專利名稱：燕窩酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及燕窩及其相關(guān)產(chǎn)品的檢測，尤其涉及一種燕窩酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法。
背景技術(shù)：
燕窩是由雨燕科金絲燕及同屬類的唾液或者絨羽等混唾液凝結(jié)而成的巢窩，其產(chǎn)地分布于東南亞一帶，如中國、印尼、泰國、越南和馬來西亞等。燕窩是一種名貴中藥，具有養(yǎng)陰潤燥，補中益氣，入胃補脾， 化痰止咳等功能；燕窩含有豐富的活性糖蛋白，鈣、鐵、磷、碘及維生素等天然營養(yǎng)物和礦物質(zhì)，還具有的防止流感病毒，促進細(xì)胞生長和加強免疫系統(tǒng)功能等作用。由于燕窩的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值均較高，而且消費者對其需求日益增長，因此一些商販通過染色、漂白，或以銀耳、豬皮、瓊脂、果膠等摻假偽造。假冒偽劣的燕窩及其制品頻繁被曝光，而檢測燕窩及其相關(guān)產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)方法尚屬空白，因此，為保障消費者的合法權(quán)益和生命健康，完善市場秩序，完善燕窩及其相關(guān)產(chǎn)品的檢測方法迫在眉睫?，F(xiàn)有的燕窩及其相關(guān)產(chǎn)品檢測方法主要有
(1)PCR方法利用燕窩中特定基因片段進行PCR檢測，該方法特異性好；但無法做到定量檢測，而且燕窩制成品往往需要熱加工，容易導(dǎo)致樣品中DNA降解，從而使檢測結(jié)果出現(xiàn)假陰性；
(2)電泳方法基于燕窩蛋白質(zhì)圖譜進行分析，但抗基質(zhì)干擾能力差，靈敏度低，僅限于對燕盞進行檢測，無法用于燕窩制成品的檢測；
(3)特定組份分析法利用色譜、光譜等手段，通過分析燕窩中各種化學(xué)組份如特定元素、氨基酸、唾液酸、糖類等的含量鑒定其真假，但其特異性不高，易于被人為添加物干擾。因此，現(xiàn)有的檢測技術(shù)存在特異性不強，容易受人為添加物的干擾，無法進行定量分析，適用范圍窄，無法對燕窩含量不高、需高溫加工且基質(zhì)干擾較大的燕窩制成品進行有效的檢測，檢測操作繁瑣，檢測時間長，需要配備大型分析儀器且要求專業(yè)的操作人員等缺點。

發(fā)明內(nèi)容
為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，發(fā)明人預(yù)料不到地發(fā)現(xiàn)，通過提取唾液酸糖蛋白作為抗原，制備高度特異的抗燕窩唾液酸糖蛋白抗體，構(gòu)建的酶聯(lián)免疫試劑盒可廣泛應(yīng)用于燕窩及其相關(guān)產(chǎn)品的檢測，且具有特異性好，靈敏度高，抗基質(zhì)干擾效果好，可進行定量檢測，檢測結(jié)果準(zhǔn)確性好，操作簡單、快捷，檢測成本低等優(yōu)點。本發(fā)明提供一種燕窩酶聯(lián)免疫試劑盒，包括唾液酸糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)液、抗唾液酸糖蛋白抗體、酶標(biāo)二抗、酶標(biāo)板和底物顯色液。上述試劑均以工作液的形式提供，其中唾液酸糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)液包括系列梯度濃度的唾液酸糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，有利于減少使用者的實驗步驟，從而減小誤差。采用上述技術(shù)方案，可對燕窩及其相關(guān)產(chǎn)品進行高通量的定量檢測，使用方便，特異性好，靈敏度高，抗基質(zhì)干擾效果好，檢測成本低。作為本發(fā)明的進一步改進，所述酶標(biāo)二抗采用羊抗鼠1gG-HRP，購自武漢博士德，使用O. OlM pH7. 4的PBS以1:10000稀釋配成酶標(biāo)二抗工作液。作為本發(fā)明的進一步改進，所述酶標(biāo)板包被了唾液酸糖蛋白抗原。所述酶標(biāo)板通過將唾液酸糖蛋白抗原加入高吸附酶標(biāo)板，包被過夜，5%脫脂奶粉封閉后真空干燥獲得。此夕卜，也可將抗唾液酸糖蛋白抗體加入高吸附酶標(biāo)板，包被過夜，5%脫脂奶粉封閉后真空干燥獲得包被了抗唾液酸糖蛋白抗體的酶標(biāo)板。作為本發(fā)明的進一步改進，所述底物顯色液由顯色劑A和顯色劑B組成，所述顯色劑A采用雙氧水，所述顯色劑B采用四甲基聯(lián)苯胺。作為本發(fā)明的進一步改進，燕窩酶聯(lián)免疫試劑盒還包括洗滌液、稀釋液和終止液，所述洗滌液為PH7. 4的PBST (由PBS中加入吐溫-20獲得)，所述稀釋液為pH7. 4的PBS，所述終止液采用硫酸，上述試劑均以工作液的形式提供，可方便地進行現(xiàn)場檢測和大量樣本的篩查，也利于提供檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。本發(fā)明還提供燕窩酶聯(lián)免疫試劑盒的檢測方法，包括如下步驟
A)樣品前處理將樣品均質(zhì)，加入PBS超聲提取，離心，取上清液稀釋后得到樣品溶
液；
B )往包被了唾液酸糖蛋白抗原的酶標(biāo)板的相應(yīng)微孔中加入系列梯度濃度的唾液酸糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)液或樣品溶液，加入抗唾液酸糖蛋白抗體，孵育后洗滌、拍干，加入酶標(biāo)二抗，孵育后洗滌、拍干，加入底物顯色液，孵育后加入終止液，用酶標(biāo)儀測定OD值；
C)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，對樣品溶液的檢測結(jié)果進行分析。本發(fā)明的檢測原理為利用各類燕窩共有的唾液酸糖蛋白作為抗原，運用免疫學(xué)競爭法的原理進行檢測。檢測時，往預(yù)包被燕窩唾液酸糖蛋白的酶標(biāo)板微孔中加入唾液酸糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)液或樣品溶液，再加入特異性的抗唾液酸糖蛋白抗體，包被在酶標(biāo)板中的燕窩唾液酸糖蛋白和唾液酸糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)液或樣品溶液中的特征蛋白競爭性地與抗體結(jié)合，孵育后洗滌拍干；再加入酶標(biāo)二抗，形成抗原抗體復(fù)合物孵育后洗滌拍干；加入底物顯色液，孵育后加入終止液，在450nm波長下使用酶標(biāo)儀進行檢測，樣品中的燕窩唾液酸糖蛋白濃度與OD值成反比。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是抗唾液酸糖蛋白抗體針對的抗原決定簇耐熱，可對燕窩及其相關(guān)產(chǎn)品進行定量檢測，適用范圍廣，有利于消費者合法權(quán)益的保障；特異性好，靈敏度高，抗基質(zhì)干擾效果好，檢測結(jié)果準(zhǔn)確性好，重復(fù)性好；樣品的前處理簡單，檢測操作簡單，試劑均以工作液的形式提供，僅需普通的酶標(biāo)儀即可方便地進行大量樣本的篩查，無需配備大型分析儀器，檢測成本低。


圖1為燕窩唾液酸糖蛋白電泳圖；圖l-a為燕窩唾液酸糖蛋白SDS-PAGE圖，其中，I泳道為Marker, 2泳道為純化的燕窩唾液酸糖蛋白，3泳道為燕窩總蛋白；圖l_b為純化的燕窩唾液酸糖蛋白2-D PAGE圖。圖2為燕窩唾液酸糖蛋白與抗燕窩唾液酸糖蛋白單克隆抗體Western-Blotting圖；其中，I泳道為Marker, 2泳道為純化的燕窩唾液酸糖蛋白，3泳道為燕窩總蛋白。
圖3為燕窩酶聯(lián)免疫試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步詳細(xì)說明。實施例一目標(biāo)抗原的分離純化。目標(biāo)抗原為燕窩唾液酸糖蛋白，該蛋白由具有相同抗原決定簇但糖基化修飾程度不同的分子量分別為106kDa和128kDa的兩個蛋白組成，等電點< 3. O。將燕窩經(jīng)過7M尿素超聲提取lOmin，離心取上清，使用液相等點聚焦儀進行分離純化，目標(biāo)蛋白在正極沉淀，經(jīng)過去離子水洗滌后得到目標(biāo)蛋白。該目標(biāo)蛋白通過SDS-PAGE和2-D PAGE驗證，結(jié)果如圖I所示，未見其他雜蛋白條帶，純度滿足免疫要求。實施例二抗唾液酸糖蛋白抗體的制備和純化。用燕窩唾液酸糖蛋白分別免疫6周雌性balb/c鼠，每組3只。首次免疫注射時，分別100 μ g/mL的免疫抗原100 μ L，與等量弗氏完全佐劑充分乳化，腹腔直接注射。間隔兩周后，取用樣的抗原，與100 μ L不完全佐劑乳化，同樣方法注射。在細(xì)胞融合前Id或當(dāng)天拉頸處死昆明鼠，浸泡在70%酒精中，體表消毒；用大頭針固定昆明鼠在蠟板上，超凈工作臺上剪開腹部，用小鑷子挑起腹膜，注入5mL RPMI-1640完全培養(yǎng)液(由GIBICO RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液加入15%胎牛血清而得)，用手輕輕揉動腹腔，將其體內(nèi)液體用無菌吸管移入75mL HAT完全培養(yǎng)液(由74. 25mL RPMI-1640完全培養(yǎng)液加入O. 75mL 100 XHAT液而得)中，用吸管混勻，鋪24孔板，每孔加O. 5mL，置于37°C C02培養(yǎng)箱中。小鼠眼眶放血，收集血清，拉頸處死，70 %酒精浸泡消毒體表，無菌取出脾臟，放入RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液(購自GIBICO，貨號為A10491-01)中，并小心剔除筋膜及脂肪，剪碎，置于100目的不銹鋼篩內(nèi)，無菌研磨,釋放出單個脾細(xì)胞,吸取含有脾細(xì)胞的液體置于50mL無菌離心管中，離心。將骨髓瘤細(xì)胞和上述制備好的脾細(xì)胞以個數(shù)5 1的比例加入同一 50mL的離心管中，加入37°C溫浴的RPMI-1640不完全培養(yǎng)液(購自GIBICO，貨號為61870-036) 20mL，混合均勻，1500r/min離心6min，棄去上清，用手指輕擊離心管底部，使沉淀混勻如糊狀；用移液管取37°C預(yù)熱的PEG lmL，滴入離心管，靜置Imin后，于37°C水浴中在2min內(nèi)滴加RPMI-1640完全培養(yǎng)液10mL，1000r/min離心6min，棄去上清，加75mL HAT培養(yǎng)液，輕輕混勻，將混勻懸液分裝于有飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔板中，每孔O. 5mL,于37°C、5% C02飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育。融合后6、d，用HAT培養(yǎng)液半量換液I次，在12 14d后根據(jù)增殖情況改用RPMI-1640完全培養(yǎng)液；待細(xì)胞貼壁至占板孔1/3時，計雜交瘤細(xì)胞生長的孔數(shù)及細(xì)胞總數(shù)，取上清液，間接ELISA選擇效價高和間接競爭ELISA選擇藥物抑制強的陽性雜交瘤細(xì)胞。采用間接ELISA和間接競爭ELISA法進行陽性雜交瘤細(xì)胞篩選，顯示陽性并出現(xiàn)競爭抑制反應(yīng)的孔為產(chǎn)燕窩唾液酸糖蛋白抗體的孔，并可用于進一步的亞克隆。無菌條件下，洗脫陽性孔內(nèi)的細(xì)胞，用彎頭吸管將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至預(yù)先以飼養(yǎng)細(xì)胞鋪板的96孔培養(yǎng)板中，每個原始孔克隆成8孔，待細(xì)胞貼壁長滿1/2 1/3孔底后，取上清液，間接ELISA檢測；取呈陽性強的亞克隆，如此反復(fù)2飛次，待所克隆的8個孔上清液中抗體陽性率為100%時，挑取單細(xì)胞克隆，檢測為全陽性者轉(zhuǎn)移至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板或25mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶擴大培養(yǎng)，建株并以分裝、凍存。提前一周注射O. 5mL降植烷至Balb/c小鼠腹腔。取凍存細(xì)胞株，復(fù)蘇后，經(jīng)大量培養(yǎng)繁殖，收集細(xì)胞，用不完全培養(yǎng)基洗滌二次后，再用IOmL不完全培養(yǎng)基懸浮，計數(shù)；將細(xì)胞(每只小鼠lmL，含3. I X IO7個細(xì)胞)腹腔注射小鼠腹部，l(Tl5d后，待小鼠腹部明顯膨大時用16號注射器無菌采集腹水；2000r/min離心lOmin，去除上層脂肪和下層纖維蛋白及細(xì)胞，收集中層，分裝_70°C凍存?zhèn)溆萌「顾x心后的中層部分3mL，加入2倍體積的O. 06mol/L、pH 4. 5醋酸鈉緩沖液。將正辛酸逐滴慢慢加入樣品中，至終濃度33 μ g/mL腹水，邊加邊攪拌，加完后繼續(xù)攪拌30min,4°C下10000r/min離心30min,去沉淀(白蛋白和其它非IgG蛋白)。取上清經(jīng)O. 45μ m 微孔膜過濾，與 1/10 體積 10XPBS 混合(10XPBS 由 80gNaCl、2g KCl、lL5g Na2HP04、2g ΚΗ2Ρ04、0· 5845g EDTA用950mL蒸餾水溶解后，調(diào)pH至7. 4并定容至IOOOmL而得)，用lmol/L NaOH溶液調(diào)pH值到7. 4。上清冷卻到4°C，加硫酸銨至終濃度為0. 277g/mL。攪拌30min，4°C下10000 r/min離心30min，棄上清。用少量PBS溶液溶解沉淀，用50 100倍體積的PBS透析過夜，換液3次。得到純化后的抗唾液酸糖蛋白抗體，4°C下貯藏備用。純化后的抗唾液酸糖蛋白抗體經(jīng)Western-Blotting檢測，結(jié)果如圖2所示，該抗體和燕窩唾液酸糖蛋白特異性結(jié)合，未和燕窩其他蛋白產(chǎn)生交叉反應(yīng)。實施例三燕窩酶聯(lián)免疫試劑盒的構(gòu)建。酶標(biāo)板的包被將0. ImL lmg/L的目標(biāo)抗原(燕窩唾液酸糖蛋白)加入高吸附酶標(biāo)板，包被過夜，采用5%脫脂奶粉封閉2h，真空干燥?？雇僖核崽堑鞍卓贵w采用PBS以1:10000稀釋得到抗體工作液。酶標(biāo)二抗采用PBS以1:10000稀釋得到酶標(biāo)二抗工作液。底物顯色液由顯色劑A和顯色劑B等體積混勻而得；稱取17.2mg四甲基聯(lián)苯胺，加I mL DMSO溶解，然后加0. I M pH5. 5乙酸-醋酸鈉緩沖液66 mL，得到顯色劑A ;取雙蒸水100 mL,加30%雙氧水17 μ L，得到顯色劑B。本發(fā)明提供的燕窩酶聯(lián)免疫試劑盒包括唾液酸糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)液7瓶，濃度分別為
Oμ g/mL、I μ g/mL>2 μ g/mL>4 μ g/mL>8 μ g/mL、16 μ g/mL>32 μ g/mL ;抗唾液酸糖蛋白抗體；羊抗鼠IgG-HRP ;包被了燕窩唾液酸糖蛋白的酶標(biāo)板和由顯色劑A和顯色劑B組成的底物顯色液。為進一步方便燕窩及其相關(guān)產(chǎn)品的檢測，本發(fā)明提供的燕窩酶聯(lián)免疫試劑盒包括唾液酸糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)液7瓶，濃度分別為O μ g/mL、I μ g/mL,2 μ g/mL,4 μ g/mL,8 μ g/mL、16 μ g/mL、32 μ g/mL ;抗唾液酸糖蛋白抗體；羊抗鼠IgG-HRP ;包被了燕窩唾液酸糖蛋白的酶標(biāo)板；由顯色劑A和顯色劑B組成的底物顯色液；洗滌液；稀釋液和終止液。本發(fā)明提供的燕窩酶聯(lián)免疫試劑盒在4°C環(huán)境下貯藏，可保質(zhì)I年以上。實施例四燕窩酶聯(lián)免疫試劑盒對燕窩及其相關(guān)產(chǎn)品進行檢測。樣品前處理
1、燕盞將燕盞研磨至粉狀，稱取0.lg，加入IOmL 0. OlM pH7. 4的PBS超聲連續(xù)提取2min，離心，取上清液稀釋1000倍后，得到樣品檢測溶液；
2、燕窩制成品將燕窩制成品均質(zhì)，稱取lg，加入20mL0. OlM pH7. 4的PBS超聲連續(xù)提取2min，離心，取上清液為樣品檢測溶液，如果樣品檢測溶液的檢測結(jié)果超過線性范圍上限，需再酌情稀釋。燕窩酶聯(lián)免疫試劑盒進行檢測
1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，在室溫下平衡30min以上，各種試劑使用前均須搖
勻；
2、加系列濃度的唾液酸糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)液或樣品檢測溶液50ul到相應(yīng)的微孔中，標(biāo)準(zhǔn)液均需做2個平行試驗，然后加50 μ I抗體工作液，37°C下避光反應(yīng)30分鐘；
3、小心揭開蓋板膜，棄去微孔中液體，并將微孔中剩余殘液在吸水紙上拍干，往微孔中注滿洗滌液，輕輕振蕩，放置2分鐘，棄去微孔中液體，并在吸水紙上拍干，重復(fù)洗滌4次或機洗5次；
4、加100μ I酶標(biāo)二抗工作液到相應(yīng)的微孔中，37°C下避光反應(yīng)30分鐘，重復(fù)步驟3進行洗漆;
5、加100μ I底物顯色液到相應(yīng)的微孔中，并在37°C下避光反應(yīng)15分鐘；
6、加50μ I終止液到相應(yīng)的微孔中，使用酶標(biāo)儀于450nm波長下測定OD值。根據(jù)唾液酸糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)液的實驗數(shù)據(jù)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖3所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程R2X). 99，說明OD值與唾液酸糖蛋白濃度具有很好的線性關(guān)系。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程，計算出燕窩樣品中的唾液酸糖蛋白含量，結(jié)果如表I所示。
權(quán)利要求
1.一種燕窩酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于包括唾液酸糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)液、抗唾液酸糖蛋白抗體、酶標(biāo)二抗、酶標(biāo)板和底物顯色液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的燕窩酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述酶標(biāo)二抗采用羊抗鼠 IgG-HRP。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的燕窩酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述酶標(biāo)板包被了唾液酸糖蛋白抗原。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的燕窩酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述底物顯色液由顯色劑A和顯色劑B組成，所述顯色劑A采用雙氧水，所述顯色劑B采用四甲基聯(lián)苯胺。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的燕窩酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于還包括洗滌液、稀釋液和終止液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的燕窩酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述洗滌液為pH7.4的PBST，所述稀釋液為pH7. 4的PBS ;所述終止液采用硫酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求I至6中任一項所述的燕窩酶聯(lián)免疫試劑盒的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟 A)樣品前處理將樣品均質(zhì)，加入PBS超聲提取，離心，取上清液稀釋后得到樣品溶液； B)往包被了唾液酸糖蛋白抗原的酶標(biāo)板的相應(yīng)微孔中加入系列梯度濃度的唾液酸糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)液或樣品溶液，加入抗唾液酸糖蛋白抗體，孵育后洗滌、拍干，加入酶標(biāo)二抗，孵育后洗滌、拍干，加入底物顯色液，孵育后加入終止液，用酶標(biāo)儀測定OD值； C)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，對樣品溶液的檢測結(jié)果進行分析。
全文摘要
本發(fā)明提供一種燕窩酶聯(lián)免疫試劑盒，包括唾液酸糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)液、抗唾液酸糖蛋白抗體、酶標(biāo)二抗、酶標(biāo)板和底物顯色液。本發(fā)明可對燕窩及其相關(guān)產(chǎn)品進行定量檢測，適用范圍廣，特異性好，靈敏度高，抗基質(zhì)干擾效果好，檢測結(jié)果準(zhǔn)確性好，重復(fù)性好，可方便地進行現(xiàn)場檢測和大量樣本的篩查，檢測成本低。
文檔編號G01N33/68GK102621329SQ20121006974
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月16日
發(fā)明者嚴(yán)瓊英, 劉小青, 葉秀玲, 張世偉, 李蕓, 楊國武, 賴心田, 陳國培, 陳薇, 陳血劍, 陳雁 申請人:深圳市計量質(zhì)量檢測研究院