專利名稱：一種沙拉沙星的熒光偏振免疫分析檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及沙拉沙星的一種熒光偏振免疫分析方法，屬于熒光偏振免疫分析檢測技術領域。
背景技術：
沙拉沙星(Sarafloxacin, SAR)屬于動物專用的氟喹諾酮類藥物,藥用其鹽酸鹽，具有廣譜抗菌、活性強、毒副作用小等特點，主要用于治療雞、豬的敏感細菌及支原體感染所致的疾病。據(jù)報道，鹽酸沙拉沙星的半衰期較長，在食品動物中的殘留會引起耐藥性，過量的藥物殘留也會直接危害動物及人體健康。我國規(guī)定動物性食品中獸藥沙拉沙星的最高殘留限量不超過80 u g/kg。目前，用于(氟)喹諾酮類藥物檢測的主要方法有四大類微生物法、儀器分析法、化學發(fā)光分析法及免疫分析法。微生物法適用于檢測高濃度的藥物殘留，主要用于大量樣品的快速篩選；常用的儀器分析法有高效液相色譜法、液-質(zhì)聯(lián)用分析法、高效毛細管電泳法等；此類分析法雖然具有高效、靈敏、快速準確的特點，但是使用的儀器昂貴，而且樣品前處理較繁瑣，不適合大量樣品的快速檢測；免疫分析法主要包括酶聯(lián)免疫吸附法、免疫親和柱色譜分析法、免疫傳感器分析法等。免疫分析法準確性好、靈敏度和特異性高、快速準確，可用于大量樣品的快速檢測，因此免疫分析法尤其是酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)現(xiàn)已廣泛應用于小分子農(nóng)藥以及獸藥的快速篩選殘留檢測。但是ELISA法大多屬于非均相的免疫分析法，由于在操作過程中需要分離結合的和未結合的抗原(抗體)或酶標記物，耗時較長，所以迫切需要發(fā)展一種更加簡便快速的分析方法。突光偏振免疫分析法(fluorescencepolarization immunoassay, FPIA)則具備了這一特點，是一種快速、簡便、高效、可靠的分析方法，而熒光偏振免疫分析法的關鍵是小分子熒光標記物的成功制備以及需要高特異性的抗體，當二者同時具備時，即可通過待測沙拉沙星和沙拉沙星熒光標記物同時競爭結合沙拉沙星抗體時偏振值的變化(競爭法)進行沙拉沙星的熒光偏振免疫分析，而國內(nèi)尚未有關沙拉沙星熒光標記物的制備以及沙拉沙星熒光偏振免疫分析方法建立的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是解決傳統(tǒng)分析方法操作復雜費時的問題，提供一種沙拉沙星熒光標記物的制備方法以及利用熒光標記物和高特異性的抗體建立的沙拉沙星熒光偏振免疫分析方法。本發(fā)明提供的沙拉沙星的熒光偏振免疫分析方法，利用沙拉沙星作為半抗原偶聯(lián)FITC熒光素合成熒光標記物，并以沙拉沙星標準品，沙拉沙星多克隆抗體為抗體，建立了沙拉沙星的熒光偏振免疫分析方法，步驟如下(I)沙拉沙星熒光標記物的制備a.稱取3 4mgSAR溶于由100 ii L水、500 ii L甲醇、50 U L三乙胺組成的混合溶劑中形成A液；b.稱取6mg異硫氰酸突光素FITC溶于600 U L甲醇中形成B液；C.取200 i! LB液逐滴加入A液中，震蕩，室溫避光過夜；d.次日，以CHCl3 MeOH = 2 I (V/V)為展開劑，室溫下對c步的反應液進行薄層層析，分離純化，紫外投射儀下觀察，選擇Rf = 0. I的條帶，用120 UL甲醇萃取，得到沙拉沙星熒光標記物；(2)沙拉沙星熒光標記物工作濃度的確定用2. 5mmol/L、pH = 8. 0的硼酸鹽緩沖液倍比稀釋得到不同濃度的沙拉沙星熒光標記物，檢測熒光偏振光強度，以5倍于空白溶液的偏振光強度所對應的濃度作為沙拉沙星熒光標記物的工作濃度；即最終選取1/12800的稀釋濃度，空白溶液選用2. 5mmol/L、pH=8. 0的硼酸鹽緩沖液；(3)沙拉沙星多克隆抗體的工作濃度的確定在每個試管中依次加入500 ii L用2. 5mmoL/L、pH = 8. 0的硼酸鹽緩沖液稀釋的比例分別為1/100，1/200，1/400，1/800，1/1600，1/3200的沙拉沙星多克隆抗體(本實驗室自制)，并依次加入500 u L步驟(2)確定的工作濃度的沙拉沙星熒光標記物，混勻后室溫孵育5min，檢測熒光偏振光強度，以最大偏振值70%對應的抗體濃度作為抗體的最佳工作濃度，即最終選取1/1600的稀釋濃度；⑷競爭鹽酸沙拉沙星用雙蒸水分別稀釋成濃度為1000,100,10,2. 5,1,0. 25,0. 1，
0.01 u g/mL的系列溶液并分別加入7個試管中，另設一個雙蒸水空白對照，40 y L/管；每管加入480 u L工作濃度的沙拉沙星熒光標記物，最后分別加入480 u L工作濃度的沙拉沙星多克隆抗體，混勻后室溫孵育5min，檢測其熒光偏振光強度；(5)建立沙拉沙星的標準抑制率曲線以沙拉沙星濃度為橫坐標，偏振光強度為縱坐標作圖，建立沙拉沙星抗體的抑制率曲線；(6)交叉反應率選擇與沙拉沙星結構類似的4種藥物測定交叉反應率。通過各種藥物的標準曲線分別得到其50%抑制濃度。用下式計算沙拉沙星抗體對其它藥物的交叉反應率。交叉反應越小，該方法對沙拉沙星的檢測特異性就越好。交叉反應率CR(%) = [IC5Q(SAR)/IC5tl(喹諾酮類藥物)]X 100%甲醇溶解恩諾沙星、加替沙星；pH = 5-6的稀醋酸溶解氧氟沙星；雙蒸水溶解鹽酸沙拉沙星、鹽酸環(huán)丙沙星，配制lmg/mL的標準品溶液，按照100，10，1,0. 1,0. 01,0. 001 u g/mL 一系列濃度，用蒸餾水進行稀釋，分別加入到6個試管中，另設一個雙蒸水空白對照，40 ii L/管；每管加入480 u L工作濃度的沙拉沙星熒光標記物，最后分別加入480 u L工作濃度的沙拉沙星多克隆抗體，混勻后室溫孵育5min，檢測其熒光偏振光強度。更詳細的步驟為I)配制 2. 5mmol/L、pH = 8. 0 硼酸鹽緩沖液Na2B4O7 IOH2O 0. 95g, Na N3 0. Ig 溶于 IL 雙蒸水2)熒光偏振免疫分析檢測方法的步驟如下
將鹽酸沙拉沙星標準品配制成lmg/mL水溶液，保存于4°C備用。配制硼酸鹽緩沖液(2. 5mmol/L、pH = 8. 0),以此為基礎配制系列反應液，用于稀釋熒光素標記物和沙拉沙
星多抗。a.熒光標記物工作濃度的確定稀釋不同濃度的熒光標記物，檢測其熒光偏振光強度，以5倍于空白溶液的偏振光強度所對應的濃度作為其工作濃度。實驗結果選擇I : 12800作為熒光標記物的工作濃度。
b.沙拉沙星多抗的工作濃度的確定在每個試管中依次加入500 ii L用2. 5mmol/L、pH = 8. 0的硼酸鹽緩沖液稀釋成不同濃度(1/100，1/200，1/400，1/800，1/1600，1/3200)的沙拉沙星多抗，并依次加入500 u L的工作濃度的突光標記物，混勻后室溫孵育5min,檢測突光偏振光強度,選取1/1600稀釋濃度作為抗體的工作濃度c.競爭將鹽酸沙拉沙星用雙蒸水稀釋成1000,100,10,2. 5,1,0. 25，0. 1,0. 01 U g/mL ^列濃度分別加入7個試管中，另設一個雙蒸水空白對照，40 L/管；然后向每個試管中加入480 u L工作濃度的熒光標記物，最后分別加入480 u L工作濃度的沙拉沙星多抗，混勻后室溫孵育5min,檢測其突光偏振光強度。d.測定用熒光偏振儀檢測其熒光偏振強度。(7)實際樣品的檢測a.樣品前處理將牛奶樣品在4°C，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，脫除脂肪層；將脫脂的牛奶用硼酸鹽緩沖液稀釋20倍，得到待測樣品。將豬尿樣品在4°C，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，取上清豬尿用硼酸鹽緩沖液稀釋20倍，得到待測樣品。b.檢測將處理后的樣品40 ii L/管；然后向每個試管中加入480 U L工作濃度的熒光標記物，最后分別加入480 u L工作濃度的沙拉沙星多抗，混勻后室溫孵育5min，檢測其熒光偏振光強度。本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果本發(fā)明建立的沙拉沙星熒光偏振免疫分析方法，為沙拉沙星殘留檢測提供了一種快速高效的分析手段，為沙拉沙星的熒光偏振免疫檢測奠定了基礎。由于采用的是多克隆抗體和便攜式的熒光偏振儀器，具有快速方便可靠的優(yōu)點。IC5tl為43. 23ppb，線形范圍為
5.7 327. 6ng/mL。免疫反應的高特異性和高親和性使熒光偏振免疫具有極高的選擇性和靈敏性。


圖I是用熒光偏振儀建立的沙拉沙星抗體的抑制率曲線。圖2是沙拉沙星抗體的標準曲線。
具體實施方式
以下以進一步說明本發(fā)明一、儀器電子分析天平(Sartorius)便攜式熒光偏振儀(SENTARY 100)可調(diào)式移液器(Eppendorf)渦旋混合器(其林貝爾)。二、試劑鹽酸沙拉沙星(Dr.Ehrensorfer GmbH)加替沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、鹽酸環(huán)丙沙星對照品(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)沙拉沙星多克隆抗體實驗室自制其他試劑均為分析純試劑(天津光復精細化工研究所)。三、實施例實施例I沙拉沙星標記物的制備a.稱取3 4mgSAR溶于由100 ii L水、500 ii L甲醇、50 U L三乙胺組成的混合溶劑中形成A液；b.稱取6mgFITC溶于600 U L甲醇中形成B液；c.取200 u LB液逐滴加入A液中，震蕩，室溫避光過夜。d.次日以混合溶劑CHCl3 MeOH =2 I (體積比)為展開劑，室溫下對過夜的反應液進行薄層層析，分離純化，紫外投射儀下觀察，選擇Rf = 0. I的條帶，用120 y LMeOH萃取得到沙拉沙星熒光標記物。實施例2沙拉沙星熒光標記物工作濃度的確定用2. 5mmol/L、pH = 8. 0的硼酸鹽緩沖液倍比稀釋得到不同濃度(1/400、1/800、1/1600、1/3200、1/6400、1/12800、1/25600)的沙拉沙星標記物，檢測熒光偏振光強度，以5倍左右于空白溶液的偏振光強度(空白偏振光強度為1861)作為其工作濃度；確定選取1/12800稀釋的濃度作為工作濃度，空白溶液選用2. 5mmol/L、pH = 8.0的硼酸鹽緩沖液。
權利要求
1. 一種沙拉沙星的熒光偏振免疫分析方法，其特征在于該方法利用沙拉沙星作為半抗原偶聯(lián)FITC熒光素合成熒光標記物，并以沙拉沙星為標準品、沙拉沙星多克隆抗體為抗體，建立了沙拉沙星的熒光偏振免疫分析方法，步驟如下 (1)沙拉沙星熒光標記物的制備 a.稱取3 4mgSAR溶于由100y L水、500 y L甲醇、50 y L三乙胺組成的混合溶劑中形成A液； b.稱取6mg異硫氰酸突光素(FITC)于600u L甲醇中形成B液； c.取200u LB液逐滴加入A液中，震蕩，室溫避光過夜； d.次日，以CHCl3 MeOH = 2 I (V/V)為展開劑，室溫下對c步的反應液進行薄層層析，分離純化得沙拉沙星熒光標記物； (2)沙拉沙星熒光標記物工作濃度的確定 用2. 5mmol/L、pH = 8. 0的硼酸鹽緩沖液倍比稀釋得到不同濃度的沙拉沙星熒光標記物，檢測熒光偏振光強度，以5倍于空白溶液的偏振光強度所對應的濃度作為沙拉沙星熒光標記物的工作濃度； (3)沙拉沙星多克隆抗體的工作濃度的確定 在每個試管中依次加入500 ii L用2. 5mmol/L、pH = 8. 0的硼酸鹽緩沖液稀釋的比例分別為1/100，1/200，1/400，1/800，1/1600，1/3200的沙拉沙星多克隆抗體，并依次加入、500 u L步驟(2)確定的工作濃度的沙拉沙星熒光標記物，混勻后室溫孵育5min，檢測熒光偏振光強度，以最大偏振值70%對應的抗體濃度作為抗體的最佳工作濃度； (4)競爭 鹽酸沙拉沙星用雙蒸水稀釋成系列溶液并分別加入試管中，另設一個雙蒸水空白對照，40 ii L/管；每管加入480 u L工作濃度的沙拉沙星熒光標記物，最后分別加入480 ii L工作濃度的沙拉沙星多克隆抗體，混勻后室溫孵育5min，檢測其熒光偏振光強度； (5)建立沙拉沙星抗體的抑制率曲線 以沙拉沙星濃度為橫坐標，偏振光強度為縱坐標作圖，建立沙拉沙星抗體的抑制率曲線. (6)交叉反應率 甲醇溶解恩諾沙星、加替沙星；pH = 5-6的稀醋酸溶解氧氟沙星；雙蒸水溶解鹽酸沙拉沙星、鹽酸環(huán)丙沙星，配制lmg/mL的標準品溶液，按照一系列濃度，用蒸餾水進行稀釋，分別加入到試管中，另設一個雙蒸水空白對照，40 y L/管；每管加入480 u L工作濃度的沙拉沙星熒光標記物，最后分別加入480 u L工作濃度的沙拉沙星多克隆抗體，混勻后室溫孵育5min，檢測其突光偏振光強度。
(7)實際樣品的檢測 取處理過的牛奶和豬尿40 ii L/管，再加入480 u L工作濃度的沙拉沙星熒光標記物，最后分別加入480 u L工作濃度的沙拉沙星多克隆抗體，混勻后室溫孵育5min，檢測其熒光偏振光強度。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以合成的沙拉沙星熒光標記物為基礎的沙拉沙星(Sarafloxacin,SAR)的熒光偏振免疫分析方法，屬于熒光偏振免疫檢測技術領域。本發(fā)明利用沙拉沙星作為半抗原偶聯(lián)異硫氰酸熒光素FITC，合成熒光標記物，并以沙拉沙星為標準品，沙拉沙星多克隆抗體為抗體，建立了沙拉沙星的熒光偏振免疫分析方法。本發(fā)明分析方法的建立，為沙拉沙星的含量分析供了一種快速高效的分析手段。本發(fā)明方法操作簡便、快速、成本低。IC50為43.23ng/mL，線性范圍為5.7~327.6ng/mL。免疫分析的高特異性和親和性使熒光偏振免疫分析方法具有極高的選擇性和靈敏度。
文檔編號G01N33/542GK102621297SQ20121006326
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月12日 優(yōu)先權日2012年3月12日
發(fā)明者孟萌, 宋佩, 尹永梅, 張?zhí)? 田溪, 薛虎寅, 郗日沫 申請人:南開大學