專利名稱：一種直接檢測il-6抗原的電化學免疫傳感器及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種免疫傳感器，特別涉及一種直接檢測IL-6的電化學免疫傳感器及制備方法和檢測應(yīng)用。
背景技術(shù)：
白細胞介素6(IL_6)可由淋巴細胞或非淋巴細胞產(chǎn)生，是一種多功能細胞因子，不僅在機體免疫應(yīng)答、急相反應(yīng)和造血控制中起重要作用，而且其失調(diào)產(chǎn)生與多種臨場疾病和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，如牛皮癬，風濕性關(guān)節(jié)炎，心血管疾病和炎性腸病。此外，其過高表達與幾種典型癌癥相關(guān)，如頭頸部鱗癌(HNSCC)、結(jié)腸癌、胃腸癌。然而白細胞介素6在正常人體內(nèi)濃度(6pg/ml)非常低，因此，對低濃度IL-6的檢測是該領(lǐng)域的一大挑戰(zhàn)。
生物醫(yī)學上關(guān)于白細胞介素6的常規(guī)臨床免疫分析方法主要有放射免疫分析法、酶聯(lián)免疫分析法、熒光免疫分析法、化學發(fā)光免疫分析法等。其中，放射免疫分析法靈敏度高，干擾少，應(yīng)用范圍寬，但實際壽命有限，并且其放射性標記物對人體有害；酶聯(lián)免疫分析法、熒光和化學發(fā)光免疫分析法在很大程度上促進了臨床免疫分析手段的自動化、智能化和網(wǎng)絡(luò)化，但這些方法需要價格昂貴的專用儀器設(shè)備，操作復雜，成本高，難以推廣使用。因此研發(fā)一種廉價、簡便且適用于現(xiàn)場直接定量的免疫測定技術(shù)極為重要。免疫傳感器檢測技術(shù)是將免疫檢測技術(shù)與傳感檢測技術(shù)相結(jié)合而形成的一類新型檢測技術(shù)，是生物傳感器領(lǐng)域發(fā)展最迅速的技術(shù)之一，具有靈敏度高、特異性強、檢測快速、使用簡便、低成本等許多有點。傳統(tǒng)的免疫傳感器測定技術(shù)分為兩類競爭測定和夾層測定。在競爭測定中，試樣中的抗原與抗原-探針復合物(通常稱作報道復合物)進行混合，然后，混合物中的抗原通過競爭與抗體結(jié)合。探針可以是放射性同位素、酶、熒光團。在夾層免疫測定技術(shù)中，試樣中的抗原與抗體結(jié)合，然后第二抗體-探針復合物與抗原結(jié)合。但上述方法需要對目標抗原進行處理，操作過程復雜并且耗費抗體。本發(fā)明通過在現(xiàn)場生長的碳納米管上電沉積金納米粒子作為工作電極，再在金納米粒子上自組裝上巰基乙酸分子層來固定anti-IL-6抗體，發(fā)展成一種高靈敏度、高特異性免疫傳感器，可以快速直接檢測液體試樣中目標抗原的濃度。碳納米管(CNTs)是一種具有一維納米管狀結(jié)構(gòu)的新型納米材料，它獨特的電子特性和表面結(jié)構(gòu)，能很好地促進生物電活性分子的電子傳遞，并易于固定生物大分子并能保持其活性。納米金顆粒具有比表面積大、生物親和性高等優(yōu)點，并具有導電作用和加快蛋白質(zhì)與電極之間的直接電子轉(zhuǎn)移，適合于構(gòu)建無需電子媒介物質(zhì)的直接電化學生物傳感器。目前，碳納米管和納米金作為電活性材料及載體已被廣泛應(yīng)用于電化學和生物傳感器中，愛爾蘭國立大學的Rusling教授的研究小組(Anal. Chem. 2010，82，3118)報道在高表面積、高傳導性的垂直碳納米管上固定anti-IL-6捕獲抗體，捕獲抗體附著在碳納米管末端，再與樣本中的IL-6目標抗原結(jié)合，接著一個被酶標記的第二抗體耦合物再與傳感器上的目標抗原結(jié)合，通過電化學方法檢測酶標記物的信號。另外，山東省氟化學和化工化學重點實驗室的魏琴教授課題組(Biosens. Bioelectron. 2011, 26, 3714)利用納米金大的比表面積和好的生物相容性等優(yōu)點，在納米金上固定生物分子，通過對鐵氰化鉀的電子轉(zhuǎn)移響應(yīng)電流信號來監(jiān)控。但鮮有在現(xiàn)場生長的碳納米管上直接電沉積納米金粒子構(gòu)建電化學免疫傳感器。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種簡單、廉價、高靈敏度且可以現(xiàn)場直接檢測的電化學免疫傳感器，提供所述IL-6免疫電化學傳感器的制備方法以及檢測應(yīng)用，本發(fā)明電化學傳感器以單壁碳納米管為基底，將金納米粒子沉積于單壁碳納米管上構(gòu)成單壁碳納米管/金納米粒子雜化電極，雜化電極用巰基乙酸修飾，再在巰基乙酸上組裝IL-6捕獲抗體。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種直接檢測IL-6的電化學免疫傳感器，所述傳感器按下述方法制備(I)單壁碳納米管以硅片或石英片為基底，以Fe/Mo納米粒子為催化劑，以乙醇作碳源，以200ml/ min流速的氫氣作為載氣和保護氣，將碳源帶入，于石英管中1000°C下反應(yīng)15min，獲得單壁碳納米管；所述Fe/Mo催化劑通過在辛基醚中熱分解Fe (CO)6和Mo (CO)6獲得(參見Chem. Mater. 2001，13，1008-1014);所述Fe/Mo納米粒子中Fe和Mo物質(zhì)的量之比為5 I ；
(2)單壁碳納米管/金納米粒子雜化電極將單壁碳納米管用銅絲連接作為工作電極，以鉬作為對電極，以摩爾濃度O. I IOmMHAuCl4水溶液(優(yōu)選ImM的HAuCl4水溶液)為電解液，在電壓為-O. IV -O. 5V下進行電化學沉積5 50s，獲得單壁碳納米管/金納米粒子雜化電極；(3)單壁碳納米管/金納米粒子雜化電極的修飾將單壁碳納米管/金納米粒子雜化電極浸泡在I IOmM (優(yōu)選5mM)的SHCH2C00H水溶液中，室溫下浸泡3 IOh (優(yōu)選5h)，取出，用水清洗，得清洗后的電極置于EDC/NHS混合水溶液中，室溫下浸泡10 30min(優(yōu)選IOmin)，取出用水清洗后，獲得修飾后的單壁碳納米管/金納米粒子雜化電極；所述EDC/NHS混合水溶液為I-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺的混合水溶液；(4)電化學免疫傳感器將步驟(3)獲得的修飾后的單壁碳納米管/金納米粒子雜化電極浸泡在10 100 μ g/ml (優(yōu)選10 μ g/ml)的IL-6捕獲抗體的PBS緩沖液(pH =7. 2)中，室溫(25°C )下浸泡2 8h (優(yōu)選5h)，取出，用Tween-20水溶液和PBS緩沖液交替清洗，獲得結(jié)合抗體的雜化電極，然后再將結(jié)合抗體的雜化電極浸泡在質(zhì)量濃度I 5%(優(yōu)選2 % )牛血清蛋白的PBS緩沖液(pH = 7. 2)中，室溫下浸泡O. 5 2h (優(yōu)選Ih)進行封閉，取出，用Tween-20水溶液和PBS緩沖液交替清洗，風干，獲得所述的電化學免疫傳感器。步驟(I)所述方法優(yōu)選為將硅基片浸入Fe/Mo納米粒子的庚烷溶液(Fe/Mo納米粒子的量以Fe物質(zhì)的量計，5mmol/L)，IOs后取出，晾干，轉(zhuǎn)移至石英管中，然后用加熱爐將石英管升溫到1000°C，以乙醇作碳源，以200ml/min流速的氫氣作為碳源的載氣和保護氣，將乙醇蒸汽(碳源)帶入石英管中，1000°C下反應(yīng)15min，在硅基片上獲得單壁碳納米管(SffCNTs)。步驟(I)所述單壁碳納米管為水平平行排列的陣列結(jié)構(gòu)，陣列密度控制在每100 μ M區(qū)間有4 50根單壁碳納米管，每根單壁碳納米管的長度位于100 μ m 2mm之間。步驟(2)所述單壁碳納米管/金納米粒子雜化電極上的金納米粒子為多級結(jié)構(gòu)的金枝晶，所述金納米粒子的負載量與沉積時間，電壓和含金溶液的濃度有關(guān)，本發(fā)明中金納米粒子的沉積條件需控制在所述的沉積時間、電壓、含金溶液的濃度范圍內(nèi)。步驟(2)所述電壓優(yōu)選為-O. 5V下進行電化學沉積8 15s，更優(yōu)選10s。步驟(3)所述EDC/NHS混合水溶液為1_乙基_3_ (3_ 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺與水混合，使I-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺終濃度為400mM, N-羥基琥珀酰亞胺終濃度為lOOmM。 步驟(4)所述用Tween-20水溶液和PBS緩沖液交替清洗的方法為用質(zhì)量濃度O. 01 O. 05% (優(yōu)選 O. 05% ) Tween-20 水溶液和 ρΗ7· O 7. 3 (優(yōu)選 ρΗ7· 2)的 PBS 緩沖液交替清洗5次，再用蒸餾水或超純水清洗5次。本發(fā)明提供一種所述的直接檢測IL-6的電化學免疫傳感器在檢測IL-6抗原中的應(yīng)用。進一步，所述的應(yīng)用推薦按如下步驟進行1)將電化學免疫傳感器置于IL-6抗原溶液中，37°C下浸泡(免疫結(jié)合)O. 5 2h (優(yōu)選O. 5h)，反應(yīng)結(jié)束后，取出傳感器用質(zhì)量濃度 O. 01 O. 05% (優(yōu)選 O. 05% )的 Tween-20 水溶液和 ρΗ7· O 7. 3 (優(yōu)選 ρΗ7· 2)的 PBS緩沖液交替清洗，獲得結(jié)合抗原的電化學傳感器；2)以步驟I)獲得的結(jié)合抗原的電化學傳感器作為工作電極，以鉬絲為對電極，以Ag/AgCl電極作參比電極，在鐵氰化鉀和氯化鉀混合溶液的電解液中，25°C下浸泡lh，采用電化學方法檢測電極表面上的電子傳遞電阻，根據(jù)電子傳遞電阻在結(jié)合IL-6抗原前后的變化，實現(xiàn)定量或定性檢測待檢測的IL-6抗原濃度。進一步，所述IL-6抗原溶液為I X 10_17 I X 10_13g/ml的IL-6抗原的PBS緩沖溶液，所述PBS緩沖溶液pH為7. O 7. 3 (優(yōu)選ρΗ7· 2)。所述鐵氰化鉀和氯化鉀混合溶液為鐵氰化鉀、氯化鉀和水的混合溶液，所述混合溶液中鐵氰化鉀終濃度為5mM，氯化鉀終濃度為O. ImM。所述電化學方法檢測為在頻率為IOOmHz IOkHz，電壓為O. 17V的條件下進行電解反應(yīng)，測試電極表面上的電子傳遞電阻。本發(fā)明所述直接檢測IL-6的電化學免疫傳感器檢測IL-6抗原的應(yīng)用中，根據(jù)電化學檢測方法檢測出待測溶液中抗原的電子傳遞阻抗，再根據(jù)電子傳遞阻抗與抗原濃度對數(shù)的標準曲線圖所得擬合計算公式R = 72. 19734+2. 91603*lg[C] (C為抗原濃度)，計算出待測溶液中抗原的濃度。本發(fā)明中所述的SWCNTs為單壁碳納米管(優(yōu)選單壁碳納米管的陣列密度為每
100μ M區(qū)間有15-30根，長度位于500 μ m Imm之間)，SWCNTs-Au為單壁碳納米管/金納米粒子雜化電極，anti-IL-6為白細胞介素6捕獲抗體(優(yōu)選來源于上海晶天生物科技有限公司)，IL-6抗原為白細胞介素6 (優(yōu)選來源于上海晶天生物科技有限公司)，EDC為I-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺，NHS為N-羥基琥珀酰亞胺，BSA為牛血清蛋白。本發(fā)明制備方法中的電解液可為常用的電解液，如5mM[Fe(CN)4]3_/4_ ;而所用的電化學檢測方法可為現(xiàn)有常規(guī)的電化學檢測方法，如電化學阻抗或脈沖伏安法，本發(fā)明優(yōu)選電化學阻抗的方法，可定量檢測電極表面的電子傳遞電阻。本發(fā)明利用金與巰基乙酸之間穩(wěn)定的Au-S鍵作用，巰基乙酸的羧基又與anti-IL-6抗體的氨基通過EDC/NHS的酰胺化反應(yīng)形成穩(wěn)定的酰胺鍵，這樣固定的anti-IL-6抗體既穩(wěn)定不會因沖洗脫落，而且組裝時間短。制備好的anti-IL-6探針電極用BSA作為封閉劑，封閉電極表面的非特異性活性位點。再通過抗原與抗體的特異性免疫結(jié)合捕獲目標IL-6抗原。由于碳納米管具有較好的電容性、導電率和比表面積，結(jié)合金納米粒子的信號放大作用及較好的生物相容性，使得該傳感器在目標抗原濃度極低時也有明顯的信號。電子傳遞電阻的變化值與免疫結(jié)合IL-6抗原的濃度對數(shù)之間成良好的線性關(guān)系(圖4)，這表明了該傳感器成功實現(xiàn)對目標IL-6抗原的檢測，其檢測限可達到I X IO-1Vml，這無疑解決了對IL-6抗原在人體內(nèi)低濃度檢測難題。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明的電化學免疫傳感器具有制備過程簡便、無需標記或夾心處理、成本低廉、檢測靈敏度高等優(yōu)點，可廣泛用于各種免疫分析和檢測，且本發(fā)明制備的電化學免疫傳感器對目標IL-6抗原的檢測限可達到I X 10 17g/ml。


圖I是本發(fā)明的電化學免疫傳感器的制備原理示意圖； 圖2是實施例I中SWCNTs-Au電極的掃描電子顯微鏡(SEM)圖，其中a為SWCNTs的SEM圖；b為在SWCNTs上沉積納米金后得到的SWCNTs-Au雜化電極的SEM圖；c為SWCNTs-Au雜化電極局部放大圖；d為SWCNTs上沉積納米金后得到的SffCNTs-Au雜化電極的能譜圖；圖3是本發(fā)明電化學傳感器檢測不同濃度白細胞介素6(IL_6)的電化學阻抗圖，曲線a為SWCNTs-Au在含5mM[Fe (CN)4] 3_/4_和O. IM KCl的溶液中的電化學阻抗線；曲線b為自組裝巰基乙酸并用EDC/NHS處理后的SWCNTs-Au電極在含5mM[Fe (CN) 4] 條和O. IM KCl的溶液中的阻抗線，曲線c為自組裝anti-IL-6抗體后的電極在含5mM[Fe (CN) 4] 3_/4_和O. IMKCl的溶液中的阻抗線，曲線d為用BSA封閉電極上非特異性吸附位點后的電化學阻抗線，曲線 e-i 分別為與含有 I X l(T17g/ml、I X l(T16g/ml、I X l(T15g/ml、I X l(T14g/ml、I X l(T13g/ml的IL-6抗原發(fā)生免疫反應(yīng)結(jié)合后在含5mM[Fe(CN)4Z]3_/4_和O. IM KCl的溶液中的電化學阻抗線；圖4為電化學傳感器工作的模擬電路圖；圖5是采用本發(fā)明的電化學免疫傳感器分別與不同濃度(lX10_17g/ml、lX10_16g/ml、I X 10_15g/ml、I X 10_14g/ml、I X 10_13g/ml)的IL-6抗原發(fā)生免疫結(jié)合后，電子傳遞電阻的變化值與免疫結(jié)合的IL-6抗原濃度的對數(shù)之間的線性關(guān)系圖，即抗原濃度-阻抗值的工作曲線，根據(jù)工作曲線擬合出計算公式R = 72. 19734+2. 91603*lg[C]，這為今后檢測IL-6抗原提供依據(jù)。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此實施例I(I) SffCNTs-Au雜化電極的制備Fe/Mo 納米粒子的制備參見 Chem. Mater. 2001，13，1008-1014，本發(fā)明所用 Fe/Mo納米粒子的Fe/Mo物質(zhì)的量之比為5 I。如圖I所示采用化學氣相沉積(CVD)法，首先將I X Icm硅基片浸入Fe/Mo納米粒子的庚烷溶液(Fe/Mo納米粒子的量以Fe物質(zhì)的量計，5mmol/L)，IOs后取出，晾干，轉(zhuǎn)移至石英管(長80cm，外徑25mm，厚度I. 5mm)中，然后用加熱爐將石英管升溫到1000°C，以乙醇作碳源，以200ml/min流速的氫氣作為碳源的載氣和保護氣，將乙醇蒸汽(碳源)帶入石英管中，1000°C下反應(yīng)15min，在硅基片上獲得單壁碳納米管(SWCNTs)，電鏡掃描圖見圖2中a所示，所述單壁碳納米管為水平平行排列的陣列結(jié)構(gòu)，陣列密度控制在每100 μ M區(qū)間有10 25根單壁碳納米管，每根單壁碳納米管的長度位于500 μ m Imm之間。然后將SWCNTs用銅絲連接作為工作電極，以IOml (ImM)的HAuCl4水溶液為電解液，以Pt片作為對電極，采用電流時間曲線法，調(diào)節(jié)電壓為-O. 5V，用兩電極體系沉積IOs后，關(guān)閉電源，工作電極用超純水淋洗，用洗耳球吹干工作電極表面，得到單壁碳納米管/金納米粒子雜化電極(SWCNTs-Au雜化電極)，電鏡掃描見圖2中的b和c所示，能譜圖見圖2中的d所示。
(2)電化學傳感器的制備將(I)中得到的SWCNTs-Au雜化電極浸泡在Iml的5mM的巰基乙酸水溶液中，在室溫(25°C)條件下浸泡5h進行自組裝，浸泡結(jié)束后，取出用超純水沖洗3次，吹干后，再置于EDC/NHS混合水溶液Iml (所述EDC/NHS混合溶液中，EDC終濃度為400mM，NHS終濃度為IOOmM)中室溫下浸泡lOmin，取出，用水清洗，獲得修飾后的雜化電極，再將修飾后的雜化電極浸泡在Iml的10 μ g/ml的anti-IL-6捕獲抗體的PBS緩沖溶液(pH = 7. 2)中，在室溫條件下浸泡5h進行自組裝，然后用質(zhì)量濃度O. 05%的Tween-20水溶液和pH = 7. 2的PBS緩沖液交替清洗5次，洗去電極表面的非特異性吸附的anti-IL-6捕獲抗體，再用超純水沖洗5次吹干后，獲得結(jié)合捕獲抗體的雜化電極。最后將上述結(jié)合捕獲抗體的雜化電極置于質(zhì)量濃度2%的牛血清蛋白(BSA)的PBS緩沖溶液(pH = 7. 2)中，室溫下浸泡Ih封閉電極表面的活性位點，取出，用質(zhì)量濃度O. 05%的Tween-20水溶液和pH = 7. 2的PBS緩沖液5次沖洗后，獲得所述電化學傳感器，放在4°C條件下備用。將上述獲得的SWCNTs-Au雜化電極(圖3中的a所示)、修飾后的雜化電極(圖3中的b所示)、結(jié)合捕獲抗體的雜化電極(圖3中的c所示)、電化學傳感器(圖3中的d所示)分別作為工作電極，以鉬絲為對電極，以Ag/AgCl電極作參比電極，然后在電化學工作站(Autolab PGSTAT302)中進行電化學阻抗實驗，接通電路，控制電壓O. 17V，頻率IOOmHz 10kHz，得電化學交流阻抗曲線如圖3所示，電路擬合后記錄各自的電子傳遞阻抗，工作模擬電路圖如圖4所示。圖3(a，b，c，d)結(jié)果所示，在SWCNTs-Au雜化電極上修飾EDC和NHS，以及捕獲抗體之后的阻抗值增大，證明了在SWCNTs-Au雜化電極上已成功修飾相應(yīng)的物種。(3)IL_6抗原的檢測將上述所得的電化學傳感器浸泡在濃度為I X 10_17g/ml的IL-6抗原的PBS緩沖溶液(pH = 7. 2)中，在37°C下免疫結(jié)合30min，取出，用質(zhì)量濃度O. 05%的Tween-20水溶液和pH = 7. 2的PBS緩沖液交替沖洗5次后，再用超純水沖洗，洗去非特異性免疫吸附在電極表面的IL-6抗原,獲得結(jié)合抗原的電化學傳感器。把上述制作好的結(jié)合抗原的電化學傳感器浸入鐵氰化鉀和氯化鉀混合溶液的電解液中，所述的鐵氰化鉀終濃度為5mM，氯化鉀終濃度為O. lmM，25°C下浸泡時間為lh。在電化學工作站(Autolab PGSTAT302)中測試，以結(jié)合抗原的電化學傳感器為工作電極，以鉬絲為對電極，以Ag/AgCl電極作參比電極，然后進行電化學阻抗實驗，接通電路，控制電壓O. 17V，頻率IOOmHz 10kHz，得電化學交流阻抗曲線，電路擬合后記錄傳感器的電子傳遞電阻(如圖3中曲線e)，與未結(jié)合IL-6抗原的工作電極所獲得的交流阻抗曲線明顯不同(如圖3中曲線d)，計算其傳遞電阻變化值為21. 9k Ω (以傳遞電阻變化值為縱坐標，以抗原濃度對數(shù)為橫坐標，制作標準曲線，如圖5所示)。實施例2將按實施例I方法獲得的電化學傳感器放入濃度為I X 10_16g/ml的IL_6抗原的PBS緩沖溶液(pH = 7. 2)中，在37°C下免疫結(jié)合30min，其他操作同實施例1，記錄電化學阻抗曲線(如圖3中曲線f)，與未結(jié)合IL-6抗原的工作電極所獲得的交流阻抗曲線明顯不同(如圖3中曲線d)，計算其傳遞電阻變化值為25. 7k Ω (以傳遞電阻變化值為縱坐標，以抗原濃度對數(shù)為橫坐標，制作標準曲線，如圖5所示)。實施例3將按實施例I方法獲得的電化學傳感器放入濃度為I X 10_15g/ml的IL_6抗原的PBS溶液中，在37°C下免疫結(jié)合30min，其他操作同實施例1，記錄電化學阻抗曲線(如圖3中曲線g)，與未結(jié)合IL-6抗原的工作電極所獲得的交流阻抗曲線明顯不同(如圖3中曲線d)，計算其傳遞電阻變化值為28. 9k Ω (以傳遞電阻變化值為縱坐標，以抗原濃度對數(shù)為橫坐標，制作標準曲線，如圖5所示)。實施例4將按實施例I方法獲得電化學傳感器放入濃度為I X 10_14g/ml的IL-6抗原的PBS溶液中，在37°C下免疫結(jié)合30min，其他操作同實施例1，記錄電化學阻抗曲線(如圖3中曲線h)，與未結(jié)合IL-6抗原的工作電極所獲得的交流阻抗曲線明顯不同(如圖3中曲線d)，計算其傳遞電阻變化值為30. 4k Ω (以傳遞電阻變化值為縱坐標，以抗原濃度對數(shù)為橫坐標，制作標準曲線，如圖5所示)。
實施例5將按實施例I方法獲得的電化學傳感器放入濃度為I X 10_13g/ml的IL_6抗原的PBS溶液中，在37°C下免疫結(jié)合30min，其他操作同實施例1，記錄電化學阻抗曲線(如圖3中曲線i)，與未結(jié)合IL-6抗原的工作電極所獲得的交流阻抗曲線明顯不同(如圖3中曲線d)，計算其傳遞電阻變化值為34. IkQ (以傳遞電阻變化值為縱坐標，以抗原濃度對數(shù)為橫坐標，制作標準曲線，如圖5所示)。實施例6將按實施例I方法獲得的電化學傳感器放入濃度為5X 10_17g/ml的IL_6抗原的PBS溶液中，在37°C下免疫結(jié)合30min，其他操作同實施例1，記錄電化學阻抗曲線(如圖3中曲線j)，計算出傳遞電阻變化值為24. 64k Ω，根據(jù)上述實施例I 5獲得的線性關(guān)系公式R = 72. 19734+2. 91603*lg[C] (C為抗原濃度)，可以計算出其濃度為4. 91 X 10_17g/ml，與實際濃度5X10_17g/ml接近，相對誤差為1.8%。實施例7將按實施例I方法獲得的電化學傳感器放入濃度為5X 10_16g/ml的IL_6抗原的PBS溶液中，在37°C下免疫結(jié)合30min，其他操作同實施例1，記錄電化學阻抗曲線(如圖3中曲線k)，計算出傳遞電阻變化值為27. 6kQ,根據(jù)上述實施例I 5獲得的線性關(guān)系公式R = 72. 19734+2. 91603*lg[C] (C為抗原濃度)，可以計算出其濃度為5. 08X 10_16g/ml，與實際濃度5X10_16g/ml接近，相對誤差為1.6%。實施例8將按實施例I方法獲得的電化學傳感器放入濃度為5X 10_14g/ml的IL_6抗原的PBS溶液中，在37°C下免疫結(jié)合30min，其他操作同實施例1，記錄電化學阻抗曲線(如圖3中曲線I)，計算出傳遞電阻變化值為33. 4kQ,根據(jù)上述實施例I 5獲得的線性關(guān)系公 式R= 72. 19734+2. 91603*lg[C] (C為抗原濃度)，可以計算出其濃度為4. 96X 10_16g/ml，與實際濃度5X10_14g/ml接近，相對誤差為O. 8%。
權(quán)利要求
1.一種直接檢測IL-6的電化學免疫傳感器，其特征在于所述傳感器按下述方法制備(I)單壁碳納米管以硅片或石英片為基底，以Fe/Mo納米粒子為催化劑，以乙醇作碳源，以氫氣作為碳源的載氣和保護氣，于石英管中1000°C下反應(yīng)15min，獲得單壁碳納米管；所述Fe/Mo納米粒子中Fe和Mo物質(zhì)的量之比為5 I ； (2)單壁碳納米管/金納米粒子雜化電極將單壁碳納米管用銅絲連接作為工作電極，以鉬作為對電極，以摩爾濃度0. I IOmMHAuCl4水溶液為電解液，在電壓為-0. IV -0. 5V下進行電化學沉積5 50s，獲得單壁碳納米管/金納米粒子雜化電極；(3)單壁碳納米管/金納米粒子雜化電極的修飾將單壁碳納米管/金納米粒子雜化電極浸泡在I IOmM的SHCH2C00H水溶液中，室溫下浸泡3 10h，取出，用水清洗，得清洗后的電極置于EDC/NHS混合水溶液中，室溫下浸泡10 30min，取出用水清洗后，獲得修飾后的單壁碳納米管/金納米粒子雜化電極；所述EDC/NHS混合水溶液為I-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺的混合水溶液；(4)電化學免疫傳感器將步驟(3)獲得的修飾后的單壁碳納米管/金納米粒子雜化電極浸泡在10 100 u g/ml的IL-6捕獲抗體的PBS緩沖液中，室溫下浸泡2 8h，取出，用Tween-20水溶液和PBS緩沖液交替清洗，獲得結(jié)合抗體的雜化電極，然后再將結(jié)合抗體的雜化電極浸泡在質(zhì)量濃度I 5%牛血清蛋白的PBS緩沖液中，室溫下浸泡0. 5 2h進行封閉，取出，用Tween-20水溶液和PBS緩沖液交替清洗，風干，獲得所述的電化學免疫傳感器。
2.如權(quán)利要求I所述的直接檢測IL-6的電化學免疫傳感器，其特征在于步驟(3)所述EDC/NHS混合水溶液為I-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺與水混合，使I-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺終濃度為400mM，N-羥基琥珀酰亞胺終濃度為lOOmM。
3.如權(quán)利要求I所述的直接檢測IL-6的電化學免疫傳感器，其特征在于步驟(4)所述用Tween-20水溶液和PBS緩沖液交替清洗的方法為用質(zhì)量濃度0. 01 0. 05% Tween-20水溶液和PH7. 0 7. 3的PBS緩沖液交替清洗5次，再用蒸餾水清洗5次。
4.一種如權(quán)利要求I所述的直接檢測IL-6抗原的電化學免疫傳感器在檢測IL-6抗原中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4所述的直接檢測IL-6抗原的電化學免疫傳感器在檢測IL-6抗原中的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用包括以下步驟1)將電化學免疫傳感器置于IL-6抗原溶液中，37°C下浸泡0. 5 2h，反應(yīng)結(jié)束后，取出傳感器用質(zhì)量濃度0. 01 0. 05%的Tween-20水溶液和PH7. 0 7. 3的PBS緩沖液交替清洗，獲得結(jié)合抗原的電化學傳感器；2)以步驟I)獲得的結(jié)合抗原的電化學傳感器作為工作電極，以鉬絲為對電極，以Ag/AgCl電極作參比電極，在鐵氰化鉀和氯化鉀混合溶液的電解液中，采用電化學方法檢測電極表面上的電子傳遞電阻。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述IL-6抗原溶液為IX 10_17 I X 10_13g/ml的IL-6抗原的PBS緩沖溶液，所述PBS緩沖溶液pH值為7. 0 7. 3。
7.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述鐵氰化鉀和氯化鉀混合溶液為鐵氰化鉀、氯化鉀和水的混合溶液，所述混合溶液中鐵氰化鉀終濃度為5mM，氯化鉀終濃度為0.ImM0
8.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述電化學方法檢測為在頻率為IOOmHz IOkHz ,電壓為0. 17V的條件下測試電極表面上的電子傳遞電阻。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種直接檢測IL-6的電化學免疫傳感器及應(yīng)用，所述傳感器以單壁碳納米管為基底，將金納米粒子沉積于單壁碳納米管上構(gòu)成單壁碳納米管/金納米粒子雜化電極，雜化電極用巰基乙酸修飾，再在巰基乙酸上組裝IL-6捕獲抗體，再用質(zhì)量濃度1～5％牛血清蛋白的PBS緩沖液封閉，獲得所述電化學免疫傳感器；本發(fā)明的電化學免疫傳感器具有制備過程簡便、無需標記或夾心處理、成本低廉、檢測靈敏度高等優(yōu)點，可廣泛用于各種免疫分析和檢測，且本發(fā)明制備的電化學免疫傳感器對目標IL-6抗原的檢測限可達到1×10-17g/ml。
文檔編號G01N27/327GK102706939SQ20121007496
公開日2012年10月3日 申請日期2012年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月20日
發(fā)明者楊婷, 王舜, 金輝樂, 陳錫安 申請人:溫州大學