專利名稱：一種植物油中植物甾醇的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食用油營養(yǎng)添加劑檢測的技術(shù)領(lǐng)域，具體的涉及ー種植物油中植物甾醇的檢測方法。
背景技術(shù)：
植物油是植物留醇含量較為豐富的食品之一，而其中玉米油中的植物留醇含量較高。近年來，隨著心血管疾病的頻繁發(fā)生，人們的保健意識也隨之增強，植物留醇作為ー種極具營養(yǎng)價值的營養(yǎng)添加劑廣泛用于食品中以降低人體膽固醇。植物留醇對人體具有較強的抗炎作用，具有能夠抑制人體對膽固醇的吸收、促進膽固醇的降解代謝、抑制膽固醇的生 化合成等作用；用于預防治療冠狀動脈粥樣硬化類的心臟病，對治療潰瘍、皮膚鱗癌、宮頸癌等有明顯的療效；可促進傷ロ愈合，使肌肉增生、增強毛細血管循環(huán)；還可作為膽結(jié)石形成的阻止劑?，F(xiàn)有植物留醇的檢測方法主要有酶法、化學特征反應(yīng)鑒定法、薄層層析法、紅外光譜法、氣相色譜法等。其中酶法只能測定總留醇含量，不能檢測各留醇組分分別的含量，這些方法操作過程復雜，成本高，安全性能差。應(yīng)用化學特征反應(yīng)鑒定法、薄層層析法、紅外光譜法等普遍存在的缺點是鑒定能力低，對樣品的純度要求高，有的甚至安全性很差。應(yīng)用氣相色譜法檢測因使用高壓以及可燃性氣體，從而對其的安全性要求較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對上述存在的缺陷而提供ー種植物油中植物留醇的檢測方法，該方法操作簡單，精確度、安全性高，經(jīng)濟實恵。本發(fā)明的技術(shù)方案為ー種植物油中植物留醇的檢測方法，其步驟如下(1)樣品的處理首先稱取O. Ig Ig樣品放于皂化瓶中，然后在皂化瓶中加入30mL 50mL質(zhì)量分數(shù)為60%的KOH水溶液和70mL IOOmL的無水こ醇(分析純)，搖勻，最后加入3 4顆沸石；(2)樣品的皂化待步驟(I)完成后，將皂化瓶接于回流冷凝管上，在溫度為90°C 100°C的條件下進行皂化，皂化時間為2h 3h ;(3)提取皂化物待步驟(2)皂化完成后，用30mL 50mL的無水こ醚(分析純)提取劑提取皂化瓶中與沸石上的皂化物，將提取液轉(zhuǎn)入分液漏斗I中，靜置待提取液分層后上層液體留于分液漏斗I中，將下層液體移入分液漏斗II中，然后在分液漏斗II中加入無水こ醚(分析純)進行反復提取3 4次，靜置分層后將分液漏斗II中的上層液體與分液漏斗I的上層液體合并，得到最終的こ醚提取液；(4)乙醚提取液的處理用30 mL 50mL質(zhì)量分數(shù)為3%的NaCL水溶液反復清洗步驟(3)所得的こ醚提取液，振蕩分層，棄去下層液體，重復清洗直到棄去的下層液體呈中性，得到的上層液體即為所需提取物；(5)提取物的處理將步驟(4)中所得的提取物通過盛有5g無水硫酸鈉的過濾器進行過濾，將所得的濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器的圓底蒸發(fā)瓶中，然后將圓底蒸發(fā)瓶連接蒸發(fā)儀器進行提取劑無水こ醚的蒸發(fā)，待無水こ醚完全蒸發(fā)后，得到所需植物甾醇，取下圓底蒸發(fā)瓶用純乙醇多次清洗溶解圓底蒸發(fā)瓶中的植物甾醇，然后轉(zhuǎn)入到IOOmL容量瓶中用純乙醇定容,最后經(jīng)0. 45um的微孔濾膜過濾于25mL容量瓶中，試樣的制備完成；
(6)試樣的測試用進樣針吸取步驟(5)所得的試樣18 uL 22uL，在進樣溫度為40°C 50°C,波長為200 nm 250nm,流速為0. 5 mL/min I. 2mL/min的條件下米用高效液相色譜儀得到色譜圖，然后利用外標法將色譜圖中各留醇的峰面積與相對應(yīng)留醇的標準曲線對照得出試樣中各甾醇的濃度。所述步驟(6)中高效液相色譜外標法的標準曲線制備步驟如下用進樣針分別吸取濃度為 lmg/ml、0. 8mg/ml、0. 6mg/ml、0.4mg/ml、0.2 mg/ml>0 mg/ml 的對照品溶液 18uL 22uL，依照步驟(6)所選定的進樣條件進樣溫度40°C 50°C，波長200 nm 250nm，流速0. 5 mL/min I. 2mL/min,測定各濃度下的峰面積值，以進樣溶液濃度為縱坐標,相應(yīng)的峰面積為橫坐標，繪制得標準曲線。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明的檢測方法在提取皂化物時所采用的提取劑為無水乙醚(分析純)，無水乙醚的毒性低，價格低廉，氣味比較溫和，對人體沒有太大傷害，并且根據(jù)單一變量原則，在本發(fā)明所述的檢測步驟及檢測條件下分別采用正己烷、丙酮、乙醚三種不同的提取劑進行對比實驗，得出無水乙醚對留醇的提取效果好，雜質(zhì)少，使得后續(xù)試樣檢測所出的色譜圖雜質(zhì)峰少，各留醇的峰面積大，便于進一步的分析。
下面通過三例實驗對比進行詳細說明。實驗一 (I)樣品的處理首先稱取Ig樣品放于皂化瓶中，然后在皂化瓶中加入30mL質(zhì)量分數(shù)為60%的KOH水溶液和70mL的無水乙醇(分析純)，搖勻，最后加入3 4顆沸石；(2)樣品的皂化待步驟(I)完成后，將皂化瓶接于回流冷凝管上，在溫度為95°C的條件下進行皂化，皂化時間為2. 5h ；(3)提取皂化物待步驟(2)皂化完成后，用50mL的正己烷提取劑提取皂化瓶中與沸石上的皂化物，將提取液轉(zhuǎn)入分液漏斗I中，靜置待提取液分層后上層液體留于分液漏斗I中，將下層液體移入分液漏斗II中，然后在分液漏斗II中加入正己烷進行反復提取3 4次，靜置分層后將分液漏斗II中的上層液體與分液漏斗I的上層液體合并，得到最終的正己烷提取液；(4)正己烷提取液的處理用30 mL 50mL質(zhì)量分數(shù)為3%的NaCL水溶液反復清洗步驟(3)所得的正己烷提取液，振蕩分層，棄去下層液體，重復清洗直到棄去的下層液體呈中性，得到的上層液體即為所需提取物；(5)提取物的處理將步驟(4)中所得的提取物通過盛有5g無水硫酸鈉的過濾器進行過濾，將所得的濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器的圓底蒸發(fā)瓶中，然后將圓底蒸發(fā)瓶連接蒸發(fā)儀器進行提取劑正己烷的蒸發(fā)，待正己烷完全蒸發(fā)后，得到所需植物留醇，取下圓底蒸發(fā)瓶用純乙醇多次清洗溶解圓底蒸發(fā)瓶中的植物甾醇，然后轉(zhuǎn)入到IOOmL容量瓶中用純乙醇定容，最后經(jīng)0. 45um的微孔濾膜過濾于25mL容量瓶中，試樣的制備完成；(6)試樣的測試用進樣針吸取步驟(5)所得的試樣20uL，在進樣溫度為45°C，波長為210nm，流速為I mL/min的條件下利用高效液相色譜儀所得的最終色譜圖見圖I。實驗二 (I)樣品的處理首先稱取Ig樣品放于皂化瓶中，然后在皂化瓶中加入 30mL質(zhì)量分數(shù)為60%的KOH水溶液和70mL的無水乙醇(分析純)，搖勻，最后加入3 4顆沸石；(2)樣品的皂化待步驟(I)完成后，將皂化瓶接于回流冷凝管上，在溫度為95°C的條件下進行皂化，皂化時間為2. 5h ；(3)提取皂化物待步驟(2)皂化完成后，用50mL的丙酮提取劑提取皂化瓶中與沸石上的皂化物，將提取液轉(zhuǎn)入分液漏斗I中，靜置待提取液分層后上層液體留于分液漏斗I中，將下層液體移入分液漏斗II中，然后在分液漏斗II中加入丙酮進行反復提取3 4次，靜置分層后將分液漏斗II中的上層液體與分液漏斗I的上層液體合并，得到最終的丙酮提取液；(4)丙酮提取液的處理用30 mL 50mL質(zhì)量分數(shù)為3%的NaCL水溶液反復清洗步驟(3)所得的丙酮提取液，振蕩分層，棄去下層液體，重復清洗直到棄去的下層液體呈中性，得到的上層液體即為所需提取物；(5)提取物的處理將步驟
(4)中所得的提取物通過盛有5g無水硫酸鈉的過濾器進行過濾，將所得的濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器的圓底蒸發(fā)瓶中，然后將圓底蒸發(fā)瓶連接蒸發(fā)儀器進行提取劑丙酮的蒸發(fā)，待丙酮完全蒸發(fā)后，得到所需植物留醇，取下圓底蒸發(fā)瓶用純乙醇多次清洗溶解圓底蒸發(fā)瓶中的植物甾醇，然后轉(zhuǎn)入到IOOmL容量瓶中用純乙醇定容，最后經(jīng)0. 45um的微孔濾膜過濾于25mL容量瓶中，試樣的制備完成；(6)試樣的測試用進樣針吸取步驟(5)所得的試樣20uL，在進樣溫度為45°C，波長為210nm，流速為I mL/min的條件下利用高效液相色譜儀所得的最終色譜圖見圖2。實驗三(I)樣品的處理首先稱取Ig樣品放于皂化瓶中，然后在皂化瓶中加入 30mL質(zhì)量分數(shù)為60%的KOH水溶液和70mL的無水乙醇(分析純)，搖勻，最后加入3 4顆沸石；(2)樣品的皂化待步驟(I)完成后，將皂化瓶接于回流冷凝管上，在溫度為95°C的條件下進行皂化，皂化時間為2. 5h ；(3)提取皂化物待步驟(2)皂化完成后，用50mL的無水乙醚(分析純)提取皂化瓶中與沸石上的皂化物，將提取液轉(zhuǎn)入分液漏斗I中，靜置待提取液分層后上層液體留于分液漏斗I中，將下層液體移入分液漏斗II中，然后在分液漏斗II中加入無水乙醚進行反復提取3 4次，靜置分層后將分液漏斗II中的上層液體與分液漏斗I的上層液體合并，得到最終的乙醚提取液；(4)乙醚提取液的處理用30 mL 50mL質(zhì)量分數(shù)為3%的NaCL水溶液反復清洗步驟(3)所得的乙醚提取液，振蕩分層，棄去下層液體，重復清洗直到棄去的下層液體呈中性，得到的上層液體即為所需提取物；(5)提取物的處理將步驟(4)中所得的提取物通過盛有5g無水硫酸鈉的過濾器進行過濾，將所得的濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器的圓底蒸發(fā)瓶中，然后將圓底蒸發(fā)瓶連接蒸發(fā)儀器進行提取劑無水乙醚的蒸發(fā)，待無水乙醚完全蒸發(fā)后，得到所需植物留醇，取下圓底蒸發(fā)瓶用純乙醇多次清洗溶解圓底蒸發(fā)瓶中的植物甾醇，然后轉(zhuǎn)入到IOOmL容量瓶中用純乙醇定容,最后經(jīng)0. 45um的微孔濾膜過濾于25mL容量瓶中，試樣的制備完成；(6)試樣的測試用進樣針吸取步驟(5)所得的試樣20uL，在進樣溫度為45°C，波長為210nm，流速為I mL/min的條件下利用高效液相色譜儀所得的最終色譜圖見圖3。由上述實驗一、實驗二、實驗三以及相應(yīng)的圖I、圖2、圖3分析可得無水乙醚對甾醇的提取效果好，雜質(zhì)少，使得后續(xù)試樣檢測所出的色譜圖雜質(zhì)峰少，各留醇的峰面積大，便于進一步的分析。本發(fā)明所述檢測方法中在對提取液進行清洗時所使用的是質(zhì)量分數(shù)為3%的NaCL水溶液，在溫度較低的情況下提取液的乙醚層和水層很難分離，若用去離子水清洗時分層效果不明顯而且極易乳化，從而增加了清洗時間，造成植物留醇的流失，而NaCL是強電解質(zhì)，可以破壞膠體溶液的雙電子層結(jié)構(gòu)，使之聚合，所以用一定濃度的NaCL水溶液可以將提取液中乙醚層里的水清洗出來，縮短清洗時間，減少植物留醇的流失。本發(fā)明所述的檢測方法操作簡單，精確度、安全性高，經(jīng)濟實惠，該檢測方法在較溫和的檢測條件下進行，不會破壞樣品的性質(zhì)。


圖I為采用正己烷作為提取劑進行實驗所得色譜圖。其中36為菜籽甾醇，37為豆甾醇，38為菜油甾醇，41為β谷甾醇。圖2為采用丙酮作為提取劑進行實驗所得色譜圖。其中29為菜籽甾醇，30為豆甾醇，31為菜油甾醇，34為β谷甾醇。圖3為采用こ醚作為提取劑進行實驗所得色譜圖。其中19為菜籽甾醇，20為豆甾醇，21為菜油甾醇，24為β谷甾醇。 圖4為豆甾醇標準曲線。圖5菜油甾醇標準曲線。 圖6 β谷甾醇標準曲線。圖7菜籽甾醇標準曲線。
具體實施例方式下面通過實施例一對本發(fā)明進行詳細說明。實施例一
(I)樣品的處理首先稱取Ig樣品放于皂化瓶中，然后在皂化瓶中加入30mL質(zhì)量分數(shù)為60%的KOH水溶液和70mL的無水こ醇(分析純)，搖勻，最后加入3 4顆沸石；(2)樣品的皂化待步驟(I)完成后，將皂化瓶接于回流冷凝管上，在溫度為95°C的條件下進行皂化，皂化時間為2. 5h ；(3)提取皂化物待步驟(2)皂化完成后，用50mL的無水こ醚(分析純)提取皂化瓶中與沸石上的皂化物，將提取液轉(zhuǎn)入分液漏斗I中，靜置待提取液分層后上層液體留于分液漏斗I中，將下層液體移入分液漏斗II中，然后在分液漏斗II中加入無水こ醚進行反復提取3 4次，靜置分層后將分液漏斗II中的上層液體與分液漏斗I的上層液體合并，得到最終的こ醚提取液；(4)こ醚提取液的處理用30 mL 50mL質(zhì)量分數(shù)為3%的NaCL水溶液反復清洗步驟(3)所得的こ醚提取液，振蕩分層，棄去下層液體，重復清洗直到棄去的下層液體呈中性，得到的上層液體即為所需提取物；(5)提取物的處理將步驟
(4)中所得的提取物通過盛有5g無水硫酸鈉的過濾器進行過濾，將所得的濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器的圓底蒸發(fā)瓶中，然后將圓底蒸發(fā)瓶連接蒸發(fā)儀器進行提取劑無水こ醚的蒸發(fā)，待無水こ醚完全蒸發(fā)后，得到所需植物留醇，取下圓底蒸發(fā)瓶用純こ醇多次清洗溶解圓底蒸發(fā)瓶中的植物甾醇，然后轉(zhuǎn)入到IOOmL容量瓶中用純こ醇定容，最后經(jīng)O. 45um的微孔濾膜過濾于25mL容量瓶中，試樣的制備完成；(6)試樣的測試用進樣針吸取步驟(5)所得的試樣20uL，在進樣溫度為45°C，波長為210nm，流速為I mL/min的條件下采用高效液相色譜儀得到色譜圖，然后利用外標法將色譜圖中各留醇的峰面積與相對應(yīng)留醇的標準曲線對照得出試樣中各留醇的濃度，高效液相色譜儀所得色譜圖見圖3。所述步驟(6)中高效液相色譜外標法的標準曲線制備步驟如下用進樣針分別吸取濃度為 lmg/ml、0. 8mg/ml、0. 6mg/ml、O. 4mg/ml>0. 2 mg/ml>0 mg/ml 的對照品溶液20uL,依照步驟(6)所選定的進樣條件進樣溫度50°C,波長210nm,流速I. 2mL/min,測定各濃度下的峰面積值，以進樣溶液濃度為縱坐標，相應(yīng)的峰面積為橫坐標，繪制得標準曲線。豆甾醇、菜油甾醇、β谷甾醇、菜籽甾醇的標準曲線如下。
①豆甾醇標準曲線繪制見表格I、圖4。表格I :豆甾醇對照品溶液進樣數(shù)據(jù)。
權(quán)利要求
1.一種植物油中植物留醇的檢測方法，其步驟如下(1)樣品的處理首先稱取0.Ig Ig樣品放于皂化瓶中，然后在皂化瓶中加入30mL 50mL質(zhì)量分數(shù)為60%的KOH水溶液和70mL IOOmL的無水乙醇(分析純),搖勻,最后加入3 4顆沸石；(2)樣品的阜化待步驟(I)完成后，將皂化瓶接于回流冷凝管上，在溫度為90°C 100°C的條件下進行皂化，皂化時間為2h 3h ；(3)提取皂化物待步驟(2)皂化完成后，用30mL 50mL的無水乙醚(分析純)提取劑提取皂化瓶中與沸石上的皂化物，將提取液轉(zhuǎn)入分液漏斗I中，靜置待提取液分層后上層液體留于分液漏斗I中，將下層液體移入分液漏斗II中，然后在分液漏斗II中加入無水乙醚(分析純)進行反復提取3 4次，靜置分層后將分液漏斗II中的上層液體與分液漏斗I的上層液體合并，得到最終的乙醚提取液；(4)乙醚提取液的處理用30 mL 50mL質(zhì)量分數(shù)為3%的NaCL水溶液反復清洗步驟(3)所得的乙醚提取液，振蕩分層，棄去下層液體，重復清洗直到棄去的下層液體呈中性，得到的上層液體即為所需提取物；(5)提取物的處理將步驟(4)中所得的提取物通過盛有5g無水硫酸鈉的過濾器進行過濾，將所得的濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器的圓底蒸發(fā)瓶中，然后將圓底蒸發(fā)瓶連接蒸發(fā)儀器進行提取劑無水乙醚的蒸發(fā)，待無水乙醚完全蒸發(fā)后，得到所需植物留醇，取下圓底蒸發(fā)瓶用純乙醇多次清洗溶解圓底蒸發(fā)瓶中的植物甾醇，然后轉(zhuǎn)入到IOOmL容量瓶中用純乙醇定容,最后經(jīng)0. 45um的微孔濾膜過濾于25mL容量瓶中，試樣的制備完成；(6)試樣的測試用進樣針吸取步驟(5)所得的試樣18 uL 22uL，在進樣溫度為40°C 50°C，波長為200 nm 250nm,流速為0. 5 mL/min I. 2mL/min的條件下采用高效液相色譜儀得到色譜圖,然后利用外標法將色譜圖中各留醇的峰面積與相對應(yīng)留醇的標準曲線對照得出試樣中各甾醇的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的植物油中植物留醇的檢測方法，其特征在于，所述步驟(6)中高效液相色譜外標法的標準曲線制備步驟如下用進樣針分別吸取濃度為lmg/ml、0. 8mg/ml、0.6mg/ml、0.4mg/ml、0.2 mg/ml>0 mg/ml 的對照品溶液 18 uL 22uL,依照步驟(6)所選定的進樣條件進樣溫度40°C 50°C,波長200 nm 250nm,流速0. 5 mL/min I. 2mL/min，測定各濃度下的峰面積值，以進樣溶液濃度為縱坐標，相應(yīng)的峰面積為橫坐標，繪制得標準曲線。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種植物甾醇的檢測方法，采用高效液相色譜儀進行檢測，其主要包括以下步驟樣品制備，所述樣品制備包括試樣的皂化、乙醚提取皂化物、水洗乙醚提取物、過濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)溶劑收集濾液、微孔濾膜抽濾并定容；樣品測試包括樣品進樣、檢測結(jié)果的分析。本發(fā)明檢測方法樣品制備簡單，成本較低，設(shè)備條件要求不高，且操作簡潔。
文檔編號G01N30/06GK102636583SQ201210075758
公開日2012年8月15日 申請日期2012年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月21日
發(fā)明者王月華, 王洪堯, 王萍 申請人:山東三星玉米產(chǎn)業(yè)科技有限公司