專利名稱：鑒別經典prrs與hprrs的液相阻斷elisa試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測豬繁殖 與呼吸綜合征病的試劑盒，特別是涉及ー種能夠鑒別經典豬藍耳病與高致病性豬藍耳病的液相阻斷ELISA制備方法，屬于ー種新的動物疫病診斷試劑，主要用于臨床豬繁殖與呼吸綜合征(俗稱藍耳病、PRRS)與高致病性豬藍耳病(HPRRS)的鑒別診斷及流行病學調查；應用于畜牧獸醫(yī)學領域。
背景技術：
豬藍耳病即豬繁通與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratorysyndrome,PRRS),是由豬繁通與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratorysyndrome virus, PRRSV)引起的一種以懷孕母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道癥狀為特征的一種傳染病。本病于1987年首先爆發(fā)于美國，隨后迅速傳到世界各地，現已成為危害規(guī)?；B(yǎng)豬生產的重要疫病之一。而2001年至今，我國毎年都有部分地區(qū)不同程度的受到豬“高熱病”的危害，經ー系列的研究表明，引起“高熱病”的最主要病原為變異的高致病性的PRRSV。僅根據臨床癥狀和病變及流行病學特點很難做出診斷，因此PRRS的確診需要借助實驗室診斷技木，特別是新發(fā)生本病的地區(qū)和豬場。PRRSV屬套式病毒目，動脈炎病毒科，動脈炎病毒屬，單股正鏈有囊膜的RNA病毒，病毒粒子呈球形或卵圓形，直徑為45飛5nm，含有2(T35nm的核衣殼，呈二十面體對稱，外繞ー脂質雙層膜，表面有纖突，較小且不清楚。在我國分尚的毒株屬于美洲型，如VR2332株。經測序表明，與經典毒株相比,HPRRS病原的序列變化主要是在Nsp2區(qū)缺失了 30個氨基酸，并且致死率明顯高于經典毒株?？梢?，Nsp2中30個氨基酸的缺失與否，成為鑒別高致病性豬藍耳病與經典豬藍耳病的重要指標。目前針對豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測主要采用的技術方法有病毒分離、免疫過氧化物酶單層試驗(IPMA)、血清中和試驗(SVN)、間接熒光抗體試驗(IFA)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、膠體金技術、反轉錄、聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、等。上述檢測PRRSV抗體的技術多針對結構蛋白，而有關PRRSV非結構蛋白抗體的檢測方法還未見報道，且不便于經典豬藍耳病及高致病性豬藍耳病的鑒別檢測。這些限制了對豬藍耳病的預防控制，因此研制出ー種特異性強、靈敏度高、簡單易行的診斷方法迫在眉睫。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠鑒別經典PRRS與HPRRS的液相阻斷ELISA試劑盒，基于二者差異，利用固相酶聯免疫吸附試驗(ELISA)原理，以經典PRRSV特有抗原為包被抗原，結合單抗和辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG及其他配套試劑組成。其反應機理為包被抗原和樣品中抗經典PRRSV特有抗原的抗體結合導致單抗和抗原的結合量減少，通過酶標抗體形成“包被抗原+結合單抗+酶標抗體”復合物，加入顯色劑，通過酶催化反應顯色，顯色深淺與樣品中的檢測抗體含量成反比。當抑制率高于設定的臨界值時結果判為陽性，表明有抗經典PRRSV抗體存在。判定結果是這樣設定的抑制率PI=(0D#i_-0D#p) /0D#i_*100%，PI>20%對應的樣品為陽性，小于則為陰性。具有簡單、快速、敏感和特異性好等特點；適用于臨床鑒別經典豬藍耳病與高致病性豬藍耳病。本發(fā)明的技術方案是這樣實現的一種能夠鑒別經典PRRS與HPRRS的液相阻斷ELISA試劑盒，由96孔ELISA板、樣品稀釋液、20倍濃縮洗滌液、羊抗小鼠IgG-HRP結合物、結合單抗、終止液、底物A 、底物B 、陽性樣品、陰性樣品、蓋板膜組成，其特征在干其中結合單抗為抗經典豬藍耳病Nsp2蛋白特有30個氨基酸單克隆抗體2B9，其制備方法如下首先制備抗經典豬藍耳病Nsp2蛋白特有30個氨基酸單克隆抗體，利用雜交瘤技木通過細胞融合、細胞克隆篩選建立的抗經典PRRSV單克隆抗體2B9，所制備單抗只針對經典豬藍耳病Nsp2蛋白中30個氨基酸，而對高致病性PRRSV抗原無特異性反應，這就決定了試劑盒的特異性； 所述的96孔ELISA板上包被的抗原為由公司合成的經典藍耳病Nsp2蛋白區(qū)特有的30個氨基酸，用包被緩沖液將抗原稀釋到O. 7ug/mL, 37°C包被Ih后用含5%脫脂奶粉的PBS封閉Ih，PBS洗滌5次干燥后用鋁箔真空密封。本發(fā)明的積極效果是
I、具有生物安全性，其所使用包被抗原為公司合成的經典豬藍耳病Nsp2蛋白特有的30個氨基酸，檢測單抗2B9為小鼠誘生獲得，不含PRRSV，因此不存在散毒的危險。2、特異性強，檢測抗體2B9為敏感性和特異性較好的單克隆抗體，因此提高了試劑盒的敏感性和特異性。3、生產成本低，檢測單抗可由相應的雜交瘤細胞系通過注射Balb/c小鼠腹腔，誘生腹水，通過辛酸-硫酸銨純化而大量獲得。4、能夠良好鑒別經典PRRS與HPRRS，可用于豬場的凈化，和流行病學調查。


圖I為本發(fā)明的示意圖。
具體實施例方式下面結合具體實例對本發(fā)明做詳細說明一種能夠鑒別經典PRRS與HPRRS的液相阻斷ELISA試劑盒，由96孔ELISA板I、樣品稀釋液2、20倍濃縮洗滌液3、羊抗小鼠IgG-HRP結合物4、結合單抗5、終止液6、底物A 7、底物B 8、陽性樣品9、陰性樣品10、蓋板膜11組成，其特征在于其中結合單抗為抗經典豬藍耳病Nsp2蛋白特有30個氨基酸單克隆抗體2B9，其制備方法如下首先制備抗經典豬藍耳病Nsp2蛋白特有30個氨基酸單克隆抗體，利用雜交瘤技術通過細胞融合、細胞克隆篩選建立的抗經典PRRSV單克隆抗體2B9，所制備單抗只針對經典豬藍耳病Nsp2蛋白中30個氨基酸，而對高致病性PRRSV抗原無特異性反應，這就決定了試劑盒的特異性；
所述的96孔ELISA板上包被的抗原為由公司合成的經典藍耳病Nsp2蛋白區(qū)特有的30個氨基酸，用包被緩沖液將抗原稀釋到O. 7ug/mL, 37°C包被Ih后用含5%脫脂奶粉的PBS封閉Ih，PBS洗滌5次干燥后用鋁箔真空密封。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實施例I免疫原的制備
豬藍耳病Nsp2蛋白區(qū)30個氨基酸的缺失與否，是鑒別高致病性豬藍耳病與經典豬藍耳病的重要指標。本實驗通過公司合成方法合成作為抗原的經典豬藍耳病Nsp2蛋白區(qū)特有的30個氨基酸，并與BSA載體偶聯，作為制備單克隆抗體的免疫原。實施例2抗經典豬藍耳病Nsp2蛋白特有30個氨基酸的單克隆抗體的制備
I、動物免疫選擇6 — 8周齡健康Balb/c小鼠，將弗氏完全佐劑乳化的免疫原，每只小鼠腹腔注射50 μ g左右，14d后以弗氏不完全佐劑乳化免疫原蛋白腹腔注射100 μ g，最后一次加強免疫吋，直接腹腔注射100 μ g純化的免疫原蛋白，融合前3 4d尾靜脈注射SOyg純化的免疫原蛋白。2、細胞融合取免疫小鼠的脾細胞與SP2/0混合于融合管內，以300g離心lOmin，棄去上清,振蕩細胞,使兩種細胞盡量混合均勻,然后45s內緩慢滴加預熱的PEG溶液，再緩慢加入無血清的1640培養(yǎng)基終止融合，靜置后再以1000 r/min離心10 min，棄去上清后加入HAT培養(yǎng)基，使細胞懸浮并混勻，加入適量飼養(yǎng)細胞，于96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，第IOd換液并開始檢測篩選。
3、陽性雜交瘤細胞的篩選和克隆化陽性克隆的篩選采用間接ELISA，用合成的抗原蛋白包被，并以骨髄瘤細胞上清作為陰性對照進行平行篩選。對所獲陽性雜交瘤細胞的培養(yǎng)上清通過連續(xù)三次細胞克隆，最終獲得ー株雜交瘤細胞株2B9。4、腹水的制備0.5 mL的高壓滅菌的石蠟油注射到小鼠腹腔，7d后注入IO6個雜交瘤細胞于小鼠腹腔，7 10 d后，當小鼠腹部極度膨脹時抽取腹水，將收集好的腹水置370C 24h，隨后置4°C過夜，第二天將腹水離心，上清56°C滅活30min即可。5、單克隆抗體的純化用4倍體積醋酸緩沖液稀釋腹水，調至pH4. 5，緩慢滴加
3.3%的正辛酸，攪拌30 min,離心取上清，加入1/10體積的10倍PBS，調至pH7. 4，4°C預冷后，用45%飽和硫酸銨沉淀，離心后取沉淀，用PBS稀釋后移入透析袋，在50倍體積PBS中透析，透析期間多次換液，透析結束后，紫外分光光度計280 nm測定蛋白濃度并分裝凍存。6、抗經典豬藍耳病Nsp2蛋白特有30個氨基酸的單克隆抗體的特性鑒定
(I)腹水效價測定間接ELISA方法測定，細胞培養(yǎng)上清與腹水分別從10倍和100倍開始做梯度稀釋，同時分別以SP2/0細胞培養(yǎng)上清和腹水做同等稀釋度作為陰性對照。通過檢測得知2B9單抗的腹水效價為I X 106。(2)抗經典豬藍耳病Nsp2蛋白特有30個氨基酸的單克隆抗體的Ig亞類鑒定按鼠mAb Ig亞類檢測試劑盒的說明書進行。具體方法是將純化的單克隆抗體1000倍稀釋后包被酶標板，每孔100 μ L, 37°C孵育I h，洗滌后每孔加入1000倍稀釋的抗體亞類試劑100^し37で孵育I h，洗滌3遍。然后加入羊抗鼠IgG酶標ニ抗，37°C孵育I h，洗滌后加入底物顯色，確定單克隆抗體的亞類分別為IgG2a。(3)雜交瘤細胞株染色體的分析采用秋水仙素法對雜交瘤細胞株進行染色體分析,結果顯示2B9雜交瘤細胞的染色體數目為101條。(4)抗經典豬藍耳病Nsp2蛋白特有30個氨基酸的單克隆抗體特異性鑒定將所獲單克隆抗體分別與豬瘟病毒、豬細小病毒、偽狂犬病毒、豬流感病毒進行間接ELISA和HI試驗，檢測所得知制備的2B9單克隆抗體與其它病毒均無交叉反應性。實施例3阻斷ELISA方法的建立
I.反應程序的建立
(!)間接ELISA程序包被用PH9. 6碳酸緩沖液將合成的PRRSV特有抗原稀釋成O. 2 μ g/孔，以每孔100 μ L的量加入酶標板中，4 °C過夜。甩干包被液，PBST (含O. 05%Tween-20的PBS，pH7. 2)洗板3次。封閉加入5%脫脂牛奶封閉液，300 μ L/孔，370C 60min,甩干，洗滌液洗滌3次，300 μ L/孔，3min/次。加樣加入抗經典豬藍耳病Nsp2蛋白特有30個氨基酸的單抗2B9，每孔100 μ L, 37°C作用60 min ;洗滌液洗滌5次，300 μ L/孔，3min/次。加入稀釋5000倍的的羊抗鼠-HRP酶標ニ抗，每孔100yL，37°C作用45 min ;甩去液體、洗板，加入TMB，每孔100 μ L，室溫作用15 min ;加入I mol/L H2SO4 50 μ L終止反應，測定0D490nm值。(2)抗原最佳工作濃度的確定
將合成的經典PRRSV特有抗原做倍比稀釋，濃度分別為I. 6ug/mL,0. 8ug/mL,0. 4ug/mL,0. 2 ug/mL,0. lug/mL,0. 05 ug/mL, IOOug/孔，4で包被酶標板過夜。陰、陽性血清也同時做系列倍比稀釋I 20,1 40,1 80,1 :160，組成方陣，進行間接ELISA。各步37°C反應30min,顯色12 15 min后終止。在酶聯檢測儀上490 nm波長處測定樣本OD值。選擇陽性血清OD值在I左右且陽性OD值/陰性OD值(P/N)比值最大時的抗原包被濃度和抗體稀釋度為最佳工作濃度。確定最佳抗原包被濃度為O. 7ug/mL。2.阻斷 ELISA 程序
包被用PH9. 6碳酸緩沖液將合成的PRRSV特有抗原稀釋成O. 7 μ g/孔，以每孔100 μ L的量加入酶標板中，4°C過夜。甩干包被液，PBST (含O. 05%Tween-20的PBS, pH7. 2)洗板3次。封閉加入5%脫脂牛奶封閉液，300 μ L/孔，370C 60min,甩干，洗滌液洗滌3次，300 μ L/孔，3min/次。加樣I :加入被檢的豬血清，每孔100 μ L，37°C作用45 min ;甩去液體，洗滌液洗滌5次，300 μ L/孔，3min/次。加樣2 :加入抗經典豬藍耳病Nsp2蛋白特有30個氨基酸的單抗2B9，60000倍稀釋，每孔100 μ L，37°C作用60 min ;洗滌液洗滌5次，300 μ L/孔，3min/次。甩去液體、洗板，加入羊抗鼠-HRP酶標ニ抗，每孔100 μ L，37°C作用60 min;甩去液體、洗板，加入0PD，每孔100 μ L，室溫作用15 min ;加入I mol/L H2SO4 50 μ L終止反應，測定0D490nm值。3.阻斷ELISA最適反應條件的確定 (O ー抗、ニ抗最佳工作濃度的確定 用已確定的抗原最適工作濃度進行阻斷ELISA，方陣滴定法測定PRRSV單克隆杭體的最佳工作濃度和酶標抗體的參考工作濃度。將結合單抗和酶標ニ抗作不同稀釋度稀釋，各步37°C反應60 min，顯色12 15 min后終止。490 nm波長處測定樣本OD值。選擇OD值在I左右且陽性OD值/陰性OD值(P/N)比值最大時的ー抗和ニ抗稀釋度為最佳工作濃度。確定最佳ー抗工作濃度為60000倍稀釋，ニ抗為5000倍稀釋。(2)封閉液及作用時間的確定
用已確定的抗原、抗體及酶標ニ抗的最適工作濃度進行間接ELISA。分別用含2%脫脂奶粉的PBS、5%脫脂奶粉的PBS、10%血清、O. 05%Tween-20的PBS作為反應的封閉液及抗體稀釋液。37°C分別封閉30min、lh、2h。顯色12-15 min后終止。490 nm波長處測定各樣本OD值。比較各組的0D490值和P/N值，確定ELISA反應的最適封閉液及封閉時間。選擇5%脫脂奶粉的PBS作用Ih為最佳封閉液和作用時間。(3)阻斷ELISA敏感性試驗
判定標準的確定取20份經IDEXX PRRSV抗體檢測試劑盒檢測為PRRSV抗體陽性的豬血清，按I : 100稀釋后進行間接阻斷ELISA測定0D490nm值，規(guī)定以20份血清的平均0D490nm加3倍標準差作為陰陽性的臨界值，計算其抑制率。結果顯示抑制率大于20%為抗體陽性，抑制率小于20%為陰性作為判斷標準。
權利要求
1.一種能夠鑒別經典PRRS與HPRRS的液相阻斷ELISA試劑盒，由96孔ELISA板、樣品稀釋液、20倍濃縮洗滌液、羊抗小鼠IgG-HRP結合物、結合單抗、終止液、底物A、底物B、陽性樣品、陰性樣品、蓋板膜用相應的廣ロ瓶加以封裝，貼上標簽，組裝成試劑盒；其中樣品稀釋液為 NaCl 8. Og ；KH2PO4 O. 2g ；Na2HP04 · 12H20 2. 9g ；KC1 0. 2g 補加ニ餾水至 1000ml ;加入 O. 5ml Tween-20,最后 50ml 分裝；20 倍濃縮洗滌液為 NaCl 160. Og ；KH2PO4 4g ；Na2HPO4 · Iffi2O 58g ；KC1 4g 補加ニ餾水致 1000ml ;加入 IOml Tween-20,最后 50ml 分裝； 羊抗小鼠IgG-HRP結合物為IOml PBST加入2ul羊抗小鼠IgG-HRP ニ抗，然后加入4%PEG, 25ml 分裝； 終止液為2mol/L H2SO4濃硫酸44. 5ml,雙蒸水355. 5ml, IOml分裝； 底物A為TMB 200mg,無水こ醇100ml,加雙蒸水至1000ml, IOml分裝； 底物 B 為(O. lml/L 檸檬酸-O. 2ml/L 磷酸氫ニ納，pH5. 0-5. 4):Na2HP04 1 4. 60g，檸檬酸9.33g, O. 75%過氧化氫尿素6. 4ml,加三蒸水至1000ml,調至pH5. 0-5. 43, IOml分裝； 陽性樣品為將標準PRRSV陽性血清I :5稀釋于樣品稀釋液中，Iml分裝； 陰性樣品為將PRRSV陰性血清I :5稀釋于樣品稀釋液中，Iml分裝； 其特征在于結合單抗將純化的抗經典豬藍耳病Nsp2蛋白特有30個氨基酸的單抗2B9以60000倍稀釋于PBS中加入4%PEG, 25ml分裝； 其制備方法如下首先制備抗經典豬藍耳病Nsp2蛋白特有30個氨基酸的單克隆抗體，利用雜交瘤技術通過細胞融合、細胞克隆篩選建立的抗經典PRRSV單克隆抗體2B9，所制備單抗只針對經典豬藍耳病Nsp2蛋白特有30個氨基酸，而對高致病性PRRSV無特異性反應，這就決定了試劑盒的特異性；所述的96孔ELISA板上包被的抗原為由公司合成的經典藍耳病Nsp2蛋白區(qū)特有的30個氨基酸，用包被緩沖液將抗原稀釋到O. 7ug/mL, 37°C包被Ih后用含5%脫脂奶粉的PBS封閉Ih，PBS洗滌5次干燥后用鋁箔真空密封。
2.根據權利要求I中所述的ー種能夠鑒別經典PRRS與HPRRS的液相阻斷ELISA試劑盒，其特征在于所述的ELISA試劑盒的檢測方法是樣品中抗經典PRRSV特有抗原的抗體與包被抗原結合阻礙了結合單抗與包被抗原的結合，通過酶標抗體形成“包被抗原+結合單杭+酶標抗體”復合物，加入顯色劑，通過酶催化反應顯色，顯色深淺與樣品中的檢測抗體含量成反比；當抑制率超過設定的臨界值時結果判為陽性，表明有抗經典PRRSV抗體存在；判定結果是這樣設定的抑制率PI= (0D未抑制-OD樣品)/OD未抑制*100%，PI>20%對應的樣品為陽性，小于則為陰性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種能夠鑒別經典PRRS與HPRRS的液相阻斷ELISA試劑盒，其特征在于將待檢血清用樣品稀釋液2倍稀釋后100ul加入ELISA板中37℃孵育1h，用洗滌液清洗5次，每次2min；然后加入結合單抗每孔100ul，37℃孵育1h，洗滌液清洗5次，每次2min；然后加入羊抗小鼠IgG-HRP結合物37℃作用1h，洗滌液清洗5次，每次2min；然后加入顯色底物溶液，將底物A和底物B以11混合，100ul加入ELISA孔中，避光顯色15min，加入50ul終止液，測其OD490值。該試劑盒方法技術成熟，重復性強，能夠有效鑒別經典豬藍耳病與高致病性豬藍耳病抗體，一般研究人員即可完成。
文檔編號G01N33/577GK102721810SQ20121006952
公開日2012年10月10日 申請日期2012年3月16日 優(yōu)先權日2012年3月16日
發(fā)明者丁壯, 劉慧 , 呂字華, 宋德武, 楊閩楠, 母連志, 賽度, 黃志強 申請人:吉林大學