括編碼報告蛋白的序列，該報告蛋白具有可檢測的活性；以及二惡英響應區(qū)域，該二惡英響應區(qū)域包含二惡英應答元件，并且二惡英響應區(qū)域與第一核酸序列可操作地連接。在二惡英類化合物存在的情況下，該重組細胞中的第一核酸序列的轉錄能夠被啟動，從而表達報告蛋白，進而可以通過檢測報告蛋白的活性，獲得樣本中二惡英類化合物的信息，從而實現(xiàn)對樣本中二惡英類化合物的檢測。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種制備根據(jù)本發(fā)明實施例的重組細胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括使用根據(jù)本發(fā)明實施例的一組適于轉化細胞的載體轉化細胞。利用根據(jù)本發(fā)明實施例的制備重組細胞的方法，能夠有效地制備重組細胞，并且效率高，所得重組細胞能夠有效地應用于對樣本中二惡英類化合物的檢測。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了一種檢測樣本中二惡英化合物的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括下列步驟將樣本與根據(jù)本發(fā)明實施例的重組細胞接觸，優(yōu)選該重組細胞處于適于報告蛋白表達的培養(yǎng)基中，更優(yōu)選重組細胞處于適于報告蛋白表達的液體培養(yǎng)基中；將重組細胞在適于報告蛋白表達的條件下進行培養(yǎng)；以及檢測報告蛋白的活性，優(yōu)選對報告蛋白的活性進行定量檢測。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用該方法能夠方便有效地檢測樣本中的二惡英類化合物，并且需時少，成本低，靈敏度高，檢測結果準確，可重復性好。根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測樣本中二惡英化合物的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該試劑盒包括根據(jù)本發(fā)明實施例的重組細胞；以及適于報告蛋白表達的培養(yǎng)基，其中，任選地重組細胞呈選自干粉、固定在載體上或者懸浮液至少一種的狀態(tài)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用該試劑盒能夠方便快速實現(xiàn)對樣本中二惡英化合物的檢測，并且成本低，需時少，靈敏度高，可重復性好，檢測結果準確、有效。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測樣本中二惡英化合物的系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該系統(tǒng)包括 反應模塊，該反應模塊內設置有根據(jù)本發(fā)明實施例的重組細胞，以便與待檢測的樣本接觸，并啟動重組細胞表達報告蛋白，優(yōu)選重組細胞處于適于報告蛋白表達的培養(yǎng)基中，更優(yōu)選重組細胞處于適于報告蛋白表達的液體培養(yǎng)基中；以及報告蛋白活性檢測模塊，用于對重組細胞所表達的報告蛋白的活性進行檢測，優(yōu)選對報告蛋白的活性進行定量檢測，其中，優(yōu)選二惡英化合物為選自2，3，7，8-T⑶D和PCB的至少一種，優(yōu)選進一步包括數(shù)據(jù)處理模塊，該數(shù)據(jù)處理模塊內預存有二惡英化合物濃度標準曲線，并且數(shù)據(jù)處理模塊與報告蛋白活性檢測模塊相連，該數(shù)據(jù)處理模塊根據(jù)報告蛋白活性的檢測結果得到量化的二惡英化合物檢測結果；以及任選地顯示模塊，該顯示模塊與數(shù)據(jù)處理模塊相連，用于顯示二惡英化合物檢測結果。根據(jù)本發(fā)明的實施例，利用該系統(tǒng)能夠方便地對樣本中的二惡英化合物進行檢測，并且可重復性好，需時少、成本低，靈敏度高，結果準確、有效。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種篩選具有降解二惡英化合物活性的制劑的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括下列步驟將含有二惡英化合物的樣本與懷疑具有降解二惡英化合物活性的制劑以及根據(jù)本發(fā)明實施例的重組細胞接觸，并測定重組細胞的報告蛋白活性，得到第一活性；將含有二惡英化合物的樣本在不存在該制劑時與重組細胞接觸，并測定重組細胞的報告蛋白活性，得到第二活性；其中，第一活性低于第二活性是該制劑具有降解二惡英化合物活性的指示，優(yōu)選二惡英化合物為選自2，3，7，8-Τ⑶D和PCB的至少一種；優(yōu)選將含有二惡英化合物的樣本與懷疑具有降解二惡英化合物活性的制劑以及重組細胞在適于報告蛋白表達的培養(yǎng)基中進行混合，并實時檢測二惡英化合物含量的變化。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用根據(jù)本發(fā)明實施例的篩選具有降解二惡英化合物活性的制劑的方法，能夠通過實時檢測二惡英化合物含量的變化，來反映制劑是否具有降解二惡英化合物的活性，從而能夠有效地篩選具有降解二惡英化合物活性的制劑，并且篩選的靈敏度非常聞。本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。
本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中圖I是根據(jù)二惡英毒性作用機制構建重組細胞的原理示意圖；圖2是根據(jù)本發(fā)明一個實施例的制備重組細胞的方法的原理示意圖；圖3是根據(jù)本發(fā)明一個實施例的兩種第一載體的載體圖譜；圖4是根據(jù)本發(fā)明一個實施例的第二載體的載體圖譜；圖5是根據(jù)根據(jù)本發(fā)明一個實施例的小鼠肝癌重組細胞株H印al_6DEGFP、Hepal-6ADEGFP在同等濃度二惡英標準樣品2，3，7，8-T⑶D誘導下的熒光照片；
圖6是根據(jù)根據(jù)本發(fā)明一個實施例的小鼠肝癌轉化細胞株H印al_6DLUC經(jīng)O. 01pg/mL-10000pg/mL 的二惡英標準樣品 2，3，7，8-TCDD 和 lpg/mL-Ι μ g/ml 的 PCBs 標準品處理24小時的發(fā)光強度結果；以及圖7是根據(jù)本發(fā)明一個實施例的小鼠肝癌轉化細胞株!fepal-6ADLUC經(jīng)O. Olpg/mL-10000pg/mL 的二惡英標準樣品 2，3，7，8-TCDD 和 lpg/mL-Ι μ g/ml 的 PCBs 標準品處理24小時的發(fā)光強度結果。
具體實施例方式下面詳細描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。需要說明的是，在本發(fā)明的描述中，除非另有明確的規(guī)定和限定，術語“相連”、“連 接”應做廣義理解，例如，可以是固定連接，一體地連接，也可以是可拆卸連接；可以是機械連接或電連接，也可以是兩個元件內部的連通；可以是直接相連，也可以通過中間媒介間接相連，對于本領域的普通技術人員而言，可以根據(jù)具體情況理解上述術語的具體含義。對于本領域的普通技術人員而言，可以具體情況理解上述術語在本發(fā)明中的具體含義。術語“第一”、“第二”等僅用于方便描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性。在本發(fā)明的描述中，除非另有說明，“多個”的含義是兩個或兩個以上。圖I顯示了二惡英類化學物質的毒性機制研究得最廣泛的AHR傳遞途徑二惡英進入細胞后，與芳香烴受體AhR結合，受體-配體復合物進入細胞核與核內AhR轉運蛋白ARNT結合形成異二聚體，隨后AhR/ARNT復合物與特異基因上游部位的增強子即二惡英反應元件(dioxin responsive element, DRE)結合，專一地誘導如細胞色素P450基因(CYPIAI, CYPIA2)的轉錄，CYPIAl, CYPIA2的表達產物芳烴羥化酶，可將前致癌物轉化為致癌物，從而促進機體癌癥的發(fā)生。其中二惡英反應元件的核心序列為5' -T/GNGCGTGA/CG/CA-3'，在辨識二惡英類物質的過程中發(fā)揮著重要作用。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，二惡英與芳香烴受體結合的量與其誘導基因表達的能力在一定范疇內呈正比，而AhR在細胞中的含量較低。因而，如圖2所示，發(fā)明人首次提出了利用高敏型重組細胞株，即AhR含量相對較高的小鼠肝癌細胞系，或者通過增加強啟動子的方法增加了 AhR的表達量，從而提高了檢測二惡英類物質的靈敏度。適于轉化細胞的載體根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一組適于轉化細胞的載體。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該組載體包括第一載體和第二載體。其中，參考圖3，第一載體包含第一核酸序列，該第一核酸序列包括編碼報告蛋白的序列，該報告蛋白具有可檢測的活性；以及二惡英響應區(qū)域，該二惡英響應區(qū)域包含二惡英應答元件，并且二惡英響應區(qū)域與第一核酸序列可操作地連接。參考圖4，第二載體包含第二核酸序列，該第二核酸序列包含編碼芳香烴受體的序列。利用本發(fā)明的一組適于轉化細胞的載體，能夠有效地將編碼報告蛋白的序列、二惡英應答元件以及編碼芳香烴受體的序列引入宿主細胞中，從而能夠有效地構建重組細胞，進而，在二惡英的誘導下，重組細胞能夠啟動報告基因的轉錄和表達，由此，利用該重組細胞能夠通過所表達報告蛋白的活性的檢測，有效地實現(xiàn)對二惡英類化合物的檢測。
在本發(fā)明中所使用的術語“細胞”應做廣義理解，其是任何能夠與載體發(fā)生同源重組，并且能夠在外加二惡英類化合物的調控下表達活性報告蛋白的細胞或者亞細胞組分，可以是天然細胞，也可以是人工構建的細胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，細胞的種類并不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的具體示例，細胞可以為小鼠肝癌細胞。根據(jù)本發(fā)明的一個具體示例，細胞為小鼠肝癌細胞!fepal-6，該細胞擴增快，培養(yǎng)容易，并且容易通過常規(guī)方法進行遺傳操作得到重組細胞，從而能夠進一步提高重組細胞檢測二惡英類化合物的效率。在本發(fā)明中所使用的術語“載體”是指這樣的一種遺傳載體，其包含特定核酸序列，并且能夠將目的核酸序列轉入宿主細胞中與宿主細胞的基因組發(fā)生同源重組以獲得重組細胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，載體的形式不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的具體示例，其可以為質粒、噬菌體、人工染色體、粘粒(Cosmid)、病毒的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，載體呈質粒的形式。質粒作為遺 傳載體，具有操作簡單，可以攜帶較大片段的性質，便于操作和處理。質粒的形式也不受特別限制，既可以是環(huán)形質粒，也可以是線性質粒，即可以是單鏈的，也可以是雙鏈的。本領域技術人員可以根據(jù)需要進行選擇。在本發(fā)明中所使用的術語“核酸”可以是任何包含脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于經(jīng)過修飾的或者未經(jīng)修飾的DNA、RNA，其長度不受任何特別限制。對于用于構建重組細胞的載體，優(yōu)選核酸為DNA，因為DNA相對于RNA而言，其更穩(wěn)定，并且易于操作。在本發(fā)明中所使用的術語“報告蛋白”是指這樣的一種蛋白質，其在表達后，能夠產生可以直接或者間接檢測的信號，進而能夠反映二惡英類化合物是否啟動了相應的調節(jié)機制。根據(jù)本發(fā)明的實施例，在本發(fā)明的該組適于轉化細胞的載體中，報告蛋白的類型不受特別限制，只要其具有可檢測的活性即可。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，報告蛋白可以為選自發(fā)光蛋白、熒光蛋白、酶的至少一種。具體地，根據(jù)本發(fā)明的實施例，報告蛋白可以是一種能夠產生光學信號的蛋白質例如發(fā)光蛋白或者熒光蛋白例如綠色熒光蛋白等，或者報告蛋白可以是一種能夠與底物相互作用以產生可檢測信號的酶。由此，可以根據(jù)常規(guī)的方法，對報告蛋白進行監(jiān)測。例如可以采用比色法、熒光法、生物發(fā)光法、化學發(fā)光法、酶聯(lián)免疫法(ELISA)及原位染色法對報告蛋白進行檢測。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，優(yōu)選地，報告蛋白可以為綠色熒光蛋白(gfp)、增強型綠色熒光蛋白(Egfp)以及熒光素酶的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的一個具體示例，優(yōu)選報告蛋白為增強型綠色熒光蛋白，由此，報告蛋白產生的熒光信號能夠更容易地被檢測到，從而使信號檢測更加靈敏，且其檢測在細胞原位狀態(tài)即可完成，簡單方便，并且能夠實現(xiàn)對二惡英類化合物的連續(xù)、實時檢測。在本文中所使用的術語“二惡英響應區(qū)域”的含義是這樣的一段序列，其能夠在存在二惡英時發(fā)揮其功能，即可以是發(fā)揮功能直接改變報告基因的表達，也可以是間接地改變報告基因的表達。根據(jù)本發(fā)明的實施例，二惡英響應區(qū)域可以由二惡英應答元件構建。構成二惡英響應區(qū)域的應答元件的數(shù)目并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，在本發(fā)明的該組適于轉化細胞的載體中，二惡英響應區(qū)域包含多個串聯(lián)的二惡英應答元件。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，二惡英應答元件具有如SEQ ID NO :1-7至少一項所示的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，二惡英響應區(qū)域可以進一步包含第一啟動子，該第一啟動子分別與二惡英應答元件和第一核酸序列可操作地相連。在本發(fā)明中所使用的術語“啟動子”指的是這樣一種核酸序列，其能夠指導與其可操縱地連接的核酸分子的轉錄。在本發(fā)明中所使用的術語“可操縱地”指的是核酸表達控制序列例如啟動子、信號序列、增強子等與目標核酸序列之間的功能連接，其中當合適的分子例如轉錄活化分子與表達控制序列結合時，表達控制序列影響著對應于目標核酸序列的核酸的轉錄和/或翻譯。由此，根據(jù)本發(fā)明的實施例，可以直接通過載體在宿主細胞中引入特定的第一啟動子，并且該第一啟動子可以用于啟動第一核酸序列的轉錄和表達，由此，可以提高所獲得的重組細胞對芳香族化合物的應答效率，并且擴大了宿主細胞的選擇范圍。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，第一啟動子可以為CMV啟動子或其功能等同體，其中“其功能等同體”是指能夠發(fā)揮與CMV啟動子相同或相似功能的啟動子，例如MMTV啟動子和SV40啟動子。根據(jù)本發(fā)明的一個具體示例，第一啟動子具有如SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，當采用SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列作為第一啟動子時，利用該組載體構建的重組細胞具有顯著突出的檢測靈敏度和精確度。根據(jù)本發(fā)明的實施例，在本發(fā)明的該組適于轉化細胞的載體中，第一載體可以進一步包含編碼第一篩選標記基因的核酸序列。在本發(fā)明中所使用的術語“篩選標記基因”指的是這樣的一種基因，其編碼的產物能夠賦予連同載體接受該基因的細胞一種特殊的性 質，該特殊的性質使得接受該基因的細胞與未接受該基因的細胞很容易被區(qū)分開。由此，便于篩選重組細胞。根據(jù)本發(fā)明實施例，第一篩選標記基因的種類不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的具體示例，第一篩選標記基因可以為選自編碼發(fā)光蛋白的基因和藥物抗性基因的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的實施例，第一篩選標記基因為藥物抗性基因，由此，能夠容易地通過重組細胞的抗藥性來進行篩選，例如在培養(yǎng)基中添加殺菌劑例如青霉素、卡那霉素等，則相應連同載體接受并表達殺菌劑抗性基因的細胞將能夠在培養(yǎng)基上存活下來。根據(jù)本發(fā)明的實施例，藥物抗性基因的類型不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，藥物抗性基因優(yōu)選為選自新霉素磷酸轉移酶和潮霉素B抗性基因的至少一種，由此，能夠進一步提高篩選重組細胞的效率。根據(jù)本發(fā)明的實施例，在本發(fā)明的該組適于轉化細胞的載體中，第二核酸序列具有如SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，第二載體可以進一步包括第二啟動子，該第二啟動子與第二核酸序列可操作地連接。根據(jù)本發(fā)明的實施例，第二啟動子的類型不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，第二啟動子可以為真核細胞啟動子。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，真核細胞啟動子可以為選自CAG啟動子和PGK啟動子的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，在本發(fā)明的該組適于轉化細胞的載體中，第二載體可以進一步包含增強子序列，該增強子序列與第二核酸序列可操作地連接。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，第二載體可以進一步包含內含子序列，該內含子序列與第二核酸序列可操作地連接。根據(jù)本發(fā)明的實施例，第二篩選標記基因的類型不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的具體示例，第二載體可以進一步包括編碼第二篩選標記基因的核酸序列。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，第二篩選標記基因可以為選自編碼發(fā)光蛋白的基因和藥物抗性基因的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的實施例，第一篩選標記基因與第二篩選標記基因不同。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種適于轉化細胞的載體。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該載體包括第一核酸序列，該第一核酸序列包括編碼報告蛋白的序列，該報告蛋白具有可檢測的活性；以及二惡英響應區(qū)域，該二惡英響應區(qū)域包含二惡英應答元件，并且二惡英響應區(qū)域與第一核酸序列可操作地連接。利用該載體，能夠有效地將編碼報告蛋白的序列和二惡英應答元件引入宿主細胞中，其中報告基因的轉錄和表達以及表達量是檢測二惡英類化合物的指示，而二惡英應答元件是誘導報告基因表達的必要條件，因此，該載體適于轉化細胞，能夠用于構建檢測二惡英類化合物的重組細胞。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，在上述載體中，細胞可以為小鼠肝癌細胞。根據(jù)本發(fā)明的一個具體示例，細胞為小鼠肝癌細胞Hepal-6。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，報告蛋白可以為選自發(fā)光蛋白、熒光蛋白、酶的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，優(yōu)選地，報告蛋白可以為綠色熒光蛋白(gfp)、增強型綠色熒光蛋白(Egfp)以及熒光素酶的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的一個具體示例，優(yōu)選報告蛋白為增強型綠色熒光蛋白。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，在該載體中，二惡英響應區(qū)域包含多個串聯(lián)的二惡英應答元件。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，二惡英應答元件具有如SEQ ID NO :1-7至少一項所示的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，二惡英響應區(qū)域可以進一步包含第一啟動子，該第一啟動子分別與二惡英應答元件和第一核酸序列可操作地相連。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，第一啟動子可以為CMV啟動子或其功能等同體，其中“其功能等同體”是指能夠發(fā)揮與CMV啟動子相同或相似功能的啟動子，例如MMTV啟動子和SV40啟動子。根據(jù)本發(fā)明的一個具體示例，第一啟動子具有如SEQ ID NO:8 所示的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該載體可以進一步包含編碼第一篩選標記基因的核酸序列。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，第一篩選標記基因基可以為選自編碼發(fā)光蛋白的基因和藥物抗性基因的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，藥物抗性基因優(yōu)選為選自新霉素磷酸轉移酶和潮霉素B抗性基因的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了另一種適于轉化細胞的載體。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該載體包含第二核酸序列，該第二核酸序列包含編碼芳香烴受體的序列。利用該載體，能夠有效地將編碼芳香烴受體的序列引入宿主細胞中，其中編碼芳香烴受體的序列所表達的芳香烴受體能夠有效地結合二惡英類化合物，并能夠誘導其下游基因的轉錄和表達，因此，該載體適于轉化細胞，能夠用于構建檢測二惡英類化合物的重組細胞。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，在上述載體中，細胞可以為小鼠肝癌細胞。根據(jù)本發(fā)明的一個具體示例，細胞為小鼠肝癌細胞Hepal-6。根據(jù)本發(fā)明的實施例，在該載體中，第二核酸核酸序列具有如SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，第二載體可以進一步包括第二啟動子，該第二啟動子與第二核酸序列可操作地連接。根據(jù)本發(fā)明的實施例，第二啟動子的類型不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，第二啟動子可以為真核細胞啟動子。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，真核細胞啟動子可以為選自CAG啟動子和PGK啟動子的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，在本發(fā)明的該組適于轉化細胞的載體中，第二載體可以進一步包含增強子序列，該增強子序列與第二核酸序列可操作地連接。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，第二載體可以進一步包含內含子序列，該內含子序列與第二核酸序列可操作地連接。根據(jù)本發(fā)明的實施例，第二篩選標記基因的類型不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的具體示例，第二載體可以進一步包括編碼第二篩選標記基因的核酸序列。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，第二篩選標記基因可以為選自編碼發(fā)光蛋白的基因和藥物抗性基因的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的實施例，第一篩選標記基因與第二篩選標記基因不同。重組細胞及其制備方法根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提供了一種重組細胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該重組細胞的基因組中包含第一核酸序列，該第一核酸序列包括編碼報告蛋白的序列，該報告蛋白具有可檢測的活性；以及二惡英響應區(qū)域，該二惡英響應區(qū)域包含二惡英應答元件，并且二惡英響應區(qū)域與第一核酸序列可操作地連接。在二惡英類化合物存在的情況下，該重組細胞中的第一核酸序列的轉錄能夠被啟動，從而表達報告蛋白，進而可以通過檢測報告蛋白的活性，獲得樣本中二惡英類化合物的信息，從而實現(xiàn)對樣本中二惡英類化合物的檢測。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，本發(fā)明的重組細胞可以為小鼠肝癌細胞。根據(jù)本發(fā)明的一個具體示例，本發(fā)明的重組細胞為小鼠肝癌細胞H印al-6。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，報告蛋白可以為選自發(fā)光蛋白、熒光蛋白、酶的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，優(yōu)選地，報告蛋白可以為綠色熒光蛋白(gfp)、增強型綠色熒光蛋白(Egfp)以及熒光素酶的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的一個具體示例，優(yōu)選報告蛋白為增強型綠色熒光蛋白。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，在本發(fā)明的重組細胞中，二惡英響應區(qū)域包含多個串聯(lián)的二惡英應答元件。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，二惡英應答元件具有如SEQ ID NO :1-7至少一項所示的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，二惡英響應區(qū)域可以進一步包含第一啟動子，該第一啟動子 分別與二惡英應答元件和第一核酸序列可操作地相連。根據(jù)本發(fā)明的一個具體示例，第一 啟動子具有如SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明的重組細胞過表達芳香烴受體。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，重組細胞的基因組中包含第二核酸序列，該第二核酸序列包含編碼芳香烴受體的序列核酸序列。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，重組細胞的基因組中包含第二啟動子，該第二啟動子與第二核酸序列可操作地連接。根據(jù)本發(fā)明的實施例，第二啟動子的類型不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，第二啟動子可以為真核細胞啟動子。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，真核細胞啟動子可以為選自CAG啟動子和PGK啟動子的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，本發(fā)明的重組細胞中可以進一步包含增強子序列，該增強子序列與第二核酸序列可操作地連接。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，組細胞中可以進一步包含內含子序列，該內含子序列與第二核酸序列可操作地連接。此外，根據(jù)本發(fā)明實施例的重組細胞為選自按照保藏號CCTCC C 2011112、CCTCCC2011113、CCTCC C 2011114和CCTCC C 2011115保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心的重組細胞的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種制備根據(jù)本發(fā)明實施例的重組細胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括使用根據(jù)本發(fā)明實施例的一組適于轉化細胞的載體轉化細胞。利用根據(jù)本發(fā)明實施例的制備重組細胞的方法，能夠有效地制備重組細胞，并且效率高，所得重組細胞能夠有效地應用于對樣本中二惡英類化合物的檢測。檢測樣本中二惡英的方法根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了一種檢測樣本中二惡英化合物的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括下列步驟將樣本與根據(jù)本發(fā)明實施例的重組細胞接觸，優(yōu)選該重組細胞處于適于報告蛋白表達的培養(yǎng)基中，更優(yōu)選重組細胞處于適于報告蛋白表達的液體培養(yǎng)基中；將重組細胞在適于報告蛋白表達的條件下進行培養(yǎng)；以及檢測報告蛋白的活性，優(yōu)選對報告蛋白的活性進行定量檢測。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用該方法能夠方便有效地檢測樣本中的二惡英類化合物。根據(jù)本發(fā)明的實施例，可以利用本發(fā)明的方法檢測的二惡英化合物的類型并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，樣本中的二惡英化合物可以為選自2，3，7，8-TCDD和PCB的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的實施例，在該方法中，將重組細胞與樣本接觸16-48小時，優(yōu)選16-24小時。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法可以進一步包括將報告蛋白的活性與預定的二惡英化合物濃度標準曲線進行比較，以確定樣本中二惡英化合物的含量。試劑盒根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測樣本中二惡英化合物的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該試劑盒包括根據(jù)本發(fā)明實施例的重組細胞；以及適于報告蛋白表達的培養(yǎng)基，其中，任選地重組細胞呈選自干粉、固定在載體上和固定在懸浮液中至少一種的狀態(tài)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用該試劑盒能夠方便快速實現(xiàn)對樣本中二惡英化合物的檢測，并且成本低，需時少，檢測結果準確、有效。用于檢測樣本中二惡英化合物的系統(tǒng)根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測樣本中二惡英化合物的系 統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該系統(tǒng)包括反應模塊和報告蛋白活性檢測模塊。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，反應模塊內設置有根據(jù)本發(fā)明實施例的重組細胞，以便與待檢測的樣本接觸，并啟動重組細胞表達報告蛋白，優(yōu)選重組細胞處于適于報告蛋白表達的培養(yǎng)基中，更優(yōu)選重組細胞處于適于報告蛋白表達的液體培養(yǎng)基中。根據(jù)本發(fā)明的實施例，報告蛋白活性檢測模塊用于對重組細胞所表達的報告蛋白的活性進行檢測，優(yōu)選對報告蛋白的活性進行定量檢測。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，優(yōu)選二惡英化合物為選自2，3，7，8-T⑶D和PCB的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的實施例，優(yōu)選該系統(tǒng)可以進一步包括數(shù)據(jù)處理模塊和任選的顯示模塊。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，數(shù)據(jù)處理模塊內預存有二惡英化合物濃度標準曲線，并且數(shù)據(jù)處理模塊與報告蛋白活性檢測模塊相連，該數(shù)據(jù)處理模塊根據(jù)報告蛋白活性的檢測結果得到量化的二惡英化合物檢測結果。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，其中該顯示模塊與數(shù)據(jù)處理模塊相連，用于顯示二惡英化合物檢測結果。根據(jù)本發(fā)明的實施例，利用該系統(tǒng)能夠方便地對樣本中的二惡英化合物進行檢測，并且可重復性好，需時少、成本低，靈敏度高，結果準確、有效。篩選具有降解二惡英化合物活性的制劑的方法根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種篩選具有降解二惡英化合物活性的制劑的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括下列步驟首先，將含有二惡英化合物的樣本與懷疑具有降解二惡英化合物活性的制劑以及根據(jù)本發(fā)明實施例的重組細胞接觸，并測定重組細胞的報告蛋白活性，得到第一活性。其次，將含有二惡英化合物的樣本在不存在該制劑時與重組細胞接觸，并測定重組細胞的報告蛋白活性，得到第二活性。其中，根據(jù)本發(fā)明的實施例，第一活性低于第二活性是該制劑具有降解二惡英化合物活性的指示。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，優(yōu)選二惡英化合物為選自2，3，7，8-T⑶D和PCB的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，優(yōu)選將含有二惡英化合物的樣本與懷疑具有降解二惡英化合物活性的制劑以及重組細胞在適于報告蛋白表達的培養(yǎng)基中進行混合，并實時檢測二惡英化合物含量的變化。
發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用根據(jù)本發(fā)明實施例的篩選具有降解二惡英化合物活性的制劑的方法，能夠通過實時檢測二惡英化合物含量的變化，來反映制劑是否具有降解二惡英化合物的活性，從而能夠有效地篩選具有降解二惡英化合物活性的制劑，并且篩選的靈敏度非常聞。需要說明的是，根據(jù)本發(fā)明實施例的適于轉化細胞的載體、重組細胞及其用途，是本申請的發(fā)明人經(jīng)過艱苦的創(chuàng)造性勞動和優(yōu)化工作而完成的。下面根據(jù)具體的實施例對本發(fā)明進行說明。需要說明的是，這些實施例僅僅是為了說明本發(fā)明，而不能以任何方式解釋為對本發(fā)明的限制。另外，除非特別說明，在下面的實施例中所涉及的方法為常規(guī)方法，所涉及的材料和制劑也為市售可得的。
下面參考具體實施例，對本發(fā)明進行說明，需要說明的是，這些實施例僅僅是說明性的，而不能理解為對本發(fā)明的限制。若未特別指明，實施例中所采用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段，可以參照《分子克隆實驗指南》第三版或者相關產品進行，所采用的試劑和產品也均為可商業(yè)獲得的。實驗材料I、二惡英(2，3，7，8-T⑶D)溶液(深圳疾病預防控制中心)，原始濃度為10 μ g/ml,在實驗前用二甲亞砜(DMSO)稀釋成不同濃度備用；2、PCBs標準品溶液(深圳疾病預防控制中心)，原始濃度為10 μ g/ml，實驗前用二甲亞砜(DMSO)稀釋成不同濃度備用；3、細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基杜貝可氏改良的依格氏培養(yǎng)基(DMEM)購自Invitrogen、胎牛血清(FBS)均購自 Thermo Fisher Scientific,細菌培養(yǎng)用培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基所使用的酵母粉、蛋白胨均購自0X0ID，氯化鈉、瓊脂均購自生工生物工程(上海)有限公司；4、培養(yǎng)及篩選用抗生素氨芐青霉素、卡那霉素均購自生工生物工程(上海)有限公司，G418、潮霉素均購自Invitrogen;5、限制性內切酶均購自NEB ；6、突光素酶檢測試劑盒Luciferase Assay System購自Promega公司；7、轉染試劑盒FuGENEk HD Transfection Reagent 購自 Roche 公司；8、載體pEGFP-Nl載體購自Promega公司，含有增強型綠色熒光蛋白基因(Egfp)及多克隆位點，作為綠色熒光蛋白基因的來源；pGL3_basic載體購自Promega公司，含有氨節(jié)青霉素抗性基因(Amplr)'突光素酶報告基因(Iuc+)及多克隆位點，作為熒光素酶報告基因的來源；pcDNA3. I載體購自Promega公司，含有氨節(jié)青霉素抗性基因(Amplr)'新霉素抗性基因(NecZ)、多克隆位點，作為重組報告基因載體的基本骨架；pCAG-intron含有氨芐青霉素抗性基因(Amp")、新霉素抗性基因(Neo")、CAG啟動子、內含子intron及多克隆位點，作為ahr過表達載體的基本骨架；以及附著子載體pCEP4購自Invitrogen公司，含有氨節(jié)青霉素抗性基因(Amp1·)、潮霉素抗性基因(HygD。
細胞株與培養(yǎng)條件用于轉染的宿主細胞是小鼠肝癌細胞H印al-6，購自北京協(xié)和細胞中心，其培養(yǎng)及傳代方式如下將細胞混合以添加有10%胎牛血清(FBS)的DMEM，并將所形成的細胞懸浮液加到培養(yǎng)皿中，于37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當培養(yǎng)皿底部80%-90%被培養(yǎng)的細胞覆蓋時，移除培養(yǎng)液并用3-5ml的無菌PBS緩沖液(pH7. 4)洗滌細胞，進一步加入Iml胰蛋白酶使細胞自培養(yǎng)皿底部脫離。之后加入新鮮的培養(yǎng)液并用移液管反復輕輕吹吸培養(yǎng)液使細胞分散開，然后將形成的細胞懸浮液分到培養(yǎng)皿(直徑IOcm)中，于37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。實施例I含有二惡英反應元件DRE和報告基因的重組細胞株H印al_6DEGFP、H印al-6DLUC的構建I、含有二惡英反應元件DRE和報告基因的重組載體pDRE-CMVmin-EGFP、pDRE-CMVmin-luc+ 的構建研究表明小鼠細胞色素P450基因CYPlAl上游有標號為A-F共6個二惡英反應元件，可以結合二惡英-芳香烴受體復合物，啟動CYPlAl的表達，其中B、D、E、F的結合及啟動效率較高(Amy Lusska et al. Protein-DNA Interactions at a Dioxin-responsiveEnhancer. 1993. The Journal of Biological Chemistry.)。通過基因合成的方法(Invitrogen公司)合成3段串聯(lián)的DRE序列和巨細胞病毒早期啟動子的基本元件CMVmin(為方便描述，在本文中記作3DRE+CMVmin)，為了后續(xù)操作方便，分別在片段的5’和3’端添力口 Bgl II和Hind III限制性內切酶酶切位點。通過Bgl 11和出11(1111酶切，將301 +01^1^11片段(195bp)插入到以Bgl II和Hind III酶切處理的載體P⑶NA3. I (5. 4kb)內，獲得重組載體pDRE-CMVmin (4. 7kb)，從而將p⑶NA3. I中的組成型啟動子置換為可受二惡英誘導的啟動子3DRE+CMVmin。接下來，將pDRE-CMVmin轉化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，涂布含有氨芐西林的LB固體平板，得到單克隆擴大培養(yǎng)后，使用離心柱型質粒小提試劑盒(TIANGEN)提取重組質粒，并以載體P⑶ΝΑ3. I為對照進行瓊脂糖凝膠電泳驗證，確認3DRE+CMVmin插入到了 pCDNA3. I 中。其中，3DRE+CMVmin序列如下AGATCT (TACCTGTGTGCGTGCCAAGG) ( T C T T C T C A C G C A A C T C C GA G)(CGCCGGGTTTGCGTGCGATGA)TAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCAAGCTT。其中，3個括號中所示的序列分別為3個DRE的序列，下劃線所示的序列則為CMVmin的序列。進一步通過BamHI和NotI雙酶切pEGFP_Nl獲得啟動子缺失的增強型綠色熒光蛋白基因egfp(700bp),將egfp插入到以BamH I和Not I切開的重組載體pDRE-CMVmin內，獲得含有二惡英反應元件DRE和增強型綠色熒光蛋白基因的重組載體pDRE-CMVmin-EGFP(5. 4kb)，其中增強型綠色熒光蛋白基因的表達受上游的二惡英反應元件和CMVmin調控，將連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，涂布含有氨芐西林的LB固體平板，得到單克隆擴大培養(yǎng)后，使用離心柱型質粒小提試劑盒(TIANGEN)提取重組質粒，并以載體pDRE-CMVmin為對照進行瓊脂糖凝膠電泳驗證，確認增強型綠色熒光蛋白基因egfp插入到pDRE-CMVmin 中。
利用與前述相同的方法，簡言之，通過BamH I和Hind III雙酶切pGL3_Basic獲得啟動子缺失的熒光素酶基因Iuc+ (I. 7kb)，并將將Iuc+插入到以BamH I和Hind III切開的重組載體pDRE-CMVmin內，獲得含有二惡英反應元件DRE和熒光素酶報告基因的重組載體pDRE-CMVmin-luc+ (6. 4kb)，其中熒光素酶報告基因的表達受上游的二惡英反應元件和CMVmin調控。接下來，將pDRE-CMVmin-luc+轉化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，涂布含有氨芐西林的LB固體平板，得到單克隆擴大培養(yǎng)后，使用離心柱型質粒小提試劑盒(TIANGEN)提取重組質粒，并以載體pDRE-CMVmin為對照進行瓊脂糖凝膠電泳驗證，確認熒光素酶報告基因Iuc+插入到pDRE-CMVmin中。使用無內毒素質粒提取試劑盒(TIANGEN)提取重組載體pDRE-CMVmin-EGFP和pDRE-CMVmin-luc+，儲存于 _20°C備用。2、利用重組載體pDRE-CMVmin-EGFP和pDRE-CMVmin-luc+分別轉染小鼠肝癌細胞株 Hepal-6
小鼠肝癌細胞株H印a 1-6的培養(yǎng)按照前面所述的方法進行。采用脂質體法進行轉染，使用Roche公司的FuGENE* HDTransfection Reagent,操作步驟及各試劑加量參照試劑盒說明書進行。將小鼠肝癌細胞H印al-6以一定密度接種于24孔板，待細胞匯合度在80%_90%時，移除培養(yǎng)液并更換新鮮的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液。使用FuGHNE''HD Transfection Reagent 轉染試劑與 pDRE-CMVmin-EGFP 混合，制備轉染混合液。轉染混合液組成如下
權利要求
1.一組適于轉化細胞的載體，其特征在于，包括 第一載體，所述第一載體包含 第一核酸序列，所述第一核酸序列包括編碼報告蛋白的序列，所述報告蛋白具有可檢測的活性；以及 二惡英響應區(qū)域，所述二惡英響應區(qū)域包含二惡英應答元件，并且所述二惡英響應區(qū)域與所述第一核酸序列可操作地連接， 第二載體，所述第二載體包含 第二核酸序列，所述第二核酸序列包含編碼芳香烴受體的序列，任選地，所述細胞為小鼠肝癌細胞， 任選地，所述細胞為小鼠肝癌細胞Hepal-6。
2.根據(jù)權利要求I所述的一組適于轉化細胞的載體，其特征在于，所述報告蛋白為選自發(fā)光蛋白、熒光蛋白、酶的至少一種， 任選地，所述報告蛋白為綠色熒光蛋白、增強型綠色熒光蛋白以及熒光素酶的至少一種， 任選地，所述報告蛋白為增強型綠色熒光蛋白， 任選地，所述二惡英響應區(qū)域包含多個串聯(lián)的二惡英應答元件， 任選地，所述二惡英應答元件具有如SEQ ID NO :1-7至少一項所示的核苷酸序列，任選地，所述二惡英響應區(qū)域進一步包含第一啟動子，所述第一啟動子分別與所述二惡英應答元件和所述第一核酸序列可操作地相連， 任選地，所述第一啟動子為CMV啟動子或其功能等同體， 任選地,所述第一啟動子具有如SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列， 任選地，所述第一載體進一步包含編碼第一篩選標記基因的核酸序列， 任選地，所述第一篩選標記基因為選自編碼發(fā)光蛋白的基因和藥物抗性基因的至少一種， 優(yōu)選地，所述藥物抗性基因為選自新霉素磷酸轉移酶和潮霉素B抗性基因的至少一種， 任選地，所述第二核酸序列具有如SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列， 任選地，所述第二載體進一步包括第二啟動子，所述第二啟動子與所述第二核酸序列可操作地連接， 任選地,所述第二啟動子為真核細胞啟動子， 任選地，所述真核細胞啟動子為選自CAG啟動子和PGK啟動子的至少一種， 任選地，所述第二載體進一步包含增強子序列，所述增強子序列與所述第二核酸序列可操作地連接， 任選地，所述第二載體進一步包含內含子序列，所述內含子序列與所述第二核酸序列可操作地連接， 任選地，所述第二載體進一步包括編碼第二篩選標記基因的核酸序列， 任選地，所述第二篩選標記基因為選自編碼發(fā)光蛋白的基因和藥物抗性基因的至少一種， 任選地，所述第一篩選標記基因與所述第二篩選標記基因不同。
3.—種適于轉化細胞的載體，其特征在于，包括 第一核酸序列，所述第一核酸序列包括編碼報告蛋白的序列，所述報告蛋白具有可檢測的活性；以及 二惡英響應區(qū)域，所述二惡英響應區(qū)域包含二惡英應答元件，并且所述二惡英響應區(qū)域與所述第一核酸序列可操作地連接， 任選地，所述細胞為小鼠肝癌細胞， 任選地，所述細胞為小鼠肝癌細胞H印al-6, 任選地，所述報告蛋白為選自發(fā)光蛋白、熒光蛋白、酶的至少一種， 任選地，所述報告蛋白為綠色熒光蛋白、增強型綠色熒光蛋白以及熒光素酶的至少一 種， 任選地，所述報告蛋白為增強型綠色熒光蛋白， 任選地，所述二惡英響應區(qū)域包含多個串聯(lián)的二惡英應答元件， 任選地，所述二惡英應答元件具有如SEQ ID NO :1-7至少一項所示的核苷酸序列，任選地，所述二惡英響應區(qū)域進一步包含第一啟動子，所述第一啟動子分別與所述二惡英應答元件和所述第一核酸序列可操作地相連， 任選地，所述第一啟動子為CMV啟動子或其功能等同體， 任選地,所述第一啟動子具有如SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列， 任選地，所述第一載體進一步包含編碼第一篩選標記基因的核酸序列， 任選地，所述第一篩選標記基因為選自編碼發(fā)光蛋白的基因和藥物抗性基因的至少一種， 任選地，所述藥物抗性基因優(yōu)選為選自新霉素磷酸轉移酶和潮霉素B抗性基因的至少一種。
4.一種適于轉化細胞的載體，其特征在于，包含第二核酸序列，所述第二核酸序列包含編碼芳香烴受體的序列， 任選地，所述細胞為小鼠肝癌細胞， 任選地，所述細胞為小鼠肝癌細胞H印al-6, 任選地，所述第二核酸核酸序列具有如SEQ IDNO 9所示的核苷酸序列， 任選地，所述第二載體進一步包括第二啟動子，所述第二啟動子與所述第二核酸序列可操作地連接， 任選地,所述第二啟動子為真核細胞啟動子， 任選地，所述真核細胞啟動子為選自CAG啟動子和PGK啟動子的至少一種， 任選地，所述第二載體進一步包含增強子序列，所述增強子序列與所述第二核酸序列可操作地連接， 任選地，所述第二載體進一步包含內含子序列，所述內含子序列與所述第二核酸序列可操作地連接， 任選地，所述第二載體進一步包括編碼第二篩選標記基因的核酸序列， 任選地，所述第二篩選標記基因為選自編碼發(fā)光蛋白的基因和藥物抗性基因的至少一種。
5.一種重組細胞，其特征在于，所述重組細胞的基因組中包含第一核酸序列，所述第一核酸序列包括編碼報告蛋白的序列，所述報告蛋白具有可檢測的活性；以及 二惡英響應區(qū)域，所述二惡英響應區(qū)域包含二惡英應答元件，并且所述二惡英響應區(qū)域與所述第一核酸序列可操作地連接， 任選地，所述細胞為小鼠肝癌細胞， 任選地，所述細胞為小鼠肝癌Hepal-6細胞， 任選地，所述報告蛋白為選自發(fā)光蛋白、熒光蛋白、酶的至少一種， 任選地，所述報告蛋白為綠色熒光蛋白、增強型綠色熒光蛋白以及熒光素酶的至少一種， 任選地，所述報告蛋白為增強型綠色熒光蛋白， 任選地，所述二惡英響應區(qū)域包含多個串聯(lián)的二惡英應答元件， 任選地，所述二惡英應答元件具有如SEQ ID NO :1-7至少一項所示的核苷酸序列，任選地，所述二惡英響應區(qū)域進一步包含第一啟動子，所述第一啟動子分別與所述二惡英應答元件和所述第一核酸序列可操作地相連， 任選地,所述第一啟動子具有如SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列， 任選地，所述二惡英響應區(qū)域具有如SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列， 任選地，所述重組細胞過表達芳香烴受體， 任選地，所述重組細胞的基因組中包含第二核酸序列，所述第二核酸序列包含編碼芳香烴受體的序列， 任選地，所述重組細胞的基因組中包含第二啟動子，所述第二啟動子與所述第二核酸序列可操作地連接， 任選地,所述第二啟動子為真核細胞啟動子， 任選地，所述真核細胞啟動子為選自CAG啟動子和PGK啟動子的至少一種， 任選地，所述重組細胞的基因組中進一步包含增強子序列，所述增強子序列與所述第二核酸序列可操作地連接， 任選地，所述重組細胞的基因組中進一步包含內含子序列，所述內含子序列與所述第二核酸序列可操作地連接， 任選地，所述重組細胞為選自按照保藏號CCTCC C 2011112,CCTCC C 2011113,CCTCCC2011114和CCTCC C 2011115保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心的重組細胞的至少一種。
6.一種制備權利要求5所述的重組細胞的方法，其特征在于，包括 使用權利要求I或2所述的一組適于轉化細胞的載體轉化細胞。
7.—種檢測樣本中二惡英化合物的方法，其特征在于，包括下列步驟 將所述樣本與根據(jù)權利要求5所述的重組細胞接觸，優(yōu)選所述重組細胞處于適于報告蛋白表達的培養(yǎng)基中，更優(yōu)選所述重組細胞處于適于報告蛋白表達的液體培養(yǎng)基中； 將所述重組細胞在適于所述報告蛋白表達的條件下進行培養(yǎng)；以及 檢測所述報告蛋白的活性，優(yōu)選對所述報告蛋白的活性進行定量檢測， 任選地，所述二惡英化合物為選自2，3，7，8-T⑶D和PCB的至少一種， 任選地，所述重組細胞與所述樣本接觸16-48小時,優(yōu)選16-24小時， 任選地，進一步包括將所述報告蛋白的活性與預定的二惡英化合物濃度標準曲線進行比較，以確定所述樣本中二惡英化合物的含量。
8.一種用于檢測樣本中二惡英化合物的試劑盒，其特征在于，包括 根據(jù)權利要求5所述的重組細胞；以及 適于報告蛋白表達的培養(yǎng)基， 其中， 任選地，所述重組細胞呈選自干粉、固定在載體上和固定在懸浮液中至少一種的狀態(tài)。
9.一種用于檢測樣本中二惡英化合物的系統(tǒng)，其特征在于，包括 反應模塊，所述反應模塊內設置有根據(jù)權利要求5所述的重組細胞，以便與待檢測的 樣本接觸，并啟動所述重組細胞表達報告蛋白，優(yōu)選所述重組細胞處于適于報告蛋白表達的培養(yǎng)基中，更優(yōu)選所述重組細胞處于適于報告蛋白表達的液體培養(yǎng)基中；以及 報告蛋白活性檢測模塊，用于對所述重組細胞所表達的報告蛋白的活性進行檢測，優(yōu)選對所述報告蛋白的活性進行定量檢測， 其中， 優(yōu)選所述二惡英化合物為選自2，3，7，8-T⑶D和PCB的至少一種， 優(yōu)選所述系統(tǒng)進一步包括數(shù)據(jù)處理模塊，所述數(shù)據(jù)處理模塊內預存有二惡英化合物濃度標準曲線，并且所述數(shù)據(jù)處理模塊與所述報告蛋白活性檢測模塊相連，所述數(shù)據(jù)處理模塊根據(jù)所述報告蛋白活性的檢測結果得到量化的二惡英化合物檢測結果；以及任選的顯示模塊，所述顯示模塊與所述數(shù)據(jù)處理模塊相連，用于顯示所述二惡英化合物檢測結果。
10.一種篩選具有降解二惡英化合物活性的制劑的方法，其特征在于，包括下列步驟 將含有二惡英化合物的樣本與懷疑具有降解二惡英化合物活性的制劑以及根據(jù)權利要求5所述的重組細胞接觸，并測定所述重組細胞的報告蛋白活性，得到第一活性； 將含有二惡英化合物的樣本在不存在所述制劑時與所述重組細胞接觸，并測定所述重組細胞的報告蛋白活性，得到第二活性； 其中， 第一活性低于所述第二活性是所述制劑具有降解二惡英化合物活性的指示， 優(yōu)選所述二惡英化合物為選自2，3，7，8-T⑶D和PCB的至少一種， 優(yōu)選將所述含有二惡英化合物的樣本與所述懷疑具有降解二惡英化合物活性的制劑以及所述重組細胞在適于所述報告蛋白表達的培養(yǎng)基中進行混合，并實時檢測所述二惡英化合物含量的變化。
全文摘要
提供了適于轉化細胞的載體、重組細胞及其用途。其中，一組適于轉化細胞的載體包括第一載體和第二載體。第一載體包含第一核酸序列，該第一核酸序列包括編碼報告蛋白的序列，該報告蛋白具有可檢測的活性；以及二惡英響應區(qū)域，該二惡英響應區(qū)域包含二惡英應答元件，并且二惡英響應區(qū)域與第一核酸序列可操作地連接。第二載體包含第二核酸序列，該第二核酸序列包含編碼芳香烴受體的序列。本發(fā)明的適于轉化細胞的載體和重組細胞，可用于二惡英類化合物的檢測。
文檔編號G01N33/68GK102851312SQ201210058478
公開日2013年1月2日 申請日期2012年3月7日 優(yōu)先權日2012年3月7日
發(fā)明者徐俊光, 李勇, 魏霞, 趙云, 戰(zhàn)麗萍, 張立通, 王俊, 汪建 申請人:深圳華大基因研究院, 深圳華大基因科技有限公司