專利名稱：一株調(diào)節(jié)人腸道中短鏈脂肪酸和總膽汁酸代謝的益生菌及檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一株可以調(diào)節(jié)人腸道中短鏈脂肪酸(SCFA)和總膽汁酸(TBA)代謝的益生菌。應用高效液相色譜(HPLC)技術檢測發(fā)現(xiàn)每日服用該菌株可以促進腸道中短鏈脂肪酸的代謝，應用酶聯(lián)免疫分析(ELISA)技術檢測發(fā)現(xiàn)每日服用該菌株可以抑制腸道中總膽汁酸的代謝，從而達到調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、改善腸道功能及調(diào)控基因表達等效果。
背景技術：
在人的腸道內(nèi)生存著1000多種總數(shù)在萬億以上的微生物，由這些微生物產(chǎn)生的化學物質(zhì)會影響人體的腸道菌群平衡、腸道功能及免疫機制，許多腸道微生物可防止胃腸內(nèi)的有害菌生長和防止感染。腸道微生物在人體健康和疾病方面有重要作用，如生理功能、營養(yǎng)、免疫反應等均和腸道菌群密切相關。益生菌是“當攝入一定量時能對宿主健康有作用的微生物活體”。早在上個世紀初(1907年)著名細菌學家諾貝爾獎得主梅切尼科夫即提出益生菌可以延年益壽的假說。益生菌在腸道內(nèi)的大量繁衍可調(diào)節(jié)紊亂的腸道菌群結構并提高機體的免疫能力進而幫助恢復健康水平。益生菌主要包括乳桿菌類、雙歧桿菌類和革蘭氏陽性球菌類。雙歧桿菌是于1899年由法國巴斯德研究所的Tissier首次從母乳喂養(yǎng)嬰兒糞便中分離出來的。益生菌的益生作用主要是通過直接或者間接的調(diào)整宿主腸道微生物的組成，激活宿主內(nèi)源性微生物群或者免疫系統(tǒng)的活性來實現(xiàn)的。短鏈脂肪酸主要來自大腸內(nèi)碳水化合物發(fā)酵和蛋白質(zhì)降解，腸道菌群通過產(chǎn)生SCFA，對人體多個器官和代謝產(chǎn)生較大的影響。SCFA是腸道中抑制病原微生物的重要因素，也可以促進鈉離子吸收、結腸細胞增殖和粘膜生長，提供代謝能源，增加腸血流，刺激胃腸激素生成，是結腸粘膜的重要營養(yǎng)素。最早Haring等通過腸道灌注SCFA治療慢性結腸炎取得很好的效果。Blottiere等研究表明SCFA通過直接調(diào)節(jié)基因影響腸道細胞增殖，對維持腸粘膜細胞健康非常重要。臨床研究表明，SCFA能較強地維護腸道形態(tài)及功能，并具有一定的治療作用，可以緩解和治療轉(zhuǎn)流性結腸炎、遠段潰瘍性結腸炎、袋囊炎、放射性結腸炎、短腸綜合征、全腸外營養(yǎng)所致腸失用等多種腸道外科疾病。通過測定生物基質(zhì)中SCFA的水平可以整體診斷體內(nèi)厭氧菌的變化，SCFA的含量也可以反映細菌活性?？傊琒CFA對機體具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、改善腸道功能等重要作用，因此SCFA的測定對營養(yǎng)、微生物和環(huán)境的研究有重要的意義。
SCFA含量的早期測定方法是滴定法，該法特異性不強，準確度差。隨著色譜技術的發(fā)展，高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜(GC)以及毛細管電泳(CE)已廣泛用于SCFA的測定。但極性大、揮發(fā)性強和水溶性大的特點使SCFA難以定量，生物基質(zhì)的復雜性也更增加了定量工作的難度。膽汁酸在肝臟中合成，貯存于膽囊中，釋放到小腸中?？偰懼?TBA)包括正常人肝臟合成的膽酸(CA)、鵝脫氧膽酸(CDCA)和代謝中產(chǎn)生的脫氧膽酸(DCA)、少量的石膽酸(LCA)及微量熊脫氧膽酸(UDCA)。在人糞便中的膽汁酸主要是DCA和LCA等次級膽汁酸。在某些情況下， DCA會在血液、膽汁和糞便中聚積，這就增加了患膽結石和結腸癌的風險，而且次級膽汁酸是惡性腫瘤的啟動子并對人體危害眾多。臨床研究表明，在腸道細菌、DCA含量和膽結石疾病之間存在著一定程度的聯(lián)系。細菌在人及動物體內(nèi)會受到胃酸、腸道膽汁酸等環(huán)境脅迫壓力，適應并耐受膽汁酸的毒性是人及動物腸道細菌保證自身存活的主要因素。所以更好地了解膽汁酸對細菌的抑制機制，對于發(fā)展在腸道高濃度游離膽汁酸情況下可存活的微生態(tài)制劑也很重要。近年來，乳酸菌或雙歧桿菌(Bifidobacterium)經(jīng)常作為益生菌或微生態(tài)制劑添加到人體中，它們可以很好的應對腸道內(nèi)的游離型膽汁酸的脅迫。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株調(diào)節(jié)腸道中短鏈脂肪酸和總膽汁酸代謝的益生菌及檢測方法。本發(fā)明的目的通過如下技術方案實現(xiàn)一株調(diào)節(jié)人腸道中短鏈脂肪酸和總膽汁酸代謝的益生菌，其特征在于所述益生菌(Lactobacillus pi ant arum P8)分離自內(nèi)蒙古牧民手工制作的酸奶中，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心，保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，分類命名植物乳桿菌，保藏號=CGMCC No. 5468，保藏日期為:2011年11月18日。調(diào)節(jié)人腸道中短鏈脂肪酸和總膽汁酸代謝的益生菌的檢測方法，其特征是包括下列步驟(I)、高效液相色譜用于短鏈脂肪酸的測定(I)儀器和材料AgilentllOO 液相色譜系統(tǒng)、Agilent 色譜工作站、5 μ m, 4. 6mmX 150mm 的 ZorbaxSB-Aq色譜柱、水的電阻大于17ΜΩ的水凈化系統(tǒng)、乙腈、甲醇、乙酸、丙酸、丁酸、濃度為O. 015mol/L磷酸-磷酸鹽緩沖液(pH = 2. 5);標樣濃度為O. lmol/L乙酸、丙酸、丁酸和濃度為O. 01mol/L的混合樣；(2)糞便樣品預處理把糞便樣品解凍后稱取Ig置于15mL PBS中充分懸浮，離心(350g) 5min,吸取ImL濁液加4mL濃度為lmol/L的鹽酸溶液振蕩30s，離心(4500g) IOmin,取清液經(jīng)0. 45 μ m膜過濾待進樣分析；⑶色譜條件流動相甲醇和緩沖溶液的體積比為3 97，所述緩沖溶液為濃度為0. 015mol/L、pH = 2. 5的磷酸緩沖液，流速為0. 5mL/min,紫外檢測波長為210nm，柱溫為35°C，進樣量為5 μ L0(II)ELISA用于總膽汁酸的測定(I)糞便樣品預處理把糞便樣品解凍后稱取Ig置于15mL PBS中充分懸浮，離心(350g) 5min,吸取5mL濁液，離心(8000g) IOmin,取ImL清液，離心20分鐘(2000-3000轉(zhuǎn)/分)，仔細收集上清，分裝后一份待檢測，其余冷凍備用；(2)標準品的稀釋與加樣
在酶標包被板上設標準品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標準品100 μ 1，然后在第一、第二孔中加標準品稀釋液50 μ 1，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取100 μ I分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50 μ 1，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50 μ I棄掉，再各取50 μ I分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50 μ I分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50 μ 1，混勻后從第七、第八孔中分別取50 μ I加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50 μ 1，混勻后從第九第十孔中各取50 μ I棄掉；稀釋后各孔加樣量都為50 μ 1，濃度分別為9 μ mol/L、6 μ mol/L、3 μ mol/L、I. 5 μ mol/L 和 0· 75 μ mol/L ；⑶加樣分別設空白孔，空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同，待測樣品孔；在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μ 1，然后再加待測樣品10 μ 1，樣品 最終稀釋度為5倍；加樣將樣品加于酶標板孔底部，晃動混勻；(4)溫育用封板膜封板后置37°C溫育30分鐘；(5)配液將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用；(6)洗滌揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復多次并拍干；(7)加酶每孔加入酶標試劑50 μ 1，空白孔除外。(8)溫育用封板膜封板后置37°C溫育30分鐘；(9)洗滌揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復多次并拍干；(10)顯色每孔先加入顯色劑Α50μ 1，再加入顯色劑Β50μ 1，震蕩混勻，37°C避光顯色15分鐘；(11)終止每孔加終止液50 μ I,終止反應；(12)測定以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度，在加終止液后15分鐘內(nèi)進行。本發(fā)明的效果是Lactobacillus pi ant arum P8分離自內(nèi)蒙古牧民手工制作的酸奶中，是一株經(jīng)過系統(tǒng)研究的益生菌。它有免疫調(diào)節(jié)特性，并已被用于發(fā)酵劑和乳制品的工業(yè)化生產(chǎn)，及作為活疫苗在醫(yī)學上提供更廣泛的治療。本發(fā)明征集志愿者服用Lactobacillus plantarum P8片劑,通過測定服用前、中、后的腸道中短鏈脂肪酸和總膽汁酸的含量來探究Lactobacillus plantarum P8對于人腸道中短鏈脂肪酸和膽汁酸是否具有調(diào)節(jié)作用，從而是否可以調(diào)節(jié)腸道功能。下面結合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步的說明。


圖I為益生菌Lactobacillus pi ant arum P8對志愿者SCFA代謝水平影響圖；圖2為益生菌Lactobacillus pi ant arum P8對志愿者膽汁酸代謝水平影響圖。
具體實施方式
—株調(diào)節(jié)人腸道中短鏈脂肪酸和總膽汁酸代謝的益生菌，所述益生菌(Lactobacillus plantarum P8)分離自內(nèi)蒙古牧民手工制作的酸奶中,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心，保藏號=CGMCC No. 5468，保藏日期為2011年11月18日。調(diào)節(jié)人腸道中短鏈脂肪酸和總膽汁酸代謝的益生菌的檢測方法，包括下列步驟I.短鏈脂肪酸的測定I. I試驗樣品的采集本試驗共征集33名健康志愿者，分為三組，青年組(Y group, 11人，男性5人，女性6人)，年齡25-29歲，平均年齡為26. 2±1.2歲；中年組(M group，12人，男性6人，女性6人)，年齡48-53歲，平均年齡為50. 9±1.4 ;老年組(E group，10人，男性5人，女性5人)，年齡71-80歲，平均年齡為75. 1±3. 3歲。男女比例為16 17。每個志愿者每天飯后咀食 Lactobacillus pi ant arum P8 片劑 3 粒，每粒含 Lactobacillus pi ant arum P8 活菌2 X IO10CFU,連續(xù)服用28天后停止服用。分別在第O天，14天，28天，以及停止服用后7天(連續(xù)35天)、14天(連續(xù)42天)、28天(連續(xù)56天)采集志愿者糞便。樣品采集后迅速放入液氮中速凍，并在48小時內(nèi)完成糞便樣品的預處理。I. 2糞便樣品預處理把糞便樣品解凍后稱取Ig置于15mL PBS中充分懸浮，離心(350g) 5min,吸取ImL濁液加4mL濃度為lmol/L的鹽酸溶液振蕩30s，離心(4500g) IOmin,取清液經(jīng)0. 45 μ m膜過濾待進樣分析。I. 3上樣分析通過對青年組、中年組和老年組志愿者O天,14天,28天,35天,42天和56天糞便中短鏈脂肪酸的測定發(fā)現(xiàn)，服用益生菌Lactobacillus plantarum P8前,青年組腸道內(nèi)乙酸含量>中年志愿者>老年志愿者，而三個組別志愿者丙酸丁酸代謝水平相當。服用益生菌Lactobacillus pi ant arum P8后,所有志愿者機體腸道內(nèi)乙酸丙酸代謝水平均顯著增高，且中年志愿者腸道內(nèi)乙酸含量增幅最大，老年志愿者腸道內(nèi)丙酸含量增幅最大。而丁酸代謝水平在各個時期的志愿者體內(nèi)變化均不顯著(圖1，注圖I中，“***”代表顯著水平P
<0. 0001)。2.總膽汁酸的測定2. I試驗樣品的采集本試驗共征集33名健康志愿者，分為三組，青年組(Y group, 11人，男性5人，女性6人)，年齡25-29歲，平均年齡為26. 2±1.2歲；中年組(M group，12人，男性6人，女性6人)，年齡48-53歲，平均年齡為50. 9± I. 4 ;老年組(Egroup，10人，男性5人，女性5人)，年齡71-80歲，平均年齡為75. I±3. 3歲。男女比例為16 17。每個志愿者每天飯后咀食 Lactobacillus pi ant arum P8 片劑 3 粒，每粒含 Lactobacillus pi ant arum P8 活菌2 X IO10CFU,連續(xù)服用28天后停止服用。分別在第O天，14天，28天，以及停止服用后7天(連續(xù)35天)、14天(連續(xù)42天)、28天(連續(xù)56天)采集志愿者糞便。樣品采集后 迅速放入液氮中速凍，并在48小時內(nèi)完成糞便樣品的預處理。2. 2糞便樣品預處理把糞便樣品解凍后稱取Ig置于15mL PBS中充分懸浮，離心(350g) 5min,吸取5mL濁液，離心(8000g) IOmin,取ImL清液，離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)，仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。2. 3標準品的稀釋與加樣 在酶標包被板上設標準品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標準品100 μ 1，然后在第一、第二孔中加標準品稀釋液50 μ 1，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取100 μ I分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50 μ 1，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50 μ I棄掉，再各取50 μ I分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50 μ I分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50 μ 1，混勻后從第七、第八孔中分別取50 μ I加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50 μ 1，混勻后從第九第十孔中各取50 μ I棄掉。(稀釋后各孔加樣量都為5(^1，濃度分別為91111101/1，61111101/1，3 μ mol/L,I. 5 μ mol/L,0. 75 μ mol/L)。2. 4 加樣分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μ 1，然后再加待測樣品10μ I (樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。2. 5溫育用封板膜封板后置37°C溫育30分鐘。2. 6配液將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。2. 7洗滌小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。2. 8加酶每孔加入酶標試劑50 μ 1，空白孔除外。2. 9溫育操作同4。2. 10洗滌操作同6。2. 11顯色每孔先加入顯色劑Α50μ 1，再加入顯色劑Β50μ 1，輕輕震蕩混勻，37°C避光顯色15分鐘.2. 12終止每孔加終止液50 μ 1，終止反應(此時藍色立轉(zhuǎn)黃色)。2. 13測定以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度(0D值)。測定應在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。通過對志愿者膽汁酸代謝水平測定發(fā)現(xiàn)(圖2，注圖2中，“***”代表顯著水平P
<0. 0001)，青年志愿者膽汁酸代謝水平低于中年志愿者低于老年志愿者。但是不論對于哪個年齡段，在服用益生菌Lactobacillus pi ant arum P8后,膽汁酸代謝水平均明顯降低。
權利要求
1.一株調(diào)節(jié)人腸道中短鏈脂肪酸和總膽汁酸代謝的益生菌，其特征在于所述益生菌(Lactobacillus plantarum P8)分離自內(nèi)蒙古牧民手工制作的酸奶中,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心，保藏號=CGMCC No. 5468，保藏日期為2011年11月18日。
2.調(diào)節(jié)人腸道中短鏈脂肪酸和總膽汁酸代謝的益生菌的檢測方法，其特征是包括下列步驟 (I)、高效液相色譜用于短鏈脂肪酸的測定 (1)儀器和材料 AgilentllOO 液相色譜系統(tǒng)、Agilent 色譜工作站、5 μ m, 4. 6mmX 1 50mm 的 ZorbaxSB-Aq色譜柱、水的電阻大于17ΜΩ的水凈化系統(tǒng)、乙腈、甲醇、乙酸、丙酸、丁酸、濃度為0.015mol/L磷酸-磷酸鹽緩沖液(pH = 2. 5);標樣濃度為O. lmol/L乙酸、丙酸、丁酸和濃度為O. Olmol/L的混合樣； (2)糞便樣品預處理 把糞便樣品解凍后稱取Ig置于15mL PBS中充分懸浮，離心(350g) 5min,吸取ImL濁液加4mL濃度為lmol/L的鹽酸溶液振蕩30s，離心(4500g) IOmin,取清液經(jīng)0. 45 μ m膜過濾待進樣分析； (3)色譜條件 流動相甲醇和緩沖溶液的體積比為3 97，所述緩沖溶液為濃度為0. 015mol/L、pH=2. 5的磷酸緩沖液，流速為0. 5mL/min,紫外檢測波長為210nm，柱溫為35°C，進樣量為5 μ L0 (II)ELISA用于總膽汁酸的測定 (1)糞便樣品預處理 把糞便樣品解凍后稱取Ig置于15mL PBS中充分懸浮，離心(350g) 5min,吸取5mL濁液，離心(8000g)10min,取ImL清液，離心20分鐘(2000-3000轉(zhuǎn)/分)，仔細收集上清，分裝后一份待檢測，其余冷凍備用； (2)標準品的稀釋與加樣 在酶標包被板上設標準品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標準品100 μ 1，然后在第一、第二孔中加標準品稀釋液50 μ 1，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取100 μ I分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μ 1，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50 μ I棄掉，再各取50 μ I分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50 μ I分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50 μ 1，混勻后從第七、第八孔中分別取50μ I加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50 μ 1，混勻后從第九第十孔中各取50 μ I棄掉；稀釋后各孔加樣量都為50μ 1，濃度分別為9ymol/L、6ymol/L、3ymol/L、1.5 μ mol/L 和 O. 75 μ mol/L ； (3)加樣 分別設空白孔，空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同，待測樣品孔；在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μ 1，然后再加待測樣品10μ 1，樣品最終稀釋度為5倍；加樣將樣品加于酶標板孔底部，晃動混勻；(4)溫育用封板膜封板后置37°C溫育30分鐘； (5)配液將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用； (6)洗滌揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復多次并拍干； (7)加酶每孔加入酶標試劑50μ 1，空白孔除外。
(8)溫育用封板膜封板后置37°C溫育30分鐘； (9)洗滌揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復多次并拍干； (10)顯色每孔先加入顯色劑Α50μ1，再加入顯色劑Β50μ 1，震蕩混勻，37°C避光顯色15分鐘； (11)終止每孔加終止液50μ I,終止反應； (12)測定以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度，在加終止液后15分鐘內(nèi)進行。
全文摘要
一株調(diào)節(jié)人腸道中短鏈脂肪酸和總膽汁酸代謝的益生菌，其特征在于所述益生菌(Lactobacillus plantarum P8)分離自內(nèi)蒙古牧民手工制作的酸奶中，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心，保藏號CGMCC No.5468，保藏日期為2011年11月18日。本發(fā)明還公開了其檢測方法。
文檔編號G01N33/543GK102618460SQ201210062159
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月9日 優(yōu)先權日2012年3月9日
發(fā)明者張佳超 申請人:北京和美科盛生物技術有限公司